Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Эта работа была поддержана юридическим фондом университета Карнеги-Меллона (Y) и премией директора NIH New Innovator Award (DP2 OD025926-01 в Y).

1. Подготовка фондовых реагентов и решений
<ol><li>
Приготовьте компоненты раствора гелеобразующего. ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация раствора приведена в g/mL (w/v процент).<ol>
<li>Сделать следующие фондовые решения: 38% (w/v) акрилат натрия (SA), 50% (w/v) акриламид (AA), 2% (w/v) N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), и 29.2% (w/...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Здесь мы представляем протокол ExPath16, вариант proExM5, который может быть применен к наиболее распространенным типам клинических образцов биопсии, используемых в патологии, в том числе FFPE, H и E окрашенных, и свежезамороженных образцов на стеклянных слайдах. Преобр?...

Исследование молекулярной организации тканей в трехмерном (3D) контексте может дать новое понимание биологических функций и развития болезней. Тем не менее, эти наноразмерные среды выходят за рамки возможностей разрешения обычных дифракционных ограниченных микроскопов (200–300 нм), где минимальное разрешимое расстояние, d определяется d q  /NA. Здесь длина волны света и NA является численной диафрагмы (NA) системы визуализации. В последнее время прямая визуализация флуоресцентно маркированных молекул стала возможной благодаря недавно разработанным методам визуализации суперразрешения1,2,3,включая стимулирующее истощение выбросов (STED), фотоактивированная микроскопия локализации (PALM), стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и структурированная иллюминация микроскопии (SIM). Хотя эти методы визуализации произвели революцию в понимании биологической функции на наноуровне, на практике они часто полагаются на дорогостоящее и/или специализированное оборудование и этапы обработки изображений, могут иметь более медленное время приобретения по сравнению с обычные оптические изображения, требуют флюорофоров с конкретными характеристиками (например, возможность переключения фотографий и / или высокой фотостабильности). Кроме того, остается сложной задачей для выполнения 3D-супер-разрешение изображения на образцах тканей.
Микроскопия расширения (ExM), впервые введенная в 20154,обеспечивает альтернативное средство визуализации наноразмерных объектов (Злт;70 нм) путем физического расширения сохранившихся образцов, встроенных в набухаемый полиэлектролитовый гидрогель. Здесь ключевые биомолекулы и/или этикетки закреплены на месте в полимерной сети, которая может быть изотопно расширена после химической обработки. Поскольку физическое расширение увеличивает общее эффективное разрешение, молекулы, представляющие интерес, могут быть решены с помощью обычных систем визуализации с ограниченной дифракцией. С момента публикации оригинального протокола, где пользовательские синтезированные флуоресцентные этикетки были закреплены на полимерной сети4, новые стратегии были использованы для непосредственного якоря белков (задержка белка ExM, или proExM)5, 6,7,8,9 и РНК9,10,11,12 к гидрогелю, и увеличить физическое увеличение через итеративные расширение13 или адаптации гель химии8,14,15.
Здесь мы представляем адаптированную версию proExM, называемую патологией расширения (ExPath)16, которая была оптимизирована для форматов клинической патологии. Протокол преобразует клинические образцы, в том числе формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE), гематоксилин и эозин (H и E) окрашенных, и свежезамороженных человеческих тканей образцов, установленных на стеклянных слайдах, в состояние, совместимое с ExM. Белки затем прикрепляется к гидрогелю и выполняется механическая гомогенизация(рисунок 1)16. С 4-кратным линейным расширением образцов, многоцветные супер-разрешение (70 нм) изображения могут быть получены с помощью обычного конфокального микроскопа, имеющего только разрешение в 300 нм, а также могут быть объединены с другими методами визуализации супер-разрешения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

В современной патологии оптическая микроскопия играет важную роль в диагностике заболеваний, выявляя микроскопические структуры клинических образцов. Однако фундаментальный предел физической дифракции предотвращает допрос наномасштабной анатомии и тонкие патологические изменения при использовании обычных оптических подходов к визуализации. Здесь мы описываем простой и недорогой протокол, называемый патологией расширения (ExPath), для наномасштабного оптического изображения общих типов клинических образцов первичной ткани, включая как фиксированные замороженные или формалин-фиксированный парафин встроенные (FFPE) ткани Разделы. Этот метод обходит предел оптической дифракции путем химического преобразования образцов тканей в гибрид ткани-гидрогеля и физически расширяя их изотрополено через несколько масштабов в чистой воде. Благодаря расширению, ранее неразрешимые молекулы отделяются и, таким образом, могут наблюдаться с помощью обычного оптического микроскопа.

Если протокол был успешно выполнен(рисунок 1), образцы будут отображаться как плоский и прозрачный гель после механической гомогенизации(рисунок 3A) и может расшириться в 3-4,5x в воде(рисунок 3B), обеспечение эффективного р?...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Наноразмерная визуализация образцов клинических тканей может улучшить понимание патогенеза болезни. Расширение патологии (ExPath) является версия расширения микроскопии (ExM), модифицированный для совместимости со стандартными клиническими образцами ткани, для изучения наномасштабной конфигурации биомолекул с помощью обычных дифракционных ограниченных микроскопов.

Наноскопическое изображение секций тканей человека с помощью физического и изотропного расширения

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Мы представляем патологию расширения, или ExPath для краткости, низкой стоимости измерения изображения биомолекулы интерес в стандартных клинических секций тканей, с наномасштабной точностью. ExPath обходит предел дифракции обычной световой микроскопии, химически вливая клиническую секцию ткани с водяным набухающим гидрогелем, а затем физически и равномерно расширяя обработанные образцы примерно в сто раз, позволяя ранее перекрываемым флуоресцентно помеченным биомолекулам отделяться и наблюдаться с помощью обычного оптического микроскопа. ExPath позволяет пользователям изучать наномасштабные конфигурации биомолекул, связанных с болезнями, в образцах тканей без необходимости вкладывать средства в новое оборудование для визуализации.Таким образом, что позволяет новые идеи болезни и содействия новой диагностики. Этот метод может быть применен к широкому спектру типов тканей и использоваться для получения нового понимания патогенеза различных сложных заболеваний, таких как рак, болезни мозга, аутоиммунные заболевания и другие. Визуальная демонстрация важна, чтобы проиллюстрировать, как сделать критические шаги должным образом, такие как строительство камеры мерин и обработки гелеобразного образца до и после пищеварения Proteinase K.Начните с преобразования ткани, представляющих интерес, в совместимый формат ExPath. При работе с клиническими образцами FFPE поместите слайд с образцом в 50 мл конической трубки и добавьте 15 мл зилена. Крышка трубки и поместите его горизонтально на орбитальный шейкер примерно в 60 об/мин в течение трех минут.Повторите стирку еще 15 мл Зилена. Затем вымойте слайд в серии разбавлений этанола, в соответствии с рукописными указаниями. Если вы работаете с окрашенными и установленными постоянными слайдами, поместите каждый слайд в коническую трубку 50 мл, а затем накройте его зиленом.Аккуратно снимите крышку скольжения с лезвием бритвы. Затем обработать слайд так же, как клинические образцы FFPE. Если вы работаете с нефиксированными замороженными слайдами ткани в растворе OCT, зафиксните ткань в ацетоне при 20 градусах по Цельсию в течение десяти минут, затем промойте образцы раствором 1X PBS три раза в течение десяти минут за стирку.Если обработка ранее фиксированных и замороженных клинических образцов, оставить слайды в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы расплавить внебиржевой раствор, а затем мыть образец с 1X PBS три раза, в течение пяти минут за стирку. После преобразования формата выполните поиск антигена на всех образцах. Нагрейте 20 миллимолейных цитратовую раствор до 100 градусов по Цельсию в микроволновой печи и поместите слайд в раствор.Немедленно перенесите контейнер в инкубационую камеру и инкубировать его при 60 градусах по Цельсию в течение тридцати минут. Чтобы испачкать образец, используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать границу вокруг секции ткани на слайде. Поместите слайд в чашку Петри, затем инкубировать ткани с блокирующим буфером в течение одного часа при 30 градусах по Цельсию.Затем инкубировать ткани с первичным раствором антитела, по крайней мере три часа при комнатной температуре или 37 градусов по Цельсию. После инкубации, мыть ткани три раза с блокирующим буфером, и инкубировать его во вторичном растворе антитела, по крайней мере один час при комнатной температуре, или 37 градусов по Цельсию. Повторите мойки с блокирующим буфером, затем выполните флуоресцентную визуализацию, используя обычный широко полевой микроскоп или другую систему визуализации по выбору.Подготовь якорное решение в соответствии с рукописными инструкциями. Поместите горки в чашку Петри 100 мл, завяйте якорный раствор над тканью и инкубировать их в течение по крайней мере трех часов при комнатной температуре. Затем подготовь решение для выгеля в соответствии с рукописными указаниями.Удалите избыток якорного раствора из секции ткани и поместите слайд обратно в чашку Петри. Добавьте свежий холодный мерин раствор в образец и инкубировать смесь в течение тридцати минут, при четырех градусах по Цельсию. Чтобы построить камеру на слайде вокруг образца, создайте спейсеры, тонко разрезая кусочки крышки стекла алмазным ножом.Защистите проемы по обе стороны ткани водой и аккуратно поместите крышку крышки крышки над горкой, убедившись, что избежать захвата пузырьков воздуха над тканью. Затем инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию во влажной среде в течение двух часов. Снимите крышку камеры мерин, аккуратно сдвинув лезвие бритвы под крышкой и медленно поднимая его с поверхности геля.Обрезать пустой гель вокруг ткани, чтобы свести к минимуму объем, убедившись, что сократить гель асимметрично отслеживать ориентацию. Разбавить Proteinase K от одной до двухсот в буфер пищеварения, убедившись, что подготовить достаточное решение, чтобы полностью погрузить гель. Затем инкубировать образец раствором в закрытом контейнере в течение трех часов при 60 градусах по Цельсию.Если образец не отделяется во время пищеварения, используйте лезвие бритвы, чтобы аккуратно удалить его. Используйте мягкую кисть для передачи образца в 1X PBS в контейнере, совместимом с желаемой системой визуализации и достаточно большом для размещения полностью расширенного геля. Вымойте образец в PBS в течение десяти минут и при желании переутомите его 300 миллимолярдом DAPI.Расширьте образцы путем мытья образца с избыточным объемом двойной дистиллированной воды три-пять раз в течение десяти минут за стирку. Затем выполняем флуоресценцию. Если этот протокол выполняется успешно, образцы появляются как плоский и прозрачный гель после механической гомогенизации и может расширяться в 3-4,5 раза в воде.Образец почки FFPE толщиной в пять микрометров был расширен в 4,5 раза, в результате чего разрешение составило 63 нанометров с использованием цели 0,95 н.е. Ткань затем была преобразована в расширение патологии совместимый формат и окрашенные антителами для Альфа Актинин 4 и Vimentin, DAPI для визуализации ядерной ДНК, и пшеница Germa Glutenin для обозначения углеводов. Для изображения образца затем использовалась конфокальцированная микроскопия спиннингового диска.Затем почечная ткань была полностью расширена в воде и снова изображена. Крекинг, искажения и потеря помеченных целей могут быть результатом недостаточной закрепления или гомогенизации. Гематоксилин и эозин окрашенных нормальной ткани молочной железы рассматривается как образец FFPE, расширенный, помечены DAPI, и изображены на вращающемся диске конфокального микроскопа.Нефиксированные и замороженные ломтики почек также были обработаны с помощью этого протокола. Ткань была зафиксирована в холодном ацетоне и окрашена альфа-актинином 4, виментином, DAPI и пшеничной гермой Глюнин. При выполнении этого метода, важно помнить, сроки шага геля имеет решающее значение.Преждевременное гелеобразование может вызвать искажения, ограничить расширение и привести к потере молекул-мишеней. После этой процедуры флуоресцентная визуализация может быть выполнена на микроскопе после пищеварения и расширения образца. ExPath может быть широко применен как в патологиях, так и за его пределами.Как это позволяет исследователям визуализировать тонкие детали в образцах тканей, представляющих интерес. Таким образом, это может помочь исследователям получить новые идеи в патогенеза заболеваний или механизмов биологических процессов.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Ортотопическая Глиобластома мышь Модель Поддержание Мозг паренхимы физических ограничений и подходит для прижизненной Двухфотонное микроскопии

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Черенкова Люминесценция Визуализация межлопаточной бурой жировой ткани

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

МРТ Отображение цереброваскулярной реактивности с помощью вдыхания газа вызовы

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Преобразование Фурье высокой четкости инфракрасного (ИК-Фурье) спектральные визуализации тканей человека разделах, направленные на совершенствование патологии

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Человек бурой жировой ткани склады Автоматически Географическая позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии и регистрации Магнитно-резонансная Изображения

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Техника для подкожной жировой ткани брюшной биопсии через метод Non диатермия

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D УЗИ: быстрый и экономически морфометрия костно-мышечной ткани

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Всего тела и региональных количественного определения активного человека коричневый жировой ткани с помощью 18F-ФДГ ПЭТ/КТ

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Метод, свободный от ферментов для изоляции и расширения человеческих адипосальных стволовых клеток

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Оптическая очистка и визуализация иммуномаркированных тканей почек

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...