Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo fundo de start-up da faculdade da Universidade de Carnegie Mellon (YZ) e do prêmio novo Inovator do diretor de NIH (DP2 OD025926-01 a YZ).

1. preparação de reagentes e soluções de estoque
<ol><li>
Prepare os componentes da solução de gelificação. Nota: as concentrações da solução são dadas em g/ml (w/v por cento).<ol>
<li>Faça as seguintes soluções de estoque: 38% (w/v) acrilato de sódio (SA), 50% (w/v) acrilamida (AA), 2% (w/v) N, N′-metilenebisacrilamida (BIS), e 29,2% (w/v) cloreto de sódio (NaCl). Dissolva os compostos em água duplamente desionizada (ddH2o). Use os montantes na tabela 1</stro...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Aqui, nós apresentamos o protocolo16de expath, uma variação de proExM5 que pode ser aplicado aos tipos os mais comuns de amostras clínicas da biópsia usadas na patologia, incluindo ffpe, H & e espécimes manchados, e fresco-congelados em corrediças de vidro. A conversão do formato, a recuperação do antígeno, e a imunomarcação dos espécimes seguem os protocolos comumente usados que não são específicos a ExPath. Diferentemente do protocolo proExM original<sup ...

Investigar a organização molecular dos tecidos em um contexto tridimensional (3D) pode proporcionar uma nova compreensão das funções biológicas e do desenvolvimento da doença. No entanto, esses ambientes de nanoescala estão além das capacidades de resolução de microscópios limitados de difração convencional (200 − 300 nm), onde a distância mínima resolvível, d é definida por d α  λ/na. Aqui λ é o comprimento de onda da luz e na é a abertura numérica (na) do sistema de imagem. Recentemente, a visualização direta de moléculas etiquetadas cDNAs foi feita possível por técnicas de imagem latente recentemente desenvolvidas da super-definição1,2,3, incluindo a depleção de emissão estimulada (sted), microscopia de Localização foto-ativada (PALM), microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de iluminação estruturada (SIM). Embora essas técnicas de imagem tenham revolucionado a compreensão da função biológica na nanoescala, na prática, eles muitas vezes dependem de equipamentos caros e/ou especializados e etapas de processamento de imagem, podem ter um tempo de aquisição mais lento em comparação com a imagem latente ótica convencional, exige fluoróforos com características específicas (tais como a capacidade da foto-comutação e/ou o photostability elevado). Além disso, continua a ser um desafio para executar imagens 3D de super resolução em espécimes de tecido.
A microscopia de expansão (Exm), introduzida primeiramente em 20154, fornece meios alternativos de características da nanoescala da imagem latente (< 70 nanômetro) fisicamente expandindo amostras preservadas encaixadas em um Hydrogel expansível do polyeletrólito. Aqui, as principais biomoléculas e/ou rótulos são ancorados in situ a uma rede de polímeros que pode ser isotopicamente expandida após o processamento químico. Como a expansão física aumenta a resolução efetiva total, as moléculas de interesse podem ser resolvidas usando sistemas convencionais de geração de imagens com limitação de difração. Desde a publicação do protocolo original, onde rótulos fluorescentes sintetizados personalizados foram ancorados à rede de polímeros4, novas estratégias têm sido usadas para ancorar diretamente as proteínas (retenção de proteínas Exm, ou proexm)5, 6,7,8,9 e RNA9,10,11,12 ao Hydrogel, e aumentam a ampliação física com iterativo expansão13 ou adaptando a química do gel8,14,15.
Aqui nós apresentamos uma versão adaptada de proExM, chamada patologia da expansão (ExPath)16, que foi aperfeiçoada para formatos clínicos da patologia. O protocolo converte amostras clínicas, incluindo o formalin-fixo parafina-encaixado (ffpe), o hematoxilina e a eosina (H & e) manchado, e os espécimes humanos fresco-congelados do tecido montados em corrediças de vidro, em um estado compatível com Exm. As proteínas são então ancoradas no hidrogel e a homogeneização mecânica é realizada (Figura 1)16. Com uma expansão linear de 4 dobras das amostras, as imagens multicolor da super-definição (~ 70 nanômetro) podem ser obtidas usando um microscópio confocal convencional que tem somente uma definição do ~ 300 nm e pode igualmente ser combinada com outras técnicas de imagem latente da super-definição.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

Na patologia moderna, a microscopia óptica desempenha um papel importante no diagnóstico da doença, revelando estruturas microscópicas de espécimes clínicos. No entanto, o limite de difração física fundamental impede a interrogação da anatomia de nanoescala e alterações patológicas sutis ao usar abordagens de imagem óptica convencionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples e barato, chamado patologia da expansão (expath), para a imagem latente ótica nanoescala de tipos comuns de espécimes preliminares clínicos do tecido, incluindo o tecido fixo-congelado ou formalin-fixo da parafina incorporado (ffpe) Seções. Este método contorna o limite ótico da difração quimicamente transformando as amostras do tecido no híbrido do tecido-Hydrogel e expandindo-os fisicamente isotropicamente através das escalas múltiplas na água pura. Devido à expansão, moléculas previamente inresolvíveis são separadas e, portanto, podem ser observadas usando um microscópio óptico convencional.

Se o protocolo tiver sido realizado com sucesso (Figura 1), as amostras aparecerão como um gel liso e transparente após a homogeneização mecânica (Figura 3a) e podem se expandir por um fator de 3 − 4,5 x em água (Figura 3B), proporcionando uma resolução efetiva de ~ 70 nm, dependendo do fator de expansão final e do sistemade imagemutilizado 5<sup class="...

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Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

A imagem latente de nanoscale de amostras clínicas do tecido pode melhorar a compreensão da patogénese da doença. A patologia de expansão (ExPath) é uma versão da microscopia de expansão (ExM), modificada para compatibilidade com amostras de tecido clínico padrão, para explorar a configuração de nanoescala de biomoléculas usando microscópios limitados de difração convencional.

Imagem nanoscópica de seções do tecido humano através da expansão física e isotropic

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Estamos apresentando patologia de expansão, ou ExPath, para abreviar, uma medida de baixo custo para biomolécula de imagem de interesse nas seções de tecido clínico padrão, com precisão nanoescala. O ExPath contorna o limite de difração da microscopia de luz convencional infundindo quimicamente a seção de tecido clínico com um hidrogel inchar água e, em seguida, expandindo fisicamente e uniformemente as amostras tratadas em cerca de cem vezes, permitindo que biomoléculas rotuladas fluorescentes anteriormente fossem separadas e observadas com um microscópio óptico convencional. O ExPath permite que os usuários estudem configurações nano escala de biomoléculas relacionadas a doenças em amostras de tecido, sem precisar investir em novos hardwares de imagem.Assim, possibilitando novos insights sobre a doença e promovendo novos diagnósticos. Este método pode ser aplicado a uma ampla gama de tipos de tecidos e ser usado para fornecer uma nova visão sobre a patogênese de várias doenças complexas, como câncer, doença cerebral, doenças autoimunes, entre outras. A demonstração visual é importante para ilustrar como fazer as etapas críticas corretamente, como a construção da câmara de gelagem e o manuseio da amostra em gelada antes e depois da digestão Proteinase K.Comece convertendo o tecido de interesse em um formato compatível com ExPath. Se trabalhar com amostras clínicas FFPE, coloque o slide com a amostra em um tubo cônico de 50ml e adicione 15ml de Zylene. Tampe o tubo e coloque-o horizontalmente em um agitador orbital a aproximadamente 60rpm por três minutos.Repita a lavagem com mais 15 ml de Zylene. Em seguida, lave o slide em uma série de diluições de etanol, de acordo com as instruções do manuscrito. Se trabalhar com lâminas permanentes manchadas e montadas, coloque cada slide em um tubo cônico de 50ml e cubra-o com Zylene.Remova cuidadosamente o deslizamento da tampa com uma lâmina de barbear. Em seguida, processe o slide da mesma forma que as amostras clínicas ffpe. Se trabalhar com lâminas de tecido congelado não fixadas na solução OCT, fixe o tecido em acetona a 20 graus Celsius por dez minutos e, em seguida, lave as amostras com solução 1X PBS três vezes por dez minutos por lavagem.Se processar amostras clínicas previamente fixas e congeladas, deixe os slides por dois minutos à temperatura ambiente para derreter a solução OTC e, em seguida, lave a amostra com 1X PBS três vezes, por cinco minutos por lavagem. Após a conversão do formato, realize a recuperação de antígenos em todas as amostras. Aqueça a solução de citrato de 20 milimolas a 100 graus Celsius em um micro-ondas e coloque o slide na solução.Transfira imediatamente o recipiente para uma câmara de incubação e incuba-o a 60 graus Celsius por trinta minutos. Para colorir a amostra, use uma caneta hidrofóbica para desenhar um limite ao redor da seção tecidual na lâmina. Coloque o slide em uma placa de petri e, em seguida, incubar o tecido com tampão de bloqueio por uma hora a 30 graus Celsius.Em seguida, incubar os tecidos com a solução de anticorpos primários por pelo menos três horas em temperatura ambiente ou 37 graus Celsius. Após a incubação, lave o tecido três vezes com tampão de bloqueio e incuba-o em solução secundária de anticorpos por pelo menos uma hora em temperatura ambiente, ou 37 graus Celsius. Repita as lavagens com o buffer de bloqueio e realize imagens fluorescentes, usando um microscópio convencional de campo largo ou outro sistema de imagem de escolha.Prepare a solução de ancoragem de acordo com as instruções do manuscrito. Coloque os slides em uma placa de petri de 100 ml, encoste a solução de ancoragem sobre o tecido e incuba-os por pelo menos três horas em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a solução de gelagem de acordo com as instruções do manuscrito.Remova a solução de ancoragem em excesso da seção tecidual e coloque o slide de volta na placa de petri. Adicione a solução de gelagem fria fresca à amostra e incubar a mistura por trinta minutos, a quatro graus Celsius. Para construir uma câmara no slide ao redor da amostra, crie espaçadores cortando finamente pedaços de vidro de cobertura com uma faca de diamante.Fixar os espaçadores em ambos os lados do tecido com água e coloque cuidadosamente uma tampa de vidro sobre a lâmina, certificando-se de evitar prender bolhas de ar sobre o tecido. Em seguida, incubar a amostra a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado por duas horas. Remova a tampa da câmara de gelagem deslizando suavemente uma lâmina de barbear sob a mancha e levantando-a lentamente da superfície do gel.Corte o gel em branco ao redor do tecido para minimizar o volume, certificando-se de cortar o gel assimétricamente para acompanhar a orientação. Diluir Proteinase K um a duzentos em tampão de digestão, certificando-se de preparar solução suficiente para submergir completamente o gel. Em seguida, incubar a amostra com a solução em um recipiente fechado por três horas a 60 graus Celsius.Se a amostra não se soltar durante a digestão, use uma lâmina de barbear para removê-la suavemente. Use uma escova de tinta macia para transferir a amostra para 1X PBS em um recipiente compatível com o sistema de imagem desejado e grande o suficiente para acomodar o gel totalmente expandido. Lave a amostra em PBS por dez minutos e, se desejar, restainá-la com DAPI de 300 milimôlares.Expanda as amostras lavando a amostra com um volume excessivo de água dupla destilada três a cinco vezes por dez minutos por lavagem. Então, realize imagens de fluorescência. Se este protocolo for realizado com sucesso, as amostras aparecem como um gel plano e transparente após a homogeneização mecânica e podem se expandir por um fator de 3 a 4,5 na água.Uma amostra de rim FFPE de cinco micrômetros de espessura foi expandida 4,5 vezes, o que resultou em uma resolução de 63 nanômetros utilizando um objetivo de NA 0,95. O tecido foi então convertido em um formato compatível com patologia de expansão e manchado com anticorpos para Alpha Actinin 4 e Vimentin, DAPI para visualizar DNA nuclear, e Wheat Germa Glutenin para rotular carboidratos. A microscopia confocal do disco giratório foi então usada para a imagem do espécime.O tecido renal foi então totalmente expandido em água e imagem novamente. Rachaduras, distorções e perda de alvos rotulados podem ser resultado de ancoragem ou homogeneização inadequadas. Hematoxylin e eosina manchadas de tecido mamário normal foram tratados como uma amostra ffpe, expandida, rotulada com DAPI, e imageda em um microscópio confocal de disco giratório.Fatias de rim não fixadas e congeladas também foram processadas usando este protocolo. O tecido foi fixado em acetona fria e manchado com Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI e Wheat Germa Glutenin. Ao executar essa técnica, é importante lembrar que o tempo da etapa de gelação é fundamental.A gelação prematura pode causar distorções, limitar a expansão e resultar na perda de moléculas-alvo. Após este procedimento, a imagem fluorescente pode ser realizada em um microscópio após a digestão e expansão da amostra. O ExPath pode ser aplicado amplamente em patologias e além.Como permite aos pesquisadores visualizar detalhes sutis nas amostras de tecido de interesse. Portanto, pode ajudar os pesquisadores a obter novas percepções sobre a patogênese de doenças ou mecanismos de processos biológicos.

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Transformada de Fourier de alta definição infravermelho (FT-IR) espectroscópica por imagem das secções de tecidos humanos para a melhoria da Patologia

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Brown Human Tissue adiposo Depots automaticamente segmentada por Positron Emission Tomography / Tomografia Computadorizada e registrado ressonância magnética

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Uma técnica para biopsia de tecido adiposo Abdominal subcutâneo através de um método não-diatermia

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

Imagens de ultra-som 3D: rápida e econômica de morfometria do tecido músculo-esquelético

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Todo o corpo e quantificação Regional de ativo humano marrom tecido adiposo usando 18F-FDG PET-CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...