Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
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Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage de la Faculté de l'Université Carnegie Mellon (YZ) et le prix du directeur des NIH New Innovator Award (DP2 OD025926-01 à YZ).

1. Préparation des réactifs et des solutions stock
<ol><li>
Préparer les composants de la solution de gélification. REMARQUE : Les concentrations de solutions sont administrées en g/mL (w/v pour cent).<ol>
<li>Faire les solutions de stock suivantes : 38 % (w/v) acrylate de sodium (SA), 50 % (w/v) acrylamide (AA), 2 % (w/v) N,N-N-méthylenebisacrylamide (Bis) et 29,2 % (w/v) chlorure de sodium (NaCl). Dissoudre les composés dans de l'eau doublement déionisée (ddH2O). Utiliser les m...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Ici, nous présentons le protocole ExPath16, une variante de proExM5 qui peut être appliquée aux types les plus communs d'échantillons de biopsie clinique utilisés en pathologie, y compris FFPE, H et E souillés, et des spécimens fraîchement congelés sur des lames de verre. La conversion de format, la récupération d'antigène, et l'immunostaining des spécimens suivent les protocoles couramment utilisés qui ne sont pas spécifiques à ExPath. Contrairement au prot...

L'étude de l'organisation moléculaire des tissus dans un contexte tridimensionnel (3D) peut fournir une nouvelle compréhension des fonctions biologiques et du développement de la maladie. Cependant, ces environnements à l'échelle nanométrique sont au-delà des capacités de résolution des microscopes à diffraction conventionnelle limitée (200 à 300 nm), où la distance minimale résolvable, d est définie par d  '/NA. Voici la longueur d'onde de la lumière et NA est l'ouverture numérique (NA) du système d'imagerie. Récemment, la visualisation directe des molécules étiquetées fluorescentes a été rendue possible grâce aux techniques d'imagerie super-résolution nouvellement développées1,2,3, y compris l'épuisement des émissions stimulées (STED), microscopie de localisation photo activée (PALM), microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et microscopie structurée d'éclairage (SIM). Bien que ces techniques d'imagerie aient révolutionné la compréhension de la fonction biologique à l'échelle nanométrique, dans la pratique, elles reposent souvent sur des équipements coûteux et/ou spécialisés et des étapes de traitement d'image, peuvent avoir plus peu de temps d'acquisition que l'imagerie optique conventionnelle, nécessitent des fluorophores ayant des caractéristiques spécifiques (comme la capacité de commutation de photo et/ou une photostabilité élevée). En outre, il reste un défi d'effectuer l'imagerie 3D super-résolution sur des spécimens de tissus.
La microscopie d'expansion (ExM), introduite pour la première fois en 20154, fournit un autre moyen d'imagerie des caractéristiques à l'échelle nanométrique (70 nm) en élargissant physiquement les échantillons conservés incorporés dans un hydrogel polyélectrolyte enflé. Ici, les biomolécules clés et/ou les étiquettes sont ancrées in situ à un réseau de polymères qui peut être isotopiquement étendu après traitement chimique. Parce que l'expansion physique augmente la résolution effective totale, les molécules d'intérêt peuvent alors être résolues en utilisant des systèmes d'imagerie conventionnels à diffraction limitée. Depuis la publication du protocole original, où les étiquettes fluorescentes synthétisées personnalisées ont été ancrées au réseau de polymères4, de nouvelles stratégies ont été utilisées pour ancrer directement les protéines (rétention de protéines ExM, ou proExM)5, 6,7,8,9 et RNA9,10,11,12 à l'hydrogel, et augmenter le grossissement physique par itératif expansion13 ou l'adaptation de la chimie gel8,14,15.
Ici, nous présentons une version adaptée de proExM, appelé pathologie d'expansion (ExPath)16, qui a été optimisé pour les formats de pathologie clinique. Le protocole convertit les échantillons cliniques, y compris les échantillons de paraffine fixe synéral fixe s'est métastatique (FFPE), l'hématoxylin et l'éosine (H-E) tachés, et les échantillons de tissus humains fraîchement congelés montés sur des lames de verre, en un état compatible avec LM. Les protéines sont ensuite ancrées à l'hydrogel et l'homogénéisation mécanique est effectuée (Figure 1)16. Avec une expansion linéaire 4 fois des échantillons, des images multicolores de super-résolution (70 nm) peuvent être obtenues à l'aide d'un microscope confocal conventionnel ayant seulement une résolution de 300 nm et peuvent également être combinés avec d'autres techniques d'imagerie de super-résolution.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

Dans la pathologie moderne, la microscopie optique joue un rôle important dans le diagnostic de la maladie en révélant des structures microscopiques de spécimens cliniques. Cependant, la limite fondamentale de diffraction physique empêche l'interrogation de l'anatomie à l'échelle nanométrique et les changements pathologiques subtils lors de l'utilisation d'approches conventionnelles d'imagerie optique. Ici, nous décrivons un protocole simple et peu coûteux, appelé pathologie d'expansion (ExPath), pour l'imagerie optique à l'échelle nanométrique des types communs de spécimens cliniques de tissu primaire, y compris le tissu incorporé de paraffine fixe-congelée ou formalin-fixe (FFPE) Sections. Cette méthode contourne la limite de diffraction optique en transformant chimiquement les échantillons de tissus en hybride tissu-hydrogel et en les élargissant physiquement isotropically à travers de multiples échelles dans l'eau pure. En raison de l'expansion, les molécules précédemment insolubles sont séparées et peuvent donc être observées à l'aide d'un microscope optique conventionnel.

Si le protocole a été réalisé avec succès (figure 1), les échantillons apparaîtront comme un gel plat et transparent après homogénéisation mécanique (Figure 3A) et peuvent se dilater par un facteur de 3 à 4,5x dans l'eau (Figure 3B), fournissant une résolution efficace de 70 nm selon le facteur d'expansion final et le système d'imagerie utilisé5,<sup...

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Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

La formation image à l'échelle nanométrique d'échantillons de tissus cliniques peut améliorer la compréhension de la pathogénie de la maladie. La pathologie d'expansion (ExPath) est une version de la microscopie d'expansion (ExM), modifiée pour la compatibilité avec les échantillons cliniques standard de tissu, pour explorer la configuration nanométrique des biomolécules utilisant des microscopes limités de diffraction conventionnelle.

Imagerie nanoscopique des sections de tissus humains par l'expansion physique et isotropique

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Nous présentons la pathologie d’expansion, ou ExPath pour faire court, une mesure à faible coût pour l’image biomolécule d’intérêt dans les sections cliniques standard de tissu, avec la précision nanométrique. ExPath contourne la limite de diffraction de la microscopie lumineuse conventionnelle en infusant chimiquement la section des tissus cliniques avec un hydrogel habitable à l’eau, puis en élargissant physiquement et uniformément les échantillons traités d’une centaine de fois, permettant ainsi aux biomolécules étiquetées fluorescentes précédemment superposées d’être séparées et observées avec un microscope optique conventionnel. ExPath permet aux utilisateurs d’étudier les configurations à l’échelle nanométrique des biomolécules liées à la maladie dans les échantillons de tissus, sans avoir besoin d’investir dans de nouveaux matériels d’imagerie.Ainsi, permettant de nouvelles perspectives de la maladie et favorisant un nouveau diagnostic. Cette méthode peut être appliquée à un large éventail de types de tissus et être utilisée pour fournir un nouvel aperçu de la pathogénie de diverses maladies complexes, telles que le cancer, les maladies du cerveau, les maladies auto-immunes, et d’autres. La démonstration visuelle est importante pour illustrer comment faire les étapes critiques correctement, telles que la construction de la chambre de gelage et la manipulation de l’échantillon gélgélisé avant et après la digestion de Proteinase K.Commencez par convertir le tissu d’intérêt en un format compatible ExPath. Si vous travaillez avec des échantillons cliniques FFPE, placez la diapositive avec l’échantillon dans un tube conique de 50 ml et ajoutez 15 ml de Zylène. Caper le tube et le placer horizontalement sur un shaker orbital vers 60rpm pendant trois minutes.Répéter le lavage avec 15 ml de Zylène. Ensuite, lavez la diapositive dans une série de dilutions d’éthanol, selon les instructions manuscrites. Si vous travaillez avec des glissières permanentes tachées et montées, placez chaque diapositive dans un tube conique de 50 ml, puis couvrez-la de Zylène.Retirer délicatement le bordereau de couverture à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, traiter la diapositive de la même manière que les échantillons cliniques FFPE. Si vous travaillez avec des diapositives de tissu congelé non fixé dans la solution OCT, fixez le tissu en acétone à 20 degrés Celsius pendant dix minutes, puis lavez les échantillons avec la solution 1X PBS trois fois pendant dix minutes par lavage.Si vous traitez des échantillons cliniques préalablement fixes et congelés, laissez les glissières pendant deux minutes à température ambiante pour faire fondre la solution de gré à gré, puis lavez l’échantillon avec 1X PBS trois fois, pendant cinq minutes par lavage. Après conversion de format, effectuer la récupération des antigènes sur tous les échantillons. Chauffer la solution de citrate de 20 millimolaires à 100 degrés Celsius au micro-ondes et placer la glissière dans la solution.Transférez immédiatement le récipient dans une chambre d’incubation et incubez-le à 60 degrés Celsius pendant trente minutes. Pour tacher l’échantillon, utilisez un stylo hydrophobe pour tracer une limite autour de la section tissulaire sur la lame. Placez la lame dans une boîte de Pétri, puis incubez le tissu avec le tampon de blocage pendant une heure à 30 degrés Celsius.Ensuite, incuber les tissus avec la solution d’anticorps primaire pendant au moins trois heures à température ambiante ou 37 degrés Celsius. Après l’incubation, lavez le tissu trois fois avec le tampon bloquant, et incubez-le dans la solution secondaire d’anticorps pendant au moins une heure à la température ambiante, ou 37 degrés Celsius. Répétez les lavages avec le tampon de blocage, puis effectuez l’imagerie fluorescente, à l’aide d’un microscope classique à champ large ou d’un autre système d’imagerie de choix.Préparer la solution d’ancrage selon les instructions manuscrites. Placez les glissières dans une boîte de Pétri de 100 ml, pipet la solution d’ancrage sur le tissu, et les incuber pendant au moins trois heures à température ambiante. Ensuite, préparez la solution de geling selon les directives manuscrites.Retirez l’excès de solution d’ancrage de la section tissulaire et placez la glissière dans la boîte de Pétri. Ajouter une solution de gelage froid frais à l’échantillon et incuber le mélange pendant trente minutes, à quatre degrés Celsius. Pour construire une chambre sur la glissière autour de l’échantillon, créez des espaceurs en coupant finement des morceaux de verre de couverture avec un couteau à diamants.Fixez les entretaires de chaque côté du tissu avec de l’eau et placez soigneusement un couvercle de couverture sur la glissière, en vous assurant d’éviter de piéger les bulles d’air sur le tissu. Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié pendant deux heures. Retirez le couvercle de la chambre de gel en glissant doucement une lame de rasoir sous le coverslip et soulevez-le lentement de la surface du gel.Couper le gel blanc autour du tissu pour minimiser le volume, en s’assurant de couper le gel de façon asymétrique pour suivre l’orientation. Diluer proteinase K un à deux cents dans le tampon de digestion, en s’assurant de préparer suffisamment de solution pour submerger complètement le gel. Ensuite, incuber l’échantillon avec la solution dans un récipient fermé pendant trois heures à 60 degrés Celsius.Si l’échantillon ne se détache pas pendant la digestion, utilisez une lame de rasoir pour l’enlever délicatement. Utilisez un pinceau souple pour transférer l’échantillon en 1X PBS dans un récipient compatible avec le système d’imagerie désiré et suffisamment grand pour accueillir le gel entièrement élargi. Lavez l’échantillon en PBS pendant dix minutes et si désiré restain avec 300 millimolar DAPI.Élargir les échantillons en lavant l’échantillon avec un volume excédentaire d’eau distillée double trois à cinq fois pendant dix minutes par lavage. Ensuite, effectuez l’imagerie par fluorescence. Si ce protocole est exécuté avec succès, les échantillons apparaissent comme un gel plat et transparent après homogénéisation mécanique et peuvent se développer par un facteur de 3 à 4,5 dans l’eau.Un échantillon de rein FFPE de cinq micromètres d’épaisseur a été élargi 4,5 fois, ce qui a donné lieu à une résolution de 63 nanomètres à l’aide d’un objectif de 0,95 NA. Le tissu a ensuite été converti en un format compatible de pathologie d’expansion et taché d’anticorps pour Alpha Actinin 4 et Vimentin, DAPI pour visualiser l’ADN nucléaire, et Wheat Germa Glutenin pour étiqueter les glucides. La microscopie confocale de disque filature a alors été employée pour l’image du spécimen.Le tissu rénal a ensuite été complètement élargi dans l’eau et reproduit. La fissuration, les distorsions et la perte de cibles étiquetées peuvent être le résultat d’un ancrage ou d’une homogénéisation inadéquats. Le tissu normal taché d’hématoxyline et d’éosine de sein a été traité comme échantillon de FFPE, étendu, étiqueté avec DAPI, et imité sur un microscope confocal de disque filature.Des tranches de rein non coupées et congelées ont également été traitées à l’aide de ce protocole. Le tissu a été fixé dans l’acétone froide et taché avec Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI, et glutenin germa de blé. Lors de l’exécution de cette technique, il est important de se rappeler le moment de l’étape de gelation est critique.La gelation prématurée peut causer des distorsions, limiter l’expansion et entraîner la perte de molécules cibles. Après cette procédure, l’imagerie fluorescente peut être effectuée au microscope après la digestion et l’expansion de l’échantillon. ExPath peut être largement appliqué dans les deux pathologies et au-delà.Car il permet aux chercheurs de visualiser des détails subtils dans les échantillons de tissus d’intérêt. Par conséquent, il peut aider les chercheurs à acquérir de nouvelles idées sur la pathogénie des maladies ou des mécanismes des processus biologiques.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
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Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov Luminescence imagerie de Interscapular le tissu adipeux brun

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

IRM Cartographie des cérébrovasculaire Réactivité via gaz Inhalation défis

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Transformée de Fourier à haute définition infrarouge (FT-IR) imagerie spectroscopique des sections de tissus humains à l&#39;amélioration de Pathologie

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Dépôts de tissus humains adipeux brun segmentés automatiquement par tomographie par émission de positons / informatisée et la résonance magnétique images enregistrées

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Une Technique de biopsie du tissu adipeux sous-cutané Abdominal via une méthode Non-diathermie

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

L’échographie 3D : morphométrie rapide et rentable des tissus musculo-squelettiques

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Tout le corps et Quantification régionale d’homme actif brun tissu adipeux à l’aide de 18F-FDG TEP/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Une méthode sans enzyme s'est d'isolement et d'expansion des cellules souches mésenchymales dérivées de l'adipose humaine

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Effacement optique et imagerie du tissu rénal immunolabeled

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...