Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av fakultetet oppstart fondet fra Carnegie Mellon University (YZ) og NIH Director ' s New innovatør Award (DP2 OD025926-01 til YZ).

1. utarbeidelse av lager reagenser og-løsninger
<ol><li>
Klargjør gelling løsningskomponenter. Merk: løsnings konsentrasjonene er gitt i g/ml (w/v-prosent).<ol>
<li>Gjør følgende lager løsninger: 38% (w/v) natrium akrylat (SA), 50% (w/v) akrylamid (AA), 2% (w/v) N, N′-methylenebisacrylamide (BIS) og 29,2% (w/v) natriumklorid (NaCl). Oppløse forbindelsene i dobbelt deionisert vann (ddH2O). Bruk beløpene i tabell 1 som referanse. forberedt løsninger kan skaleres...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Her presenterer vi ExPath protokoll16, en variant av proExM5 som kan brukes på de vanligste typene klinisk biopsi prøvene brukes i patologi, inkludert FFPE, H & E beiset, og fersk-frosne eksemplarer på glass lysbilder. Format konvertering, antigen gjenfinning, og immunostaining av prøvene følger ofte brukte protokoller som ikke er spesifikke for ExPath. I motsetning til den opprinnelige proExM protokollen9, ExPath avhengig av en høyere konsentr...

Gransker molekylær organisering av vev i en tredimensjonal (3D) kontekst kan gi ny forståelse av biologiske funksjoner og sykdomsutvikling. Disse nanoskala miljøene er imidlertid utenfor oppløsnings egenskapene til konvensjonelle Diffraksjon begrenset mikroskop (200 − 300 NM), der minimal kan løses avstand, d er definert av d α  λ/na. Her λ er Bølgelengden av lys og na er den numeriske blenderåpning (na) av Imaging system. Nylig har direkte visualisering av fluorescensmerkete merket molekyler blitt gjort mulig av nyutviklet super-oppløsning Imaging teknikker1,2,3, inkludert stimulert utslipp tømming (sted), Foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM), Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), og strukturert belysning mikroskopi (SIM). Selv om disse Imaging teknikkene har revolusjonert forståelsen av biologisk funksjon på nanoskala, i praksis, de ofte stole på dyre og/eller spesialisert utstyr og bildebehandling trinn, kan ha tregere oppkjøpet tid å sammenligne med vanlig optisk tenkelig, forlange fluorophores med spesifikk kjennetegnene (som Foto-skifter evnen og/eller høy photostability). I tillegg er det fortsatt en utfordring å utføre 3D super oppløselig bilde på vevsprøver.
Expansion mikroskopi (ExM), først introdusert i 20154, gir en alternativ måte å Imaging nanoskala funksjoner (< 70 NM) ved å fysisk utvide bevarte prøver innebygd i en swellable polyelectrolyte hydrogel. Her er nøkkel biomolekyler og/eller etiketter forankret i situ til et polymer nettverk som kan isotopically utvides etter kjemisk behandling. Fordi den fysiske utvidelsen øker den totale effektive oppløsningen, kan molekyler av interesse deretter løses ved hjelp av konvensjonelle Diffraksjon bilde systemer. Siden utgivelsen av den opprinnelige protokollen, der tilpassede syntetisert fluorescerende etiketter ble forankret til polymer nett4, har nye strategier blitt brukt til direkte anker proteiner (protein oppbevaring ExM, eller proExM)5, 6,7,8,9 og RNA9,10,11,12 til hydrogel, og Øk fysisk forstørrelse gjennom gjentakende ekspansjon13 eller tilpasse gel kjemi8,14,15.
Her presenterer vi en tilpasset versjon av proExM, kalt utvidelse patologi (ExPath)16, som har blitt optimalisert for klinisk patologi formater. Protokollen omdanner klinisk prøvene, inkluderer formalin-bestemt parafin-lagt ned i (FFPE), hematoksylin og eosin (H & E) flekkete, og frisk-frosset Human tissue prøver montert opp på barometer lysbilder, i en begrunne forenlig med ExM. Proteiner blir deretter forankret til hydrogel og mekanisk homogenisering utføres (figur 1)16. Med en 4-fold Lineær utvidelse av prøvene, flerfarget super-oppløsning (~ 70 NM) bilder kan fås ved hjelp av en konvensjonell konfokalmikroskopi mikroskop har bare en ~ 300 NM oppløsning og kan også kombineres med andre super-oppløsning Imaging teknikker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

I moderne patologi spiller optiske mikroskopi en viktig rolle i sykdoms diagnosen ved å avsløre mikroskopiske strukturer av kliniske prøver. Men den grunnleggende fysiske Diffraksjon grensen hindrer avhør av nanoskala anatomi og subtile patologiske forandringer ved bruk av konvensjonelle optiske Imaging tilnærminger. Her beskriver vi en enkel og rimelig protokoll, kalt Utvidelses patologi (ExPath), for nanoskala optisk avbildning av vanlige typer kliniske prøver av primær vev, inkludert både fast frosset eller formalin-fast parafin innebygd (FFPE) vev Deler. Denne metoden omgår den optiske Diffraksjon grensen ved kjemisk transformere vevsprøvene i vev-hydrogel hybrid og fysisk utvide dem isotropically over flere skalaer i rent vann. På grunn av ekspansjon, er tidligere uløselig molekyler separert og kan dermed observeres ved hjelp av en konvensjonell optisk mikroskop.

Hvis protokollen har blitt utført (figur 1), vil prøvene vises som en flat og transparent gel etter mekanisk homogenisering (Figur 3a) og kan utvides med en faktor på 3 − 4,5 x i vann (Figur 3B), gir en effektiv oppløsning på ~ 70 NM avhengig av den endelige Utvidelses faktoren og Imaging system som brukes5,16. Fi...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Nanoskala avbildning av kliniske vevsprøver kan forbedre forståelsen av sykdoms patogenesen. Ekspansjon patologi (ExPath) er en versjon av ekspansjon mikroskopi (ExM), modifisert for kompatibilitet med standard kliniske vevsprøver, for å utforske nanoskala konfigurasjonen av biomolekyler bruker konvensjonelle Diffraksjon begrenset mikroskop.

Nanoscopic Imaging av Human tissue seksjoner via fysisk og isotropic ekspansjon

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Vi presenterer ekspansjonspatologi, eller ExPath for kort, et lavt kostnadsmål for å bilde biomolekyl av interesse for standard kliniske vevseksjoner, med nanoskala presisjon. ExPath omgår diffraksjonsgrensen for konvensjonell lett mikroskopi ved kjemisk infusing av den kliniske vevsdelen med en vann svulmende hydrogel, og deretter fysisk og jevnt utvide de behandlede prøvene med omtrent hundre ganger, slik at tidligere overlappet fluorescerende merkede biomolekyler som skal skilles og observeres med et konvensjonelt optisk mikroskop. ExPath tillater brukere å studere nanoskalakonfigurasjoner av sykdomsrelaterte biomolekyler i vevsprøver, uten å måtte investere i ny bildemaskinvare.Dermed muliggjør ny innsikt i sykdommen og fremmer ny diagnose. Denne metoden kan brukes på et bredt spekter av vevstyper og brukes til å gi ny innsikt i patogenesen av ulike komplekse sykdommer, som kreft, hjernesykdom, auto-immun sykdom og andre. Visuell demonstrasjon er viktig for å illustrere hvordan du gjør de kritiske trinnene riktig, for eksempel bygging av gelekammeret og håndtering av gelled prøven før og etter Proteinase K fordøyelsen.Start med å konvertere interessevevet til et ExPath-kompatibelt format. Hvis du arbeider med FFPE kliniske prøver, plasser lysbildet med prøven i et 50 ml konisk rør og tilsett 15 ml Zylene. Cap røret og plassere den horisontalt på en orbital shaker på ca 60rpm i tre minutter.Gjenta vasken med ytterligere 15 ml Zylene. Vask deretter lysbildet i en rekke etanolfortyninger, i henhold til manuskriptretninger. Hvis du arbeider med beisede og monterte permanente lysbilder, plasserer du hvert lysbilde i et 50 ml konisk rør, og deretter dekker du det med Zylene.Fjern forsiktig dekselet slip med et barberblad. Deretter behandler du lysbildet på samme måte som FFPE kliniske prøver. Hvis du arbeider med uløste frosne vevslys i OCT-løsning, fikser vevet i aceton ved 20 grader Celsius i ti minutter, vask deretter prøvene med 1X PBS-løsning tre ganger i ti minutter per vask.Hvis behandlingen tidligere faste og frosne kliniske prøver, la lysbildene stå i to minutter ved romtemperatur for å smelte OTC-løsningen, vask deretter prøven med 1X PBS tre ganger, i fem minutter per vask. Etter formatkonvertering, utfør antigenhenting på alle prøver. Varm 20 millimolar Citrate løsning til 100 grader Celsius i en mikrobølgeovn og plasser lysbildet i løsningen.Overfør umiddelbart beholderen til et inkubasjonskammer og inkuber den ved 60 grader Celsius i tretti minutter. For å flekke prøven, bruk en hydrofob penn til å tegne en grense rundt vevsdelen på lysbildet. Plasser lysbildet i en petriskål, og inkuber vevet med blokkerende buffer i en time ved 30 grader Celsius.Deretter inkuber vevet med den primære antistoffløsningen i minst tre timer ved romtemperatur eller 37 grader Celsius. Etter inkubasjonen vasker du vevet tre ganger med blokkeringsbuffer, og inkuberer det i sekundær antistoffløsning i minst en time ved romtemperatur, eller 37 grader Celsius. Gjenta vaskene med blokkeringsbufferen, og utfør deretter fluorescerende bildebehandling ved hjelp av et konvensjonelt bredfeltmikroskop eller et annet bildesystem.Forbered forankringsløsning i henhold til manuskriptinstruksjoner. Plasser lysbildene i en 100 ml petriskål, rør forankringsløsningen over vevet, og inkuber dem i minst tre timer ved romtemperatur. Deretter forbereder geling løsning i henhold til manuskriptretninger.Fjern overflødig forankringsløsning fra vevsdelen og plasser lysbildet tilbake i petriskålen. Tilsett fersk kald geling løsning til prøven og inkuber blandingen i tretti minutter, ved fire grader Celsius. For å konstruere et kammer på lysbildet rundt prøven, lag avstandsstykker ved tynt skjærende dekselglass med en diamantkniv.Fest avstandsslene på hver side av vevet med vann og plasser forsiktig et dekkglasslokk over lysbildet, og sørg for å unngå å fange luftbobler over vevet. Deretter inkuber prøven ved 37 grader Celsius i et fuktet miljø i to timer. Fjern lokket på gelekammeret ved å forsiktig skyve et barberblad under dekkslippen og sakte løfte det av geloverflaten.Trim den tomme gelen rundt vevet for å minimere volumet, og sørg for å kutte gelen asymmetrisk for å spore orienteringen. Fortynn Proteinase K en til to hundre i fordøyelsesbufferen, og sørg for å forberede nok løsning for å helt senke gelen helt. Deretter inkuber prøven med løsningen i en lukket beholder i tre timer ved 60 grader Celsius.Hvis prøven ikke løsner under fordøyelsen, bruk et barberblad til å forsiktig fjerne den. Bruk en myk pensel til å overføre prøven til 1X PBS i en beholder som er kompatibel med ønsket bildesystem og stor nok til å romme den fullt utvidede gelen. Vask prøven i PBS i ti minutter, og om ønskelig restain den med 300 millimolar DAPI.Utvid prøvene ved å vaske prøven med et overflødig volum dobbelt destillert vann tre til fem ganger i ti minutter per vask. Deretter utfører du fluorescensavbildning. Hvis denne protokollen utføres vellykket, vises prøver som en flat og gjennomsiktig gel etter mekanisk homogenisering og kan utvides med en faktor på 3 til 4,5 i vann.En fem mikrometer tykk FFPE nyre prøve ble utvidet 4,5 ganger, noe som resulterte i en oppløsning på 63 nanometer ved hjelp av en 0,95 NA mål. Vevet ble deretter omgjort til en ekspansjon patologi kompatibelt format og farget med antistoffer for Alpha Actinin 4 og Vimentin, DAPI å visualisere kjernefysisk DNA, og Wheat Germa Glutenin å merke karbohydrater. Spinning plate konfokal mikroskopi ble deretter brukt til å bilde prøven.Nyrevevet ble deretter fullstendig utvidet i vann og avbildet igjen. Sprekker, forvrengninger og tap av merkede mål kan være et resultat av utilstrekkelig forankring eller homogenisering. Hematoksylin og eosinfarget normalt brystvev ble behandlet som en FFPE-prøve, utvidet, merket med DAPI, og avbildet på et spinnende plate confocal mikroskop.Uløste og frosne nyreskiver ble også behandlet ved hjelp av denne protokollen. Vevet ble løst i kaldt aceton og farget med Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI og Wheat Germa Glutenin. Når du utfører denne teknikken, er det viktig å huske at tidspunktet for gelation trinnet er kritisk.For tidlig gelering kan forårsake forvrengninger, begrense ekspansjon og føre til tap av målmolekyler. Etter denne prosedyren kan fluorescerende bildebehandling utføres på et mikroskop etter fordøyelse og utvidelse av prøven. ExPath kan brukes bredt i både patologier og utover.Som det gjør det mulig for forskere å visualisere subtile detaljer i vevsprøver av interesse. Derfor kan det hjelpe forskere å få ny innsikt i patogenesen av sykdommer eller mekanismer for biologiske prosesser.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

En orthotopic Glioblastoma Mouse Model Opprettholde Brain Parenkymalt fysiske begrensninger og Egnet for Intravital To-foton mikroskopi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov Luminescence Imaging av interscapular brunt fettvev

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MR Kartlegging av cerebrovaskulær reaktivitet via Gass Innånding Utfordringer

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

HD-Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spektroskopiske Imaging of Human vevssnitt mot Forbedre Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Menneskelig brunt fettvev depoter automatisk segmentert etter Positron Emission Tomography / Datatomografiscanning og Registrert magnetisk resonans Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknikk for Subcutaneous Abdominal fettvev biopsi via en ikke-diathermy-metode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D Ultralyd Imaging: rask og kostnadseffektiv Morphometry av muskel vev

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Hele kroppen og regionale kvantifisering av aktiv person brune fettvev med 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Et enzym-fri metode for isolering og utvidelse av Human fett-avledet Mesenchymal stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optisk clearing og Imaging av Immunolabeled nyre tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...