Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
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Diese Arbeit wurde durch den Faculty Start-up Fund der Carnegie Mellon University (YZ) und den NIH Director es New Innovator Award (DP2 OD025926-01 bis YZ) unterstützt.

1. Herstellung von Lagerreagenzien und Lösungen
<ol><li>
Bereiten Sie Gelierlösungskomponenten vor. HINWEIS: Lösungskonzentrationen werden in g/mL (w/v Prozent) angegeben.<ol>
<li>Herstellung folgender Lagerlösungen: 38% (w/v) Natriumacrylat (SA), 50% (w/v) Acrylamid (AA), 2% (w/v) N,N-Methylenbisacrylamid (Bis) und 29,2% (w/v) Natriumchlorid (NaCl). Lösen Sie die Verbindungen in doppelt entionisiertem Wasser (ddH2O). Verwenden Sie die Beträge in Tabelle 1 als Refer...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Hier stellen wir das ExPath-Protokoll16vor, eine Variante von proExM5, die auf die häufigsten Arten von klinischen Biopsieproben angewendet werden kann, die in der Pathologie verwendet werden, einschließlich FFPE, H&E-Färbung und frisch gefroreneNproben auf Glasdias. Formatkonvertierung, Antigenabruf und Immunostainierung der Proben folgen häufig verwendeten Protokollen, die nicht exPath spezifisch sind. Im Gegensatz zum ursprünglichen proExM-Protokoll<sup class="xref"...

Die Untersuchung der molekularen Organisation von Geweben in einem dreidimensionalen (3D) Kontext kann ein neues Verständnis der biologischen Funktionen und der Krankheitsentwicklung liefern. Diese nanoskaligen Umgebungen liegen jedoch über den Auflösungsfähigkeiten herkömmlicher Beugungsmikroskope (200 bis 300 nm), wobei der minimale lösbare Abstand, d durch d  -/NAdefiniert wird. Hier ist die Wellenlänge des Lichts und NA ist die numerische Blende (NA) des Bildgebungssystems. Kürzlich wurde die direkte Visualisierung fluoreszierend markierter Moleküle durch neu entwickelte hochauflösende Bildgebungstechniken1,2,3, einschließlich stimulierter Emissionserschöpfung (STED), ermöglicht. photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM). Obwohl diese bildgebenden Verfahren das Verständnis der biologischen Funktion im Nanomaßstab revolutioniert haben, verlassen sie sich in der Praxis oft auf teure und/oder spezialisierte Geräte und Bildverarbeitungsschritte, können eine langsamere Erfassungszeit haben, verglichen mit konventionelle optische Bildgebung erfordern Fluorophore mit spezifischen Eigenschaften (z. B. Fotowechselfähigkeit und/oder hohe Photostabilität). Darüber hinaus bleibt es eine Herausforderung, 3D-Superauflösungs-Bildgebung an Gewebeproben durchzuführen.
Die Erweiterungsmikroskopie (ExM), die erstmals 2015 eingeführt wurde4, bietet eine alternative Möglichkeit, nanoskalige Merkmale (<70 nm) zu bildgeben, indem konservierte Proben, die in ein anschwellendes Polyelektrolythydrogel eingebettet sind, physisch erweitert werden. Hier bei einem Polymernetzwerk, das nach der chemischen Verarbeitung isotopisch erweitert werden kann, werden wichtige Biomoleküle und/oder Etiketten vor Ort verankert. Da die physikalische Ausdehnung die effektive Gesamtauflösung erhöht, können Moleküle von Interesse dann mit herkömmlichen Beugungs-begrenzten Bildgebungssystemen gelöst werden. Seit der Veröffentlichung des ursprünglichen Protokolls, bei dem kundenspezifische synthetisierte Fluoreszenzetiketten im Polymernetzwerk4verankert wurden, wurden neue Strategien zur direkten Verankerung von Proteinen (Proteinretention ExM oder proExM)verwendet 5, 6,7,8,9 und RNA9,10,11,12 zum Hydrogel, und erhöhen die physikalische Vergrößerung durch iterative Erweiterung13 oder Anpassung der Gelchemie8,14,15.
Hier stellen wir eine angepasste Version von proExM vor, die als Expansionpathologie (ExPath)16bezeichnet wird und für klinische Pathologieformate optimiert wurde. Das Protokoll wandelt klinische Proben, einschließlich formalinfixierter Paraffin-Embedded (FFPE), Hämatoxylin und Eosin (H&E) gebeizte und frisch gefrorene menschliche Gewebeproben, die auf Glasrutschen montiert sind, in einen mit ExM kompatiblen Zustand um. Proteine werden dann am Hydrogel verankert und die mechanische Homogenisierung durchgeführt (Abbildung 1)16. Mit einer 4-fachlinearen Ausdehnung der Proben können mehrfarbige Superauflösungsbilder (ca. 70 nm) mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop mit nur einer Auflösung von 300 nm erhalten und auch mit anderen hochauflösenden Bildgebungstechniken kombiniert werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

In der modernen Pathologie spielt die optische Mikroskopie eine wichtige Rolle bei der Krankheitsdiagnose, indem sie mikroskopische Strukturen klinischer Proben aufdeckt. Die grundlegende physikalische Beugungsgrenze verhindert jedoch das Verhören von nanoskaliger Anatomie und subtilen pathologischen Veränderungen bei verwendung herkömmlicher optischer Bildgebungsansätze. Hier beschreiben wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll, die sogenannte Expansionspathologie (ExPath), für die nanoskalige optische Bildgebung gängiger Arten klinischer Primärgewebeproben, einschließlich festgefrorener oder formalinfixierter Paraffingewebe (FFPE) Bereichen. Diese Methode umgeht die optische Beugungsgrenze, indem sie die Gewebeproben chemisch in Gewebe-Hydrogel-Hybride umwandelt und sie in reinem Wasser isisonsisch über mehrere Skalen ausdehnt. Durch die Ausdehnung werden bisher unlösbare Moleküle abgetrennt und können somit mit einem herkömmlichen optischen Mikroskop beobachtet werden.

Wenn das Protokoll erfolgreich durchgeführt wurde (Abbildung 1), werden proben nach der mechanischen Homogenisierung als flaches und transparentes Gel angezeigt (Abbildung 3A) und können sich um den Faktor 3 x 4,5x in Wasser ausdehnen (Abbildung 3B), eine effektive Auflösung von 70 nm in Abhängigkeit vom endgültigen Erweiterungsfaktor und dem verwendeten Bildgebungssystem5</su...

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Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Nanoskalige Bildgebung klinischer Gewebeproben kann das Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern. Expansionspathologie (ExPath) ist eine Version der Erweiterungsmikroskopie (ExM), modifiziert für die Kompatibilität mit Standard-Klinischen Gewebeproben, um die nanoskalige Konfiguration von Biomolekülen mit herkömmlichen Beugungsmikroskopen zu untersuchen.

Nanoskopische Bildgebung menschlicher Gewebeabschnitte über physikalische und isotrope Expansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Wir präsentieren Expansionspathologie, kurz ExPath, eine kostengünstige Maßnahme, um Biomoleküle von Interesse in den Standard-Klinikgewebeabschnitten mit nanoskaliger Präzision abzubilden. ExPath umgeht die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie, indem es den klinischen Gewebebereich chemisch mit einem wasserschwellbaren Hydrogel einregt und dann die behandelten Proben physikalisch und gleichmäßig um etwa das Hundertfache ausdehnt, so dass zuvor überlappende fluoreszierende Biomoleküle mit einem herkömmlichen optischen Mikroskop getrennt und beobachtet werden können. ExPath ermöglicht es Benutzern, nanoskalige Konfigurationen von krankheitsbedingten Biomolekülen in Gewebeproben zu untersuchen, ohne in neue bildgebende Hardware investieren zu müssen.So ermöglichen neue Erkenntnisse der Krankheit und fördern neue Diagnosen. Diese Methode kann auf eine breite Palette von Gewebetypen angewendet werden und verwendet werden, um neue Einblicke in die Pathogenese verschiedener komplexer Krankheiten wie Krebs, Gehirnerkrankungen, Autoimmunerkrankungen und andere zu geben. Visuelle Demonstration ist wichtig, um zu veranschaulichen, wie die kritischen Schritte richtig zu tun, wie die Konstruktion der Gelierkammer und die Handhabung der gegelten Probe vor und nach Proteinase K Verdauung.Beginnen Sie, indem Sie das gewebe von Interesse in ein ExPath-kompatibles Format konvertieren. Wenn Sie mit klinischen FFPE-Proben arbeiten, legen Sie das Dia mit der Probe in eine 50ml konische Röhre und fügen Sie 15ml Zylene hinzu. Kappen Sie das Rohr und legen Sie es drei Minuten lang horizontal auf einen Orbital-Shaker bei ca. 60U/min.Wiederholen Sie die Wäsche mit weiteren 15 ml Zylene. Dann waschen Sie die Rutsche in einer Reihe von Ethanol Verdünnungen, nach Manuskript Richtungen. Wenn Sie mit gebeizten und montierten permanenten Dias arbeiten, legen Sie jede Rutsche in ein 50ml konisches Rohr, dann bedecken Sie es mit Zylene.Entfernen Sie den Deckelschlupf vorsichtig mit einer Rasierklinge. Verarbeiten Sie dann den Dia auf die gleiche Weise wie die klinischen FFPE-Proben. Wenn Sie mit unfixierten gefrorenen Gewebedias in OCT-Lösung arbeiten, fixieren Sie das Gewebe in Aceton bei 20 Grad Celsius für zehn Minuten, dann waschen Sie die Proben mit 1X PBS-Lösung dreimal für zehn Minuten pro Wäsche.Wenn Sie zuvor feste und gefrorene klinische Proben verarbeiten, lassen Sie die Dias für zwei Minuten bei Raumtemperatur, um die OTC-Lösung zu schmelzen, und waschen Sie die Probe dann dreimal mit 1X PBS, für fünf Minuten pro Wäsche. Führen Sie nach der Formatkonvertierung den Antigenabruf für alle Samples durch. 20 Millimolar Citrat-Lösung auf 100 Grad Celsius in einer Mikrowelle erhitzen und die Rutsche in die Lösung legen.Den Behälter sofort in eine Inkubationskammer geben und bei 60 Grad Celsius für dreißig Minuten bebrüten. Um die Probe zu färben, verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um eine Grenze um den Gewebeabschnitt auf der Folie zu ziehen. Legen Sie die Rutsche in eine Petrischale, dann inkubieren Sie das Gewebe mit Sperrpuffer für eine Stunde bei 30 Grad Celsius.Dann inkubieren Sie das Gewebe mit der primären Antikörperlösung für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius. Waschen Sie das Gewebe nach der Inkubation dreimal mit einem Sperrpuffer und inbrüteten es in sekundärer Antikörperlösung für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie die Waschungen mit dem Blockierpuffer, und führen Sie dann eine fluoreszierende Bildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeldmikroskop oder einem anderen Bildgebungssystem ihrer Wahl durch.Bereiten Sie die Verankerungslösung gemäß den Manuskriptanweisungen vor. Legen Sie die Dias in eine 100 ml Petrischale, pfeifen Sie die Verankerungslösung über das Gewebe und inkubieren Sie sie mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur. Dann bereiten Geling-Lösung nach Manuskript-Anweisungen.Entfernen Sie überschüssige Verankerungslösung aus dem Gewebeabschnitt und legen Sie die Rutsche wieder in die Petrischale. Fügen Sie der Probe eine frische Kaltgeling-Lösung hinzu und brüten Sie die Mischung dreißig Minuten lang bei vier Grad Celsius an. Um eine Kammer auf der Folie um die Probe zu konstruieren, erstellen Sie Abstandshalter, indem Sie Teile aus Deckglas mit einem Diamantmesser dünn schneiden.Sichern Sie die Abstandshalter auf beiden Seiten des Gewebes mit Wasser und legen Sie vorsichtig einen Deckel deckel über die Rutsche, um sicherzustellen, dass Luftblasen über dem Gewebe nicht gefangen werden. Dann inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung für zwei Stunden. Entfernen Sie den Deckel der Gelungskammer, indem Sie eine Rasierklinge vorsichtig unter den Deckelschieben schieben und langsam von der Geloberfläche heben.Schneiden Sie das leere Gel um das Gewebe, um das Volumen zu minimieren, und stellen Sie sicher, dass das Gel asymmetrisch geschnitten wird, um die Ausrichtung zu verfolgen. Proteinase K ein bis zweihundert im Verdauungspuffer verdünnen, um genügend Lösung vorzubereiten, um das Gel vollständig zu versenken. Dann inkubieren Sie die Probe mit der Lösung in einem geschlossenen Behälter für drei Stunden bei 60 Grad Celsius.Wenn sich die Probe während der Verdauung nicht löst, verwenden Sie eine Rasierklinge, um sie vorsichtig zu entfernen. Verwenden Sie einen weichen Pinsel, um die Probe in 1X PBS in einem Behälter zu übertragen, der mit dem gewünschten Bildgebungssystem kompatibel ist und groß genug ist, um das vollständig erweiterte Gel aufzunehmen. Waschen Sie die Probe in PBS für zehn Minuten und wenn gewünscht, restain es mit 300 Millimolar DAPI.Erweitern Sie die Proben, indem Sie die Probe mit einem überschüssigen Volumen von doppelt destilliertem Wasser drei- bis fünfmal für zehn Minuten pro Wäsche waschen. Führen Sie dann fluoreszenzbildgebungsbilden durch. Wenn dieses Protokoll erfolgreich durchgeführt wird, erscheinen Proben nach der mechanischen Homogenisierung als flaches und transparentes Gel und können sich in Wasser um den Faktor 3 bis 4,5 ausdehnen.Eine fünf Mikrometer dicke FFPE-Nierenprobe wurde 4,5-mal erweitert, was zu einer Auflösung von 63 Nanometern mit einem 0,95 NA-Objektiv führte. Das Gewebe wurde dann in ein Expansionspathologie-kompatibles Format umgewandelt und mit Antikörpern für Alpha Actinin 4 und Vimentin, DAPI zur Visualisierung von Kern-DNA und Weizen-Germa Glutenin zur Kennzeichnung von Kohlenhydraten gefärbt. Die konfokale Mikroskopie der Spinnscheibe wurde dann verwendet, um die Probe abzubilden.Das Nierengewebe wurde dann vollständig in Wasser erweitert und wieder abgebildet. Risse, Verzerrungen und der Verlust von markierten Zielen können das Ergebnis einer unzureichenden Verankerung oder Homogenisierung sein. Hämatoxylin und Eosin gefärbt normales Brustgewebe wurde als FFPE-Probe behandelt, erweitert, mit DAPI beschriftet und auf einem konokaren Mikroskop der Spinnscheibe abgebildet.Mit diesem Protokoll wurden auch unfixierte und gefrorene Nierenscheiben verarbeitet. Das Gewebe wurde in kaltem Aceton fixiert und mit Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI und Weizen Germa Glutenin gefärbt. Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, sich das Timing des Gelationsschritts zu merken.Vorzeitige Gelation kann Verzerrungen verursachen, die Ausdehnung begrenzen und zum Verlust von Zielmolekülen führen. Nach diesem Verfahren kann die fluoreszierende Bildgebung nach der Verdauung und Erweiterung der Probe am Mikroskop durchgeführt werden. ExPath kann sowohl in Pathologien als auch darüber hinaus breit angewendet werden.Da es Forschern ermöglicht, subtile Details in den Gewebeproben von Interesse zu visualisieren. Daher kann es Forschern helfen, neue Erkenntnisse über die Pathogenese von Krankheiten oder Mechanismen biologischer Prozesse zu gewinnen.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Forschung

Medizin

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov Lumineszenz-Imaging von interskapulären braunes Fettgewebe

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI-Abbildung von zerebrovaskuläre Reaktivität über Gas Einatmen Herausforderungen

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektroskopische Bildgebung der menschlichen Gewebeschnitte in Richtung Verbesserung der Pathologie

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Menschen braunes Fettgewebe Depots automatisch durch Positronenemissionstomographie / Computertomographie Segmentierte und Registrierte Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Eine Technik zur subkutanen abdominalen Fettgewebe Biopsie über eine nicht-Diathermie-Methode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D Ultraschall-Bildgebung: schnelle und kostengünstige Morphometrie des Muskel-Skelett-Gewebe

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Ganzen Körper und regionale Quantifizierung der aktiven Menschen braune Fettgewebe mit 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...