Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
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이 작품은 카네기 멜론 대학에서 학부 창업 기금에 의해 지원되었다 (YZ) 및 NIH 이사의 새로운 혁신 상 (DP2 OD025926-01 YZ에).

1. 주식 시약 및 솔루션 준비
<ol><li>
겔화 용액 성분을 준비합니다. 참고: 용액 농도는 g/mL(w/v%)으로 제공됩니다.<ol>
<li>다음 재고 솔루션을 확인: 38% (w/v) 나트륨 아크릴산염 (SA), 50% (w/v) 아크릴아미드 (AA), 2% (w/v) N,N′,N′-메틸렌네비사크릴라미드 (비스), 그리고 29.2% (w/v) 염화나트륨 (NaCl). 이중 탈이온수(ddH 2O)에화합물을 용해시켰다. 표 1의 양을 참조로 사용합니...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

여기에서는 FFPE, H&E 스테인드 및 유리 슬라이드에 새로 얼어붙은 시편을 포함하여 병리학에 사용되는 가장 일반적인 유형의 임상 생검 샘플에 적용할 수 있는 proExM5의 변형인 ExPath 프로토콜16을제시합니다. 견본의 포맷 변환, 항원 회수 및 면역 염색은 ExPath에 특이적이지 않은 일반적으로 사용되는 프로토콜을 따릅니다. 원래 proExM 프로토콜9와...

3차원(3D) 맥락에서 조직의 분자 조직을 조사하면 생물학적 기능과 질병 발달에 대한 새로운 이해를 제공할 수 있습니다. 그러나, 이러한 나노 스케일 환경은 최소 한용화 거리, dα/λ NA에 의해 정의되는 종래의 회절 제한 현미경(200−300 nm)의 분해 능을 넘어서는  것이다. 여기서 λ는 빛의 파장이고 NA는 이미징 시스템의 수치 개구부(NA)이다. 최근에는 형광 표지된 분자의 직접 시각화가 새롭게 개발된 초고해상도 이미징 기술1,2,3,자극방출 고갈(STED)을 포함하여 가능해졌으며, 사진 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM), 연속 광학 재건 현미경 검사법 (STORM), 구조화 조명 현미경 검사법 (SIM). 이러한 이미징 기술은 나노 스케일에서 생물학적 기능에 대한 이해에 혁명을 일으켰지만 실제로는 고가의 및 /또는 특수 장비 및 이미지 처리 단계에 의존하는 경우가 많으며, 광 이미징과 같은 특정 특성을 가진 형광단이 필요합니다(예: 광 스위칭 기능 및/또는 높은 광 안정성). 또한, 조직 시편에서 3D 초고해상도 이미징을 수행하는 것은 여전히 과제입니다.
2015년4월에처음 도입된 확장 현미경 검사법(ExM)은 팽창성 폴리전해질 하이드로겔에 내장된 보존된 샘플을 물리적으로 확장하여 나노스케일 기능(&70 nm)을 이미징하는 대체 수단을 제공합니다. 여기서 주요 생체 분자 및/또는 라벨은 화학 처리 후 동위원소로 확장될 수 있는 폴리머 네트워크에 자리에 고정됩니다. 물리적 팽창은 총 유효 해상도를 증가하기 때문에, 관심 있는 분자는 기존의 회절 제한 이미징 시스템을 사용하여 해결될 수 있다. 사용자 정의 합성 형광 라벨이 폴리머 네트워크에 고정 된 원래 프로토콜의 출판 이후4,새로운 전략은 직접 단백질을 고정하는 데 사용되었습니다 (단백질 보존 ExM, 또는 proExM)5, 6,7,8,9 및 RNA9, 10,11,12를 하이드로겔로, 반복을 통해 물리적 배율을 증가시다. 확장13 또는 적응 젤 화학8,14,15.
여기에서 우리는 임상 병리학 형식에 최적화된 확장 병리학 (ExPath)16에게불린 proExM의 적응된 버전을 제시합니다. 이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE), 헤마톡신 및 에오신(H&E) 스테인드, 유리 슬라이드에 장착된 신선 냉동 인간 조직 표본을 포함한 임상 샘플을 ExM과 호환되는 상태로 변환합니다. 단백질은 하이드로겔에 고정되고 기계적 균질화가 수행된다(도1)16. 시료의 4배 선형 팽창을 통해~ ~300 nm 해상도만을 갖는 기존의 공초점 현미경을 사용하여 다중 컬러 초고해상도(~70nm) 이미지를 얻을 수 있으며 다른 초고해상도 이미징 기술과도 결합될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

현대 병리학에서 광학 현미경 검사는 임상 표본의 현미경 구조를 밝혀 질병 진단에 중요한 역할을합니다. 그러나, 근본적인 물리적 회절 한계는 기존의 광학 화상 진찰 접근을 사용할 때 나노 규모 해부학 및 미묘한 병리학 적인 변경의 심문을 방지합니다. 여기에서, 우리는 임상 1 차 조직 견본의 일반적인 모형의 나노 규모 광학 화상 진찰을 위한 확장 병리에게 불린 간단하고 저렴한 프로토콜을 기술합니다, 둘 다 고정 된 동결 또는 포르말린 고정 파라핀 내장 (FFPE) 조직을 포함하 섹션. 이 방법은 조직 샘플을 화학적으로 조직 하이드로겔 하이브리드로 변환하고 순수한 물의 여러 비늘에서 등열대로 물리적으로 확장하여 광학 회절 한계를 우회합니다. 확장으로 인해 이전에는 해결할 수 없는 분자가 분리되어 기존의 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.

프로토콜이 성공적으로 수행된경우(그림 1),샘플은 기계적 균질화 후 평평하고 투명한 겔로 나타나며(그림3A)물 속에서 3−4.5배의 비율로 확장할 수 있음(그림3B) ~70nm의 유효 분해능을 제공하는 최종 팽창계수 및 이미징 시스템은5,16을사용한다. ...

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Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

임상 조직 견본의 나노 규모 화상 진찰은 질병 병인의 이해를 향상할 수 있습니다. 확장 병리학 (ExPath)은 표준 임상 조직 샘플과의 호환성을 위해 변형 된 확장 현미경 검사법 (ExM)의 버전으로, 기존의 회절 제한된 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 스케일 구성을 탐구합니다.

물리적 및 등방성 확장을 통해 인간 조직 섹션의 나노 스코프 이미징

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

우리는 나노 스케일 정밀도로 표준 임상 조직 섹션에 대한 관심의 이미지 생체 분자에 대한 저렴한 비용 측정, 확장 병리학, 또는 ExPath를 제시하고 있습니다. ExPath는 기존의 광 현미경으로 분리되고 관찰할 수 있도록 화학적으로 물 팽창 하이드로겔로 임상 조직 섹션을 주입한 다음 처리된 샘플을 약 100배 정도 물리적으로 균등하게 확장함으로써 종래의 광 현미경검사의 회절 한계를 우회한다. ExPath를 사용하면 새로운 이미징 하드웨어에 투자할 필요 없이 조직 샘플에서 질병 관련 생체 분자의 나노 스케일 구성을 연구할 수 있습니다.따라서 질병의 새로운 통찰력을 가능하게하고 새로운 진단을 육성합니다. 이 방법은 광범위한 조직 유형에 적용될 수 있으며 암, 뇌 질환, 자가 면역 질환 등과 같은 다양한 복잡한 질병의 발병기유발에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 시각 데모는 겔화 챔버의 생성 과 단백질 제 K 소화 전후의 겔화 시료를 처리하는 등 중요한 단계를 제대로 수행하는 방법을 설명하는 것이 중요합니다.먼저 관심 있는 조직을 ExPath 호환 형식으로 변환합니다. FFPE 임상 샘플로 작업하는 경우 50ml 원문 튜브에 샘플과 함께 슬라이드를 배치하고 15ml의 Zylene을 추가하십시오. 튜브를 캡하고 약 60rpm에 궤도 셰이커에 수평으로 3 분 동안 놓습니다.다른 15ml의 질렌으로 씻는 것을 반복합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 일련의 에탄올 희석제로 슬라이드를 씻으십시오. 스테인드 및 마운트 영구 슬라이드로 작업하는 경우 각 슬라이드를 50ml 원식 튜브에 넣고 Zylene으로 덮습니다.면도날로 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 이어서, FFPE 임상 샘플과 동일한 방식으로 슬라이드를 처리한다. OCT 용액에서 고정되지 않은 냉동 조직 슬라이드로 작업하는 경우, 10 분 동안 20섭씨20도에서 아세톤으로 조직을 수정한 다음 세척 당 10 분 동안 1X PBS 용액으로 샘플을 세 번 씻으십시오.이전에 고정 및 냉동 임상 샘플을 처리하는 경우, OTC 용액을 녹일 실온에서 2 분 동안 슬라이드를 두고, 세척 당 5 분 동안 1X PBS로 샘플을 세 번 세척하십시오. 포맷 변환 후 모든 샘플에서 항원 검색을 수행합니다. 20 밀리머 구연산용액을 전자레인지에 섭씨 100도로 가열하고 슬라이드를 용액에 놓습니다.즉시 용기를 인큐베이션 챔버로 옮기고 섭씨 60도에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 시료를 염색하려면 소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위의 경계를 그립니다. 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 30°C에서 1시간 동안 버퍼를 차단하여 조직을 배양합니다.이어서, 실온 또는 섭씨 37도에서 적어도 3시간 동안 1차 항체 용액으로 조직을 배양한다. 인큐베이션 후, 차단 완충제로 조직을 세 번 세척하고 실온또는 섭씨 37도에서 적어도 1시간 동안 이차 항체 용액에 배양한다. 차단 버퍼로 세척을 반복한 다음 기존의 광시야 현미경 또는 기타 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다.원고 지침에 따라 앵커링 솔루션을 준비합니다. 슬라이드를 100ml 페트리 접시에 놓고 고정 용액을 조직에 파이프로 고정하고 실온에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 원고 의 방향에 따라 젤링 솔루션을 준비합니다.티슈 섹션에서 과도한 고정 용액을 제거하고 슬라이드를 다시 페트리 접시에 넣습니다. 신선한 차가운 젤링 용액을 샘플에 추가하고 4섭씨에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다. 샘플 주위슬라이드에 챔버를 구성하려면 다이아몬드 나이프로 커버 글래스 조각을 얇게 절단하여 스페이서를 만듭니다.티슈 양쪽의 스페이서를 물로 고정하고 조심스럽게 슬라이드 위에 커버글래스 뚜껑을 배치하여 조직에 기포가 포획되는 것을 피하십시오. 그런 다음 가습 환경에서 섭씨 37도에서 샘플을 2시간 동안 배양합니다. 커버슬립 아래에 면도날을 부드럽게 슬라이딩하고 천천히 젤 표면에서 들어 올려 겔 챔버의 뚜껑을 제거합니다.부피를 최소화하기 위해 조직 주위의 빈 젤을 다듬어 방향을 추적하기 위해 비대칭으로 젤을 잘라내십시오. 단백질을 희석 한 1 ~ 200 개의 소화 버퍼를 희석하여 젤을 완전히 잠수할 수있는 충분한 솔루션을 준비하십시오. 그런 다음 60°C에서 3시간 동안 밀폐용기에 용액으로 샘플을 배양한다.소화 중에 샘플이 분리되지 않으면 면도날을 사용하여 부드럽게 제거하십시오. 소프트 페인트 브러시를 사용하여 시편을 원하는 이미징 시스템과 호환되는 용기에 1X PBS로 옮기고 완전히 확장된 젤을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽좋습니다. PBS에서 샘플을 10분 동안 세척하고 원하는 경우 300 밀리머 DAPI로 샘플을 세척하십시오.세척당 10분 동안 3~5회 이중 증류수의 과잉 부피로 샘플을 세척하여 시료를 확장합니다. 그런 다음 형광 이미징을 수행합니다. 이 프로토콜이 성공적으로 수행되면, 샘플은 기계적 균질화 후 평평하고 투명한 젤로 나타나며 물에서 3 ~ 4.5의 비율로 확장 할 수 있습니다.5 마이크로미터 두께의 FFPE 신장 샘플은 4.5배 확장되어 0.95 NA 목표를 사용하여 63나노미터의 해상도를 생성했습니다. 조직은 그 때 확장 병리학 호환 형식으로 변환되고 알파 액틴 4및 Vimentin를 위한 항체로 염색되었습니다, 핵 DNA를 시각화하기 위하여 DAPI, 및 밀 게르마 글루텐in는 탄수화물을 표지하기 위하여. 회전 디스크 공초점 현미경 검사는 시편을 이미지하는 데 사용되었다.신장 조직은 그 때 완전히 물에서 확장하고 다시 심상화되었습니다. 표지된 대상의 균열, 왜곡 및 손실은 부적절한 앵커링 또는 균질화의 결과일 수 있습니다. Hematoxylin 및 eosined 정상 유방 조직은 FFPE 샘플로 취급되었다, 확장, DAPI로 표시, 회전 디스크 공초점 현미경에 이미지.고정되지 않은 신장 조각도 이 프로토콜을 사용하여 처리되었습니다. 조직은 차가운 아세톤에 고정되고 알파 액틴 4, 비멘틴, DAPI 및 밀 게르마 글루텐로 얼룩졌습니다. 이 기술을 수행할 때, 겔화 단계의 타이밍이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.조기 겔화는 왜곡을 일으킬 수 있으며 확장을 제한하며 표적 분자의 손실을 초래할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 형광 화상 진찰은 샘플의 소화 및 확장 후에 현미경에 수행될 수 있습니다. ExPath는 병리학 과 그 너머 모두에서 광범위하게 적용할 수 있습니다.그것은 연구원이 관심있는 조직 견본에 있는 미묘한 세부사항을 시각화하는 가능하게 합니다. 따라서, 그것은 질병 또는 생물학적 과정의 메커니즘의 병기에서 새로운 통찰력을 얻기 위해 연구원을 도울 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

연구

의학

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

견갑골 갈색 지방 조직의 Cerenkov 발광 이미징

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

가스 흡입 도전을 통해 뇌 혈관 반응성의 MRI 매핑

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

고화질 푸리에 병리학 개선으로 인체 조직 섹션의 적외선 (FT-IR) 분광 이미징 변환

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

인간의 갈색 지방 조직의 종점은 자동으로 양전자 방출 단층 촬영 / 전산화 단층 촬영 분단과 자기 공명 이미지 등록

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

비 투 열 방법을 통해 복 부 피하 지방 조직 생 검에 대 한 기술

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3 차원 초음파 영상: 골격 조직의 신속 하 고 비용 효율적인 Morphometry

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

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In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...