Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
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この作品は、カーネギーメロン大学(YZ)とNIHディレクターの新イノベーター賞(DP2 OD025926-01からYZ)の教員立ち上げ基金によって支援されました。

1. ストック試薬およびソリューションの準備
<ol><li>
ゲル化溶液成分を調調します。 注:溶液濃度は g/mL (w/v%) で与えられます。<ol>
<li>以下のストックソリューションを作る:38%(w/v)アクリル酸ナトリウム(SA)、50%(w/v)アクリルアミド(AA)、2%(w/v)N、N'-メチレベジサクリラム化物(ビス)、および29.2%(w/v)塩化ナトリウム(NaCl)。二重脱イオン水(ddH2 O)に化合物を溶解する。表 1...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

ここでは、FFPE、H&E染色、ガラススライド上の新鮮な凍結標本を含む病理学で使用される最も一般的なタイプの臨床生検サンプルに適用できるProExM5のバリアントであるExPathプロトコル16を提示する。フォーマット変換、抗原検索、および検体の免疫染色は、ExPathに特異的ではない一般的に使用されるプロトコルに従います。元のproExMプロトコル...

3次元(3D)コンテキストで組織の分子組織を調べると、生物学的機能と疾患の発症に関する新たな理解が可能になります。しかしながら、これらのナノスケール環境は、従来の回折制限顕微鏡(200−300nm)の分解能を超え、最小の溶解可能距離、dはdαλ/NAによって定義  される。ここでλは光の波長であり、NAは撮像システムの数値絞り(NA)である。 近年、新たに開発した超解像画像技術1、2、3、刺激放出を含む蛍光標識分子の直接可視化が可能となった。光活性化局在顕微鏡(PALM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、および構造化イルミネーション顕微鏡(SIM)。これらのイメージング技術は、ナノスケールでの生物学的機能の理解に革命を起こしましたが、実際には、高価な機器や特殊な機器や画像処理ステップに頼ることが多く、取得時間が遅くなる可能性があります。従来の光学イメージングでは、特定の特性を持つ蛍光体(光スイッチング能力や高い光安定性など)が必要です。さらに、組織標本に対して3D超解像イメージングを行うのも課題です。
2015年4月に初めて導入された拡張顕微鏡検査(ExM)は、膨らむポリ電解質ヒドロゲルに埋め込まれた保存サンプルを物理的に拡張することにより、ナノスケールの特徴(<70 nm)をイメージングする代替手段を提供します。ここで、主要な生体分子および/または標識は、化学処理後に同位体的に拡張することができるポリマーネットワークにその場所に固定される。物理的な膨張は全く有効な分解能を増加させるので、目的の分子は、従来の回折制限されたイメージングシステムを使用して解決することができる。カスタム合成蛍光標識がポリマーネットワーク4に固定された元のプロトコルの公開以来、新しい戦略は、タンパク質(タンパク質保持ExM、またはproExM)5を直接固定するために使用されてきた。6,7,8,9および RNA9,10,11,12ヒドロゲルに, 反復を介して物理的な倍率を増加させる拡張13または適応ゲル化学8、14、15.
ここでは、臨床病理学フォーマット用に最適化された拡張病理学(ExPath)16と呼ばれるproExMの適応バージョンを提示します。このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、ガラススライドに取り付けられた新鮮な凍結ヒト組織標本を含む臨床サンプルをExMと互換性のある状態に変換します。タンパク質は、次にヒドロゲルに固定され、機械的均質化が行われる(図1)16。サンプルの4倍の線形膨張により、約300nmの分解能しか持たない従来の共焦点顕微鏡を使用して多色超解像(〜70nm)画像を得ることができ、他の超解像イメージング技術と組み合わせることもできます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

現代の病理学では、顕微鏡検査は臨床標本の顕微鏡構造を明らかにすることによって疾患診断において重要な役割を果たしている。しかし、基本的な物理的回折限界は、従来の光学イメージングアプローチを使用する場合、ナノスケールの解剖学および微妙な病理学的変化の尋問を防ぐ。ここでは、固定凍結またはホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織の両方を含む一般的なタイプの臨床原発組織標本のナノスケール光学イメージングのための拡張病理学(ExPath)と呼ばれるシンプルで安価なプロトコルを説明します。セクション。この方法は、組織サンプルを組織ヒドロゲルハイブリッドに化学的に変換し、純粋な水中の複数のスケールにわたってそれらを物理的に同位体に拡張することにより、光回折限界を回避します。膨張により、従来の溶解不可能な分子が分離され、従来の光学顕微鏡を用いて観察することができます。

プロトコルが正常に実行された場合(図1)、サンプルは機械的均質化後に平らで透明なゲルとして現れ(図3A)、水中で3−4.5倍の膨張が可能です(図3B)。5、16を使用した最終的な膨張因子およびイメージングシステムに応じて〜70nmの有効な決断を提供する。<stron...

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Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

臨床組織サンプルのナノスケールイメージングは、疾患病因の理解を向上させることができる。拡張病理学(ExPath)は、標準的な臨床組織サンプルとの互換性のために改変された拡張顕微鏡(ExM)のバージョンであり、従来の回折制限顕微鏡を用いて生体分子のナノスケール構成を探索する。

物理的および同方性拡張によるヒト組織切片のナノスコピックイメージング

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

我々は、ナノスケールの精度で、標準的な臨床組織セクションに関心のある生体分子を画像化するための低コスト測定である拡張病理、つまりExPathを提示しています。ExPathは、臨床組織部に水膨満水体を化学的に注入し、処理したサンプルを約100倍に物理的かつ均等に膨張させることによって、従来の光顕微鏡で従来の光顕微鏡の回折限界を回避し、従来の光学顕微鏡で蛍光標識された生体分子を分離して観察することを可能にする。ExPathを使用すると、新しいイメージングハードウェアに投資することなく、組織サンプル中の疾患関連生体分子のナノスケール構成を研究できます。このように、病気の新しい洞察を可能にし、新しい診断を促進する。この方法は、幅広い組織タイプに適用でき、癌、脳疾患、自己免疫疾患などの様々な複雑な疾患の病因に関する新しい洞察を提供するために使用することができます。視覚的なデモンストレーションは、ゲル化チャンバーの構築や、プロテインナーゼK消化前後のゲル化サンプルの取り扱いなど、重要なステップを適切に行う方法を説明するために重要です。まず、目的の組織を ExPath 互換フォーマットに変換します。FFPE臨床サンプルを使用する場合は、サンプルを50ml円錐チューブにスライドさせ、15mlのジレンを加えます。チューブをキャップし、約60rpmで軌道シェーカーの上に水平に3分間置きます。別の15mlのゼレンで洗浄を繰り返します。次に、原稿の指示に従って、一連のエタノール希釈液でスライドを洗浄する。染色され、取り付けられた永久的なスライドで作業する場合は、50ml円錐形のチューブに各スライドを配置し、Zyleneでそれをカバーします。カバースリップをカミソリの刃で慎重に取り外します。次いで、FFPE臨床サンプルと同様にスライドを処理する。OCT溶液で固定されていない凍結組織スライドを使用する場合は、アセトンの組織を摂氏20度で10分間固定し、1回の洗浄ごとに10分間、1X PBS溶液でサンプルを3回洗浄します。事前に固定および凍結した臨床サンプルを処理する場合は、スライドを室温で2分間放置してOTC溶液を溶融させ、1回、1回の洗浄につき5分間、1X PBSで3回洗浄します。フォーマット変換後、全てのサンプルに対して抗原検索を行います。20ミリモルのクエン酸溶液を電子レンジで摂氏100度に加熱し、スライドを溶液に入れます。すぐに容器をインキュベーションチャンバーに移し、摂氏60度で30分間インキュベートします。サンプルを染色するには、疎水性ペンを使用して、スライド上の組織セクションの周りに境界を描きます。スライドをシャーレに入れ、30°Cで1時間ブロッキングバッファーで組織をインキュベートします。次いで、一次抗体溶液で組織を室温または摂氏37度で少なくとも3時間インキュベートする。インキュベーション後、ブロッキングバッファーで組織を3回洗浄し、室温で少なくとも1時間、または摂氏37度の二次抗体溶液中でインキュベートする。ブロッキングバッファーでのこのスリングを繰り返し、次いで、従来の広視野顕微鏡または他の選択した撮像システムを用いて蛍光イメージングを行う。原稿の指示に従ってアンカーソリューションを準備します。スライドを100mlのシャーレに入れ、組織の上にアンカー溶液をパイプし、室温で少なくとも3時間インキュベートします。次に、原稿の指示に従ってゲル化液を調製する。組織部分から余分なアンカー液を取り除き、スライドをシャーレに戻します。新鮮な冷たいゲル化液をサンプルに加え、摂氏4度で30分間インキュベートします。サンプルの周りのスライドにチャンバーを構築するには、ダイヤモンドナイフでカバーガラスの断片を薄く切断することによってスペーサーを作成します。ティッシュの両側のスペーサーを水で固定し、慎重にカバーグラスの蓋をスライドの上に置き、組織の上に気泡をトラップしないようにします。次に、加湿環境で37°Cでサンプルを2時間インキュベートします。カバースリップの下にそり刃をそっとスライドさせてゲル表面からゆっくりと持ち上げて、ゲル化チャンバーの蓋を取り除きます。ティッシュの周りのブランクゲルをトリミングして体積を最小限に抑え、ゲルを非対称にカットして方向を追跡します。消化バッファーに1〜200を希釈プロテイナーゼ, 完全にゲルを水没させるのに十分な溶液を準備することを確認します.次に、溶液を60°Cで3時間閉じた容器に入れてサンプルをインキュベートする。消化中にサンプルが切り離されない場合は、カミソリの刃を使用してそっと取り除きます。柔らかいペイントブラシを使用して、目的のイメージングシステムと互換性があり、完全に膨張したゲルに対応できる大きさの容器内の1X PBSに標本を移します。PBSでサンプルを10分間洗い、必要に応じて300ミリモルDAPIでレステインします。1回の10分間、過剰量の二重蒸留水でサンプルを3~5回洗浄してサンプルを拡大します。次いで、蛍光イメージングを行う。このプロトコルが正常に実行されると、サンプルは機械的均質化後に平坦で透明なゲルとして現れ、水中で3〜4.5倍に拡大することができます。5マイクロメートルの厚いFFPE腎臓サンプルを4.5回拡張し、その結果、0.95 NAの目的を使用して63ナノメートルの分解能が得られた。その後、組織を拡張病理適合形式に変換し、アルファアクチニン4およびビメンチン、DAPIが核DNAを視覚化し、小麦ゲルマグルテニンが炭水化物を標識するための抗体で染色した。次に、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、標本を画像化した。腎臓組織は、その後、完全に水で拡張され、再び画像化されました.標識されたターゲットの割れ、歪み、損失は、不十分なアンカーまたは均質化の結果である可能性があります。ヘマトキシリンとエオシン染色された正常乳房組織を、FFPE試料として処理し、拡大し、DAPIで標識し、紡績ディスク共焦点顕微鏡で画像化した。固定されていない腎臓のスライスと凍結した腎臓のスライスもこのプロトコルを使用して処理されました。組織を冷アセトンで固定し、アルファアクチン4、ビメンチン、DAPI、およびウィートゲルマグルテニンで染色した。この手法を行う場合、ゲル化工程のタイミングが重要であることを覚えておくことが重要である。早期のゲル化は歪みを引き起こし、膨張を制限し、標的分子の損失を引き起こす可能性があります。この手順に従って、蛍光イメージングは、サンプルの消化および膨張後の顕微鏡上で行うことができる。ExPathは、病理学とそれ以降の両方で広く適用することができます。それは研究者が興味のある組織サンプルの微妙な細部を視覚化することを可能にする。したがって、研究者は、疾患の病因や生物学的プロセスのメカニズムに関する新しい洞察を得るのに役立つ可能性があります。

Research

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Medicine

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The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

人間の活動の地域の定量化と全身褐色脂肪組織18F-FDG PET/CT を使用

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...