Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
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Este trabajo fue apoyado por el fondo de start-up de la Facultad de la Universidad Carnegie Mellon (YZ) y el Nuevo Premio Innovador del Director de NIH (DP2 OD025926-01 a YZ).

1. Preparación de reactivos y soluciones de stock
<ol><li>
Prepare los componentes de la solución gelificante. NOTA: Las concentraciones de solución se indican en g/mL (p/v por ciento).<ol>
<li>Realice las siguientes soluciones de stock: 38% (p/v) acrilato de sodio (SA), 50% (p/v) acrilamida (AA), 2% (p/v) N,N-metilenbisacrilamida (Bis) y 29,2% (p/v) cloruro de sodio (NaCl). Disolver los compuestos en agua doblemente desionizada (ddH2O). Utilice los importes de la Tabla 1</stro...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Aquí, presentamos el protocolo ExPath16,una variante de proExM5 que se puede aplicar a los tipos más comunes de muestras de biopsia clínica utilizadas en patología, incluyendo FFPE, H&E y muestras congeladas frescas en diapositivas de vidrio. La conversión de formatos, la recuperación de antígenos y la inmunomanchación de las muestras siguen protocolos comúnmente utilizados que no son específicos de ExPath. A diferencia del protocolo proExM original<sup class="xre...

Investigar la organización molecular de los tejidos en un contexto tridimensional (3D) puede proporcionar una nueva comprensión de las funciones biológicas y el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, estos entornos a nanoescala están más allá de las capacidades de resolución de los microscopios limitados de difracción convencionales (200-300 nm), donde la distancia mínima resuelta, d se define por d  a/NA. Aquí está la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica (NA) del sistema de imágenes. Recientemente, la visualización directa de moléculas etiquetadas fluorescentes ha sido posible gracias a las técnicas de imagen de superresolución recientemente desarrolladas1,2,3, incluyendo el agotamiento de emisiones estimulada (STED), microscopía de localización fotoactivada (PALM), microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y microscopía de iluminación estructurada (SIM). Aunque estas técnicas de imagen han revolucionado la comprensión de la función biológica a escala nanométrica, en la práctica, a menudo se basan en equipos costosos y/o especializados y pasos de procesamiento de imágenes, pueden tener un tiempo de adquisición más lento en comparación con imágenes ópticas convencionales, requieren fluoróforos con características específicas (como la capacidad de fotoconmutación y/o alta fotoestabilidad). Además, sigue siendo un desafío realizar imágenes de superresolución 3D en muestras de tejido.
La microscopía de expansión (ExM), introducida por primera vez en 20154, proporciona un medio alternativo de imagen de características a nanoescala (<70 nm) mediante la expansión física de muestras conservadas incrustadas en un hidrogel de polielectrolito hinchable. Aquí, las biomoléculas clave y/o las etiquetas están ancladas in situ a una red de polímeros que se puede expandir isotópicamente después del procesamiento químico. Debido a que la expansión física aumenta la resolución efectiva total, las moléculas de interés se pueden resolver utilizando sistemas de imágenes convencionales con limitación de difracción. Desde la publicación del protocolo original, donde las etiquetas fluorescentes sintetizadas a medida estaban ancladas a la red de polímeros4, se han utilizado nuevas estrategias para anclar directamente proteínas (retención de proteínas ExM, o proExM)5, 6,7,8,9 y ARN9,10,11,12 al hidrogel, y aumentar el aumento físico a través de la iteración expansión13 o adaptación de la química de gel8,14,15.
Aquí presentamos una versión adaptada de proExM, llamada patología de expansión (ExPath)16,que ha sido optimizada para formatos de patología clínica. El protocolo convierte muestras clínicas, incluyendo parafina incrustada en parafina fija de formalina (FFPE), teñidas de hematoxilina y eosina (H&E), y muestras de tejido humano recién congeladas montadas en diapositivas de vidrio, en un estado compatible con ExM. Las proteínas se anclan al hidrogel y se realiza la homogeneización mecánica (Figura 1)16. Con una expansión lineal de 4 veces de las muestras, las imágenes multicolores de superresolución (70 nm) se pueden obtener utilizando un microscopio confocal convencional con una resolución de sólo 300 nm y también se pueden combinar con otras técnicas de imagen de superresolución.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

En la patología moderna, la microscopía óptica desempeña un papel importante en el diagnóstico de enfermedades al revelar estructuras microscópicas de muestras clínicas. Sin embargo, el límite fundamental de difracción física impide el interrogatorio de la anatomía a nanoescala y los cambios patológicos sutiles cuando se utilizan enfoques de imágenes ópticas convencionales. Aquí, describimos un protocolo simple y barato, llamado patología de expansión (ExPath), para imágenes ópticas a nanoescala de tipos comunes de muestras de tejido primario clínico, incluyendo tejido de parafina incrustada fija o fija de formalina (FFPE) Secciones. Este método elude el límite de difracción óptica transformando químicamente las muestras de tejido en híbridos de tejido-hidrogel y expandiéndolas físicamente isotrópicamente a través de múltiples escalas en agua pura. Debido a la expansión, las moléculas previamente irresueltas se separan y por lo tanto se pueden observar utilizando un microscopio óptico convencional.

Si el protocolo se ha llevado a cabo con éxito(Figura 1), las muestras aparecerán como un gel plano y transparente después de la homogeneización mecánica(Figura 3A) y pueden expandirse por un factor de 3 a 4,5x en agua(Figura 3B), proporcionando una resolución efectiva de 70 nm dependiendo del factor de expansión final y el sistema de imágenes utilizado5,<s...

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Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Las imágenes a nanoescala de muestras de tejido clínico pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. La patología de expansión (ExPath) es una versión de la microscopía de expansión (ExM), modificada por compatibilidad con muestras de tejido sortea estándar, para explorar la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios limitados de difracción convencional.

Imágenes nanoscópicas de secciones de tejido humano a través de la expansión física e isotrópica

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Estamos presentando patología de expansión, o ExPath para abreviar, una medida de bajo costo para imaginar biomolécula de interés en las secciones estándar de tejido clínico, con precisión a nanoescala. ExPath elude el límite de difracción de la microscopía de luz convencional al infundir químicamente la sección del tejido clínico con un hidrogel inflamable del agua, y luego expandir física y uniformemente las muestras tratadas en alrededor de cien veces, permitiendo que las biomoléculas previamente superpuestas se separen y observen con un microscopio óptico convencional. ExPath permite a los usuarios estudiar configuraciones a nanoescala de biomoléculas relacionadas con enfermedades en muestras de tejido, sin necesidad de invertir en nuevo hardware de imágenes.Por lo tanto, permitiendo nuevos conocimientos de la enfermedad y fomentando un nuevo diagnóstico. Este método se puede aplicar a una amplia gama de tipos de tejido y se puede utilizar para proporcionar una nueva visión de la patogénesis de varias enfermedades complejas, como el cáncer, enfermedad cerebral, enfermedad autoinmune, y otros. La demostración visual es importante para ilustrar cómo hacer los pasos críticos correctamente, como la construcción de la cámara de geling y el manejo de la muestra gelificada antes y después de la digestión de Proteinase K.Comience convirtiendo el tejido de interés en un formato compatible con ExPath. Si trabaja con muestras clínicas FFPE, coloque la diapositiva con la muestra en un tubo cónico de 50 ml y agregue 15 ml de Zylene. Tapa el tubo y colócalo horizontalmente sobre un agitador orbital aproximadamente a las 60 rpm durante tres minutos.Repita el lavado con otros 15 ml de Zylene. A continuación, lave la diapositiva en una serie de diluciones de etanol, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Si trabaja con diapositivas permanentes manchadas y montadas, coloque cada diapositiva en un tubo cónico de 50 ml y, a continuación, cúbrala con Zylene.Retire con cuidado el resbalón de la cubierta con una cuchilla de afeitar. A continuación, procese la diapositiva de la misma manera que las muestras clínicas FFPE. Si trabaja con diapositivas de tejido congelado sin fijar en solución OCT, fije el tejido en acetona a 20 grados Celsius durante diez minutos y, a continuación, lave las muestras con 1X de solución PBS tres veces durante diez minutos por lavado.Si procesa muestras clínicas previamente fijas y congeladas, deje los portaobjetos durante dos minutos a temperatura ambiente para derretir la solución OTC y, a continuación, lave la muestra con 1X PBS tres veces, durante cinco minutos por lavado. Después de la conversión de formato, realice la recuperación de antígenos en todas las muestras. Caliente la solución de citrato de 20 milimolares a 100 grados centígrados en un microondas y coloque el portaobjetos en la solución.Transfiera inmediatamente el recipiente a una cámara de incubación e i incubarlo a 60 grados centígrados durante treinta minutos. Para manchar la muestra, utilice una pluma hidrófoba para dibujar un límite alrededor de la sección de tejido en la diapositiva. Coloque el portaobjetos en una placa de petri, luego incuba el tejido con tampón de bloqueo durante una hora a 30 grados Centígrados.Luego, incubar los tejidos con la solución primaria de anticuerpos durante al menos tres horas a temperatura ambiente o 37 grados celsius. Después de la incubación, lave el tejido tres veces con tampón de bloqueo e iclerelo en solución secundaria de anticuerpos durante al menos una hora a temperatura ambiente, o 37 grados centígrados. Repita los lavados con el búfer de bloqueo y, a continuación, realice imágenes fluorescentes, utilizando un microscopio convencional de campo ancho u otro sistema de imágenes de su elección.Preparar la solución de anclaje de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Coloque los portaobjetos en un plato de petri de 100 ml, entucle la solución de anclaje sobre el tejido e in incubarlos durante al menos tres horas a temperatura ambiente. A continuación, prepare la solución gelificante de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Retire el exceso de solución de anclaje de la sección de tejido y vuelva a colocar la diapositiva en la placa de petri. Añadir solución gelificante fría fresca a la muestra e incubar la mezcla durante treinta minutos, a cuatro grados centígrados. Para construir una cámara en el tobogán alrededor de la muestra, cree espaciadores cortando trozos de vidrio de cubierta con un cuchillo de diamante.Asegure los espaciadores a cada lado del tejido con agua y coloque cuidadosamente una tapa de tapa sobre el portaobjetos, asegurándose de evitar atrapar burbujas de aire sobre el tejido. Luego, incubar la muestra a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado durante dos horas. Retire la tapa de la cámara de geling deslizando suavemente una cuchilla de afeitar debajo del cubreobjetos y levantándola lentamente de la superficie del gel.Recorte el gel en blanco alrededor del tejido para minimizar el volumen, asegurándose de cortar el gel de forma asimétrica para realizar un seguimiento de la orientación. Diluir Proteinase K de uno a doscientos en tampón de digestión, asegurándose de preparar la solución suficiente para sumergir completamente el gel. A continuación, incubar la muestra con la solución en un recipiente cerrado durante tres horas a 60 grados centígrados.Si la muestra no se desprende durante la digestión, utilice una cuchilla de afeitar para extraerla suavemente. Utilice un pincel suave para transferir la muestra a 1X PBS en un recipiente compatible con el sistema de imágenes deseado y lo suficientemente grande como para acomodar el gel completamente expandido. Lavar la muestra en PBS durante diez minutos y si lo desea descansar con 300 DAPI mililolares.Expanda las muestras lavando la muestra con un volumen excesivo de agua destilada doble de tres a cinco veces durante diez minutos por lavado. A continuación, realice imágenes de fluorescencia. Si este protocolo se realiza con éxito, las muestras aparecen como un gel plano y transparente después de la homogeneización mecánica y pueden expandirse por un factor de 3 a 4,5 en agua.Una muestra renal FFPE de cinco micrómetros de espesor se amplió 4,5 veces, lo que resultó en una resolución de 63 nanómetros utilizando un objetivo de 0,95 NA. El tejido se convirtió entonces en un formato compatible con la patología de expansión y se tiñeba de anticuerpos para Alpha Actinin 4 y Vimentin, DAPI para visualizar el ADN nuclear, y Wheat Germa Glutenin para etiquetar carbohidratos. A continuación, se utilizó una microscopía confocal de disco giratorio para crear imágenes de la muestra.El tejido renal se expandió por completo en agua y se volvió a imaginar. El agrietamiento, las distorsiones y la pérdida de objetivos etiquetados pueden ser el resultado de un anclaje o homogeneización inadecuados. La hematoxilina y la eosina mancharon el tejido mamario normal se trataron como una muestra de FFPE, se expandió, se etiquetó con DAPI y se tomó una imagen en un microscopio confocal de disco giratorio.Las rodajas de riñón no fijadas y congeladas también se procesaron utilizando este protocolo. El tejido se fijó en acetona fría y se tiñe con Alfa Actinin 4, Vimentin, DAPI, y Wheat Germa Glutenin. Al realizar esta técnica, es importante recordar que el momento del paso de gelación es crítico.La geleración prematura puede causar distorsiones, limitar la expansión y provocar la pérdida de moléculas diana. Después de este procedimiento, se pueden realizar imágenes fluorescentes en un microscopio después de la digestión y expansión de la muestra. ExPath se puede aplicar ampliamente tanto en patologías como más allá.Como permite a los investigadores visualizar detalles sutiles en las muestras de tejido de interés. Por lo tanto, puede ayudar a los investigadores a obtener nuevos conocimientos sobre la patogénesis de enfermedades o mecanismos de procesos biológicos.

Research

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Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Depósitos de tejido adiposo humano Marrón segmentada automáticamente por Tomografía por Emisión de Positrones / Tomografía Computada y Resonancia Registrado Imágenes Magnéticas

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Una técnica para biopsia de tejido adiposo Abdominal subcutáneo mediante un método no-diatermia

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

Proyección de imagen de ultrasonido 3D: morfometría rápida y rentable de tejido músculo-esquelético

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Cuerpo entero y cuantificación Regional de activo humano marrón tejido adiposo utilizando 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Un método libre de enzimas para el aislamiento y la expansión de las células madre mesenquimales derivadas de adiposo humano

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...