Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Faculty Start-up fund della Carnegie Mellon University (Yz) e dal NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD025926-01 a Yz).

1. Preparazione di reagenti e soluzioni di magazzino
<ol><li>
Preparare i componenti della soluzione di gelling. NOTA: le concentrazioni di soluzione sono indicate in g/mL (percentuale w/v).<ol>
<li>Effettuare le seguenti soluzioni di stock: 38% (w/v) acrilato di sodio (SA), 50% (w/v) acrilammide (AA), 2% (w/v) N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), e 29.2% (w/v) cloruro di sodio (NaCl). Sciogliere i composti in acqua doppiamente deionizzata (ddH2O). Utilizzare gli importi della tabe...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Qui, presentiamo il protocollo ExPath16, una variante di proExM5 che può essere applicata ai tipi più comuni di campioni di biopsia clinica utilizzati in patologia, tra cui FFPE, H&E macchiati, e campioni freschi congelati su vetrini di vetro. La conversione del formato, il recupero dell'antigene e l'immunostaining dei campioni seguono protocolli di uso comune che non sono specifici di ExPath. A differenza del protocollo proExM originale9, ExPath s...

Lo studio dell'organizzazione molecolare dei tessuti in un contesto tridimensionale (3D) può fornire una nuova comprensione delle funzioni biologiche e dello sviluppo della malattia. Tuttavia, questi ambienti su nanoscala sono al di là delle capacità di risoluzione dei microscopi tradizionali a diffrazione limitata (200-300 nm), dove la distanza minima risolvibile, d è definita da d /  /NA. Qui è la lunghezza d'onda della luce e NA è l'apertura numerica (NA) del sistema di imaging. Recentemente, la visualizzazione diretta delle molecole fluorescenti etichettate è stata resa possibile dalle tecniche di imaging a super-risoluzione di recente sviluppo1,2,3, compreso l'esaurimento stimolato delle emissioni (STED), microscopia di localizzazione ad attivazione fotofoto (PALM), microscopia da ricostruzione ottica stocastica (STORM) e microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). Sebbene queste tecniche di imaging abbiano rivoluzionato la comprensione della funzione biologica su scala nanometrica, in pratica, spesso si basano su apparecchiature costose e/o specializzate e fasi di elaborazione delle immagini, possono avere tempi di acquisizione più lenti rispetto a l'imaging ottico convenzionale, richiedono fluorofori con caratteristiche specifiche (come la capacità di commutazione fotografica e/o l'elevata fotostabilità). Inoltre, rimane una sfida eseguire l'imaging 3D a super-risoluzione su campioni di tessuto.
La microscopia di espansione (ExM), introdotta per la prima volta nel 20154,fornisce un mezzo alternativo di imaging di funzionalità su nanoscala (<70 nm) espandendo fisicamente campioni conservati incorporati in un idrogel polielettrolitico gonfiabile. Qui, le biomolecole e/o le etichette chiave sono ancorate in situ a una rete polimerica che può essere espansa isotopicamente dopo l'elaborazione chimica. Poiché l'espansione fisica aumenta la risoluzione effettiva totale, le molecole di interesse possono essere risolte utilizzando sistemi di imaging convenzionali con diffrazione limitata. Dalla pubblicazione del protocollo originale, in cui le etichette fluorescenti sintetizzate personalizzate erano ancorate alla rete polimerica4, sono state utilizzate nuove strategie per ancorare direttamente le proteine (Protein retention ExM, o proExM)5, 6,7,8,9 e RNA9,10,11,12 all'idrogel, e aumentare l'ingrandimento fisico attraverso iterativo espansione13 o adattando la chimica del gel8,14,15.
Qui presentiamo una versione adattata di proExM, chiamata patologia di espansione (ExPath)16, che è stata ottimizzata per i formati di patologia clinica. Il protocollo converte campioni clinici, tra cui campioni di tessuto umano fissati in formalina (FFPE), ematossialina ed eosina (H&E) macchiati e campioni di tessuto umano appena congelati montati su vetrini di vetro, in uno stato compatibile con ExM. Le proteine sono poi ancorate all'idrogel e viene eseguita l'omogeneizzazione meccanica (Figura 1)16. Con un'espansione lineare di 4 volte dei campioni, le immagini a super-risoluzione multicolore (70 nm) possono essere ottenute utilizzando un microscopio confocale convenzionale con una risoluzione di soli 300 nm e possono anche essere combinate con altre tecniche di imaging a super-risoluzione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

Nella moderna patologia, la microscopia ottica svolge un ruolo importante nella diagnosi della malattia rivelando strutture microscopiche di campioni clinici. Tuttavia, il limite fondamentale di diffrazione fisica impedisce l'interrogatorio dell'anatomia su nanoscala e dei sottili cambiamenti patologici quando si utilizzano approcci di imaging ottico convenzionali. Qui, descriviamo un protocollo semplice ed economico, chiamato patologia di espansione (ExPath), per l'imaging ottico su nanoscala di tipi comuni di campioni di tessuto primario clinico, inclusi sia tessuto incorporato di paraffina fissa-congelato o formalina (FFPE) Sezioni. Questo metodo aggira il limite di diffrazione ottica trasformando chimicamente i campioni di tessuto in ibrido di idrogel tissutale e espandendoli fisicamente isoquinamente su più scale in acqua pura. A causa dell'espansione, le molecole precedentemente irrisolvibili sono separate e quindi possono essere osservate utilizzando un microscopio ottico convenzionale.

Se il protocollo è stato eseguito con successo (Figura 1), i campioni appariranno come gel piatto e trasparente dopo l'omogeneizzazione meccanica (Figura 3A) e potranno espandersi di un fattore di 3-4,5x in acqua (Figura 3B), fornendo una risoluzione efficace di 70 nm a seconda del fattore di espansione finale e del sistema di imaging utilizzato5,<sup class="xref"...

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Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

L'imaging su nanoscala di campioni di tessuto clinico può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. La patologia di espansione (ExPath) è una versione di microscopia di espansione (ExM), modificata per la compatibilità con campioni di tessuto clinico standard, per esplorare la configurazione su nanoscala delle biomolecole utilizzando microscopi tradizionali a diffrazione limitata.

Imaging nanoscopico delle sezioni dei tessuti umani attraverso l'espansione fisica e isotropica

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Presentiamo la patologia di espansione, o ExPath in breve, una misura a basso costo per l'immagine di biomolecole di interesse nelle sezioni di tessuto clinico standard, con precisione su scala nanometrica. ExPath aggira il limite di diffrazione della microscopia ottica convenzionale infondendo chimicamente la sezione del tessuto clinico con un idrogel gonfiabile ad acqua, quindi espandendo fisicamente e uniformemente i campioni trattati di circa un centinaio di volte, consentendo di separare e osservare biomolecole precedentemente sovrapposte etichettate fluorescentmente con un microscopio ottico convenzionale. ExPath consente agli utenti di studiare configurazioni su scala nanometrica di biomolecole correlate alle malattie in campioni di tessuto, senza dover investire in nuovi hardware di imaging.Pertanto, consentendo nuove intuizioni della malattia e promuovendo nuove diagnosi. Questo metodo può essere applicato a una vasta gamma di tipi di tessuti ed essere utilizzato per fornire nuove informazioni sulla patogenesi di varie malattie complesse, come il cancro, le malattie cerebrali, le malattie autoimmuni e altre. La dimostrazione visiva è importante per illustrare come eseguire correttamente i passaggi critici, come la costruzione della camera di gelatura e la manipolazione del campione gelato prima e dopo la digestione proteinasi K.Iniziare convertendo il tessuto di interesse in un formato compatibile con ExPath. Se si lavora con campioni clinici FFPE, posizionare lo scivolo con il campione in un tubo conico da 50 ml e aggiungere 15 ml di Zylene. Cappuccio il tubo e posizionarlo orizzontalmente su uno shaker orbitale a circa 60 giri/min per tre minuti.Ripetere il lavaggio con altri 15 ml di Zylene. Quindi lavare lo scivolo in una serie di diluizioni di etanolo, secondo le indicazioni manoscritte. Se si lavora con diapositive permanenti macchiate e montate, posizionare ogni diapositiva in un tubo conico da 50 ml, quindi coprirlo con Zylene.Rimuovere con cura il coperchio scivolare con una lama di rasoio. Quindi, elaborare la diapositiva allo stesso modo dei campioni clinici FFPE. Se si lavora con vetrini di tessuto congelato non fissi in soluzione OCT, fissare il tessuto in acetone a 20 gradi Celsius per dieci minuti, quindi lavare i campioni con soluzione 1X PBS tre volte per dieci minuti per lavaggio.Se si elaborano campioni clinici precedentemente fissati e congelati, lasciare le diapositive per due minuti a temperatura ambiente per sciogliere la soluzione OTC, quindi lavare il campione con 1X PBS tre volte, per cinque minuti per lavaggio. Dopo la conversione del formato, eseguire il recupero dell'antigene su tutti i campioni. Riscaldare la soluzione di citrato millimolare a 100 gradi Celsius in un forno a microonde e posizionare lo scivolo nella soluzione.Trasferire immediatamente il contenitore in una camera di incubazione e incubarlo a 60 gradi Celsius per trenta minuti. Per macchiare il campione, utilizzare una penna idrofobica per disegnare un limite intorno alla sezione tissutale sullo scivolo. Posizionare lo scivolo in una piastra di Petri, quindi incubare il tessuto con tampone di blocco per un'ora a 30 gradi Celsius.Quindi, incubare i tessuti con la soluzione di anticorpi primari per almeno tre ore a temperatura ambiente o 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare il tessuto tre volte con tampone di blocco e incubarlo in soluzione anticorpale secondaria per almeno un'ora a temperatura ambiente o 37 gradi Celsius. Ripetere i lavaggi con il tampone di blocco, quindi eseguire immagini fluorescenti, utilizzando un microscopio convenzionale a campo largo o un altro sistema di imaging preferito.Preparare la soluzione di ancoraggio secondo le istruzioni del manoscritto. Posizionare i vetrini in una piastra di petri da 100 ml, pipeggiare la soluzione di ancoraggio sul tessuto e incubarli per almeno tre ore a temperatura ambiente. Quindi, preparare la soluzione di gelatura secondo le indicazioni manoscritte.Rimuovere la soluzione di ancoraggio in eccesso dalla sezione tissutale e riposizionare lo scivolo nella piastra di Petri. Aggiungere una soluzione fresca di gelatura a freddo al campione e incubare la miscela per trenta minuti, a quattro gradi Celsius. Per costruire una camera sullo scivolo attorno al campione, create distanziale tagliando sottilmente pezzi di vetro di copertura con un coltello a diamante.Fissare i distanziati su entrambi i lati del tessuto con acqua e posizionare con cura un coperchio in vetroresina sullo scivolo, assicurandosi di evitare di intrappolare bolle d'aria sul tessuto. Quindi, incubare il campione a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato per due ore. Rimuovere il coperchio della camera di gelatura facendo scorrere delicatamente una lama di rasoio sotto il coverslip e sollevandolo lentamente dalla superficie del gel.Tagliare il gel vuoto intorno al tessuto per ridurre al minimo il volume, assicurandosi di tagliare il gel in modo asimmetrico per tenere traccia dell'orientamento. Diluire la proteinasi K da uno a duecento nel tampone di digestione, assicurandosi di preparare una soluzione sufficiente per immergere completamente il gel. Quindi, incubare il campione con la soluzione in un contenitore chiuso per tre ore a 60 gradi Celsius.Se il campione non si stacca durante la digestione, utilizzare una lama di rasoio per rimuoverlo delicatamente. Utilizzare un pennello morbido per trasferire il campione in 1X PBS in un contenitore compatibile con il sistema di imaging desiderato e abbastanza grande da ospitare il gel completamente espanso. Lavare il campione in PBS per dieci minuti e, se lo si desidera, restain esso con DAPI da 300 millimolare.Espandere i campioni lavando il campione con un volume in eccesso di acqua distillata doppia da tre a cinque volte per dieci minuti per lavaggio. Quindi, eseguire l'imaging a fluorescenza. Se questo protocollo viene eseguito correttamente, i campioni appaiono come un gel piatto e trasparente dopo l'omogeneizzazione meccanica e possono espandersi di un fattore da 3 a 4,5 in acqua.Un campione di rene FFPE spesso cinque micrometri è stato espanso 4,5 volte, il che ha portato a una risoluzione di 63 nanometri usando un obiettivo 0,95 NA. Il tessuto è stato poi convertito in un formato compatibile con la patologia di espansione e macchiato con anticorpi per Alpha Actinin 4 e Vimentin, DAPI per visualizzare il DNA nucleare e Wheat Germa Glutenin per etichettare i carboidrati. La microscopia confocale a disco rotante è stata quindi utilizzata per l'immagine del campione.Il tessuto renale è stato quindi completamente espanso in acqua e nuovamente immaginato. Fessurazioni, distorsioni e perdita di destinazioni etichettate possono essere il risultato di un ancoraggio o di un'omogeneizzazione inadeguati. Il tessuto mammario normale macchiato di ematossilina ed eosina è stato trattato come un campione FFPE, espanso, etichettato con DAPI e immaginato su un microscopio confocale a disco rotante.Anche le fette renali non appolate e congelate sono state elaborate utilizzando questo protocollo. Il tessuto è stato fissato in acetone freddo e macchiato con Alfa Actinin 4, Vimentin, DAPI e Wheat Germa Glutenin. Quando si esegue questa tecnica, è importante ricordare che la tempistica della fase di gelazione è fondamentale.La gelazione prematura può causare distorsioni, limitare l'espansione e causare la perdita di molecole bersaglio. Seguendo questa procedura, l'imaging fluorescente può essere eseguito al microscopio dopo la digestione e l'espansione del campione. ExPath può essere applicato ampiamente sia nelle patologie che oltre.In quanto consente ai ricercatori di visualizzare dettagli sottili nei campioni di tessuto di interesse. Pertanto, può aiutare i ricercatori a ottenere nuove intuizioni sulla patogenesi di malattie o meccanismi dei processi biologici.

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MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI Mappatura di cerebrovascolare Reattività via gas per inalazione sfide

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) spettroscopica Imaging di sezioni di tessuto umano verso Migliorare Patologia

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Umano Brown adipose Depositi tessuti segmentato automaticamente da Positron Emission Tomography / tomografia computerizzata e registrati Risonanza Magnetica Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Una tecnica per la biopsia del tessuto adiposo sottocutaneo addominale tramite un metodo Non-diatermia

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

Ecografia 3D: veloce e conveniente morfometria del tessuto muscolo-scheletrico

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Tutto il corpo e quantificazione regionale dell'essere umano attivo marrone tessuto adiposo con 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Un metodo privo di enzimi per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali mesenchimale derivate dall'Adipo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...