Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי קרן הסטארט-up של הפקולטה מאוניברסיטת קרנגי מלון (YZ) ו-NIH החדש של מנהל משנה פרס (DP2 OD025926-01 עד YZ).

1. הכנת ריאגנטים מניות ופתרונות
<ol><li>
הכן רכיבי פתרון. הערה: ריכוזי פתרונות מקבלים g/mL (w/v אחוזים).<ol>
<li>הפוך את פתרונות המניה הבאים: 38% (w/v) נתרן אקריל (SA), 50% (w/v) אקרילאמיד (AA), 2% (w/v) N, N′-מתיונין (Bis), ו 29.2% (w/v) נתרן כלוריד (הנאל). מפזר את התרכובות במים האחרים כפליים (ddH2O). השתמש בסכומים <...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ExPath16, גרסה של proExM5 שניתן להחיל על הסוגים הנפוצים ביותר של דגימות ביופסיה קלינית בשימוש פתולוגיה, כולל ffpe, H & E ויטראז ', ויצורים קפואים טריים על שקופיות זכוכית. המרת עיצוב, שליפת אנטיגן, וכתמים חיסוני של הדגימות לעקוב אחר פרוטוקולים בשימוש...

חקירת הארגון המולקולרי של רקמות בהקשר תלת מימדי (3D) יכול לספק הבנה חדשה של פונקציות ביולוגיות ופיתוח מחלות. עם זאת, סביבות ננומטרי אלה הם מעבר ליכולות הפתרון של עקיפה מוגבלת של מיקרוסקופים קונבנציונאלי (200-300 ננומטר), שם מרחק מינימלי לפתירה, d מוגדר על ידי d α  λ/NA. כאן λ הוא אורך הגל של האור na הוא הפתח המספרי (NA) של מערכת ההדמיה. לאחרונה, הדמיה ישירה של מולקולות בעלי תווית fluorescently התאפשרה על-ידי החדש שפותחו ברזולוציה סופר טכניקות הדמיה1,2,3, כולל ממריצים פליטה מאולצת (ההיסטד), מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-מופעל (PALM), מיקרוסקופ שחזור (סטורם) סטוכסטי, ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM). למרות טכניקות הדמיה אלה יש מהפכה הבנה של תפקוד ביולוגי בקנה המידה, בפועל, הם לעתים קרובות להסתמך על ציוד יקר ו/או מיוחדים ועיבוד התמונה שלבים, יכול להיות זמן הרכישה איטי יותר השוואת ל הדמיה אופטית קונבנציונאלי, דורשים fluorophores עם מאפיינים ספציפיים (כגון יכולת מיתוג תמונה ו/או פוטויציבות גבוהה). בנוסף, הוא נשאר אתגר לבצע 3D ברזולוציה סופר הדמיה על דגימות רקמות.
מיקרוסקופ הרחבה (ExM), הוצג לראשונה בשנת 20154, מספק אמצעי חלופי של תכונות ננו הדמיה (< 70 ננומטר) על ידי הרחבה פיזית דגימות שנשמרו מוטבע בתוך הידרו פוליליטי swellable. כאן, מפתח biomolecules ו/או תוויות מעוגנים באתרו לרשת פולימר שניתן isotopically מורחב לאחר עיבוד כימי. מכיוון שהרחבת הגוף מגבירה את הרזולוציה האפקטיבית הכוללת, ניתן לפתור את מולקולות הריבית באמצעות מערכות הדמיה מוגבלות-עקיפה. מאז הפרסום של הפרוטוקול המקורי, שם תוויות פלורסנט מסונתז מותאם אישית היו מעוגנים לרשת פולימר4, אסטרטגיות חדשות שימשו ישירות עוגן חלבונים (חלבון שימור exm, או proExM)5, 6,7,8,9 ו-RNA9,10,11,12 להידרוג'ל, והגדל את ההגדלה הפיזית באמצעות איטרטיבי התרחבות13 או התאמת הכימיה ג'ל8,14,15.
כאן אנו מציגים גרסה מותאמת של proExM, נקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath)16, אשר כבר אופטימיזציה עבור תבניות פתולוגיה קלינית. הפרוטוקול ממיר דגימות קליניות, כולל פורמאלין קבוע-פרפין-מוטבע (FFPE), המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) ויטראז, וטרי-קפואים רקמות האדם הרכוב על שקופיות זכוכית, למצב תואם ExM. חלבונים מעוגנים אז ההידרוג'ל והומוגון מכני מבוצעת (איור 1)16. עם 4-מקפלים הרחבה ליניארית של דגימות, ברזולוציה ססגוניות (~ 70 nm) תמונות ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד קונבנציונאלי שיש רק ברזולוציה של ~ 300 ננומטר והוא יכול גם להיות משולב עם טכניקות אחרות סופר ברזולוציה הדמיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

בפתולוגיה המודרנית, מיקרוסקופ אופטי ממלא תפקיד חשוב באבחון המחלה על ידי חשיפת מבנים מיקרוסקופיים של דגימות קליניות. עם זאת, מגבלת העקיפה הפיזית הבסיסית מונעת חקירה של אנטומיה ננו-סקאלה ושינויים פתולוגיים עדינים בעת שימוש בגישות הדמיה אופטית קונבנציונאלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וזול, הנקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath), עבור הדמיה של ננו-סולם אופטי של סוגים נפוצים של דגימות הרקמה הראשונית קליני, כולל מוקפאו קבוע או formalin מוטבע הרקמה (FFPE) סעיפים. שיטה זו מרחיבה את מגבלת העקיפה האופטית באמצעות שינוי כימי של דגימות הרקמה לתוך רקמת-הידרוג'ל היברידית והרחבת הפיזית אותם באמצעות סולמות מרובים במים טהורים. בשל התרחבות, מולקולות שאינן פתירה בעבר מופרדות ובכך ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי.

אם הפרוטוקול בוצע בהצלחה (איור 1), דגימות יופיעו כג שטוח ושקוף לאחר המגון מכני הגון (איור 3א) והוא יכול להתרחב בפקטור של 3-4.5 x במים (איור 3ב), מתן רזולוציה אפקטיבית של ~ 70 ננומטר בהתאם לגורם ההתרחבות הסופי ומערכת הדמיה בשימוש<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

ננו הדמיה של דגימות רקמה קלינית יכול לשפר את ההבנה של פתוגנזה מחלה. הרחבת פתולוגיה (ExPath) היא גרסה של התפשטות מיקרוסקופ (Expath), שונה עבור תאימות עם דגימות רקמה קלינית סטנדרטית, כדי לחקור את תצורת הננו-סקאלה של biomolecules באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונאלי עקיפה מוגבלת.

הדמיה nanoscopic של מקטעים רקמות האדם באמצעות הרחבה גופנית איזוטרופית

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

אנו מציגים פתולוגיית הרחבה, או ExPath בקיצור, מדד בעלות נמוכה כדי תמונה biomolecule של עניין בסעיפים רקמה קלינית סטנדרטית, עם דיוק ננומטרי. ExPath עוקף את מגבלת עקיפה של מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי על ידי החדרה כימית של סעיף הרקמה הקלינית עם הידרוג'ל מתנפח מים, ולאחר מכן הרחבת פיזית ושוויונית את הדגימות שטופלו על ידי כמאה פעמים, המאפשר בעבר חופפים biomolecules שכותרתו בעבר להיות מופרדים ונצפים עם מיקרוסקופ אופטי קונבנציונלי. ExPath מאפשר למשתמשים ללמוד תצורות בקנה מידה ננו של biomolecules הקשורות למחלות בדגימות רקמה, ללא צורך להשקיע בחומרת הדמיה חדשה.כך, מתן תובנות חדשות של המחלה ו טיפוח אבחון חדש. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של סוגי רקמות ו לשמש כדי לספק תובנה חדשה על הפתוגנזה של מחלות מורכבות שונות, כגון סרטן, מחלות מוח, מחלות אוטואימוניות, ואחרים. הדגמה חזותית חשובה כדי להמחיש כיצד לעשות את הצעדים הקריטיים כראוי, כגון בניית תא geling וטיפול מדגם gelled לפני ואחרי Proteinase K עיכול.התחל בהמרת רקמת העניין לתבנית תואמת ExPath. אם עובדים עם דגימות קליניות FFPE, למקם את השקופית עם המדגם בצינור חרוט 50 מ"ל ולהוסיף 15 מ"ל של Zylene. מכסים את הצינור ומ מניחים אותו אופקית על שייקר מסלולית בערך 60 סל"ד במשך שלוש דקות.חזור על הכביסה עם עוד 15 מ"ל של Zylene. לאחר מכן לשטוף את המגלשה בסדרה של דילול אתנול, על פי הוראות כתב היד. אם עובדים עם שקופיות קבועות מוכתמות ומוצבות, מניחים כל שקופית בצינור חרוטי של 50 מ"ל, ואז מכסים אותו עם Zylene.הסר בזהירות את החלקת המכסה באמצעות סכין גילוח. לאחר מכן, לעבד את השקופית באותו אופן כמו דגימות קליניות FFPE. אם עובדים עם שקופיות רקמה קפואה לא מפויסות בתתא OCT, לתקן את הרקמה אצטון ב 20 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות עם פתרון PBS 1X שלוש פעמים במשך עשר דקות לכל לשטוף.אם עיבוד דגימות קליניות קבועות וקפואות בעבר, להשאיר את השקופיות במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי להמיס את פתרון OTC, ולאחר מכן לשטוף את המדגם עם 1X PBS שלוש פעמים, במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר המרת תבנית, בצע אחזור אנטיגן על כל הדגימות. מחממים 20 מילימולר פתרון ציטראט ל 100 מעלות צלזיוס במיקרוגל וממקמים את השקופית בתסרון.מעבירים מיד את המיכל לתא דגירה ומדרים אותו ב-60 מעלות צלזיוס למשך שלושים דקות. כדי להכתים את הדגימה, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר גבול סביב קטע הרקמה בשקופית. מניחים את השקופית בצלחת פטרי, ולאחר מכן להחריג את הרקמה עם חיץ חסימה במשך שעה אחת ב 30 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הדגירה את הרקמות עם פתרון הנוגדן העיקרי לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם חיץ חסימה, ו דגירה אותו בתתברית נוגדנים משנית לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר, או 37 מעלות צלזיוס. חזור על השטיפה עם מאגר החסימה ולאחר מכן בצע הדמיה פלואורסצנטית, באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי או מערכת הדמיה אחרת של בחירה.הכינו פתרון עיגון בהתאם להוראות כתב היד. מניחים את השקופיות בצלחת פטרי 100 מ"ל, צינור פתרון עיגון על הרקמה, ו דגירה אותם לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו פתרון ג'ל לפי הוראות כתב היד.הסר פתרון עיגון עודף מסעיף הרקמה והחזר את השקופית בחזרה לצלחת פטרי. מוסיפים לדגימה ג'ל קר טרי ומדגרים את התערובת במשך שלושים דקות, בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבנות תא על המחוון סביב המדגם, ליצור רווחים על ידי חיתוך דק חתיכות של זכוכית כיסוי עם סכין יהלום.אבטחו את המהמרים משני צדי הרקמה במים והצבו בזהירות מכסה כיסוי מעל המגלשה, ודאגו להימנע מלכידת בועות אוויר מעל הרקמה. לאחר מכן, הדגירה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה במשך שעתיים. הסר את המכסה של תא הג'ל על ידי החלקה עדין של סכין גילוח מתחת לכיסוי והרמתו באיטיות מעל משטח הג'ל.חותכים את הג'ל הריק סביב הרקמה כדי למזער את עוצמת הקול, הקפד לחתוך את הג'ל באופן סימטרי כדי לעקוב אחר הכיוון. לדלל Proteinase K אחד עד מאתיים במאגר העיכול, הקפד להכין פתרון מספיק כדי להטביע לחלוטין את הג'ל. לאחר מכן, הדגירה את המדגם עם הפתרון במיכל סגור במשך שלוש שעות ב 60 מעלות צלזיוס.אם הדגימה אינה מתנתתת במהלך העיכול, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר אותה בעדינות. השתמש במברשת צבע רכה כדי להעביר את הדגימה ל- PBS 1X במיכל התואם למערכת ההדמיה הרצויה וגדול מספיק כדי להכיל את הג'ל המורחב במלואו. לשטוף את המדגם PBS במשך עשר דקות ואם הרצוי restain אותו עם DAPI 300 מילימולר.הרחב את הדגימות על ידי שטיפת המדגם עם נפח עודף של מים מזוקקים כפולים שלוש עד חמש פעמים במשך עשר דקות לשטוף. לאחר מכן, בצע הדמיית פלואורסצנטיות. אם פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, דגימות מופיעות כג'ל שטוח ושקוף לאחר הומוגניזציה מכנית והוא יכול להתרחב על ידי גורם של 3 עד 4.5 במים.דגימת כליות FFPE עבה של חמישה מיקרומטר הורחבה פי 4.5, מה שגרם לרזולוציה של 63 ננומטר באמצעות מטרה של 0.95 NA. הרקמה הוסבה אז לפורמט תואם פתולוגיה של הרחבה ומוכתמת בנוגדנים לאלפא אקטין 4 ווימנטין, DAPI כדי לדמיין דנ"א גרעיני, וחיטה ג'רמה גלוטנין לתיוג פחמימות. לאחר מכן נעשה שימוש במיקרוסקופיית קונפוקל של דיסק מסתובב כדי לדמיין את הדגימה.רקמת הכליה הורחבה אז באופן מלא במים ותמונה שוב. פיצוח, עיוותים ואובדן יעדים מסומנים יכולים להיות תוצאה של עיגון לקוי או הומוגניזציה. המטוקסילין ואאוסין מוכתמים רקמת שד נורמלית טופלה כדגימה FFPE, מורחב, שכותרתו עם DAPI, ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקל דיסק מסתובב.פרוסות כליה לא מעובדות וקפואות עובדו גם הן באמצעות פרוטוקול זה. הרקמה תוקנה באצטון קר מוכתם אלפא Actinin 4, וימנטין, DAPI, חיטה Germa גלוטנין. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב לזכור את העיתוי של שלב gelation הוא קריטי.ג'לציה מוקדמת עלולה לגרום לעיוותים, להגביל את ההתפשטות ולגרום לאובדן מולקולות מטרה. בעקבות הליך זה, הדמיה פלואורסצנטי יכול להתבצע על מיקרוסקופ לאחר עיכול והרחבת המדגם. ExPath ניתן ליישם באופן נרחב הן פתולוגיות ומעבר.כפי שהוא מאפשר לחוקרים לדמיין פרטים עדינים בדגימות הרקמה של עניין. לכן, זה עשוי לעזור לחוקרים לקבל תובנות חדשות בפתוגנזה של מחלות או מנגנונים של תהליכים ביולוגיים.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov הארת ההדמיה של רקמות Interscapular בראון שומן

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI מיפוי של כלי הדם במוח Reactivity באמצעות אתגרי משאיפת גז

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

פורייה בהבחנה גבוהה להפוך אינפרא אדום (FT-IR) Spectroscopic הדמיה של סעיפים רקמה אנושיים לשיפור פתולוגיה

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

בסיס מיון רקמה האנושי בראון שומן בדיקה מחולק באופן אוטומטי על ידי פוזיטרון פליטת טומוגרפיה / טומוגרפיה ממוחשבת ורשום תמונות תהודה מגנטית

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

שיטה לביופסיה רקמת השומן התת עורית בטן באמצעות שיטה בלתי-diathermy

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

אולטראסאונד תלת-ממד הדמיה: Morphometry מהירה וחסכונית של רקמת שריר-שלד

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

כל הגוף ואת אזורי כימות של האדם פעיל חום רקמת שומן באמצעות 18F-FDG PET/CT...

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...