Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Detta arbete stöddes av fakultetens start fond från Carnegie Mellon University (YZ) och NIH Director ' s New Innovator Award (DP2 OD025926-01 till YZ).

1. beredning av stam reagenser och lösningar
<ol><li>
Förbered gelbildande-lösningskomponenter. Obs: lösningskoncentrationer ges i g/ml (w/v procent).<ol>
<li>Gör följande lagerlösningar: 38% (w/v) natriumakrylat (SA), 50% (w/v) akrylamid (AA), 2% (w/v) N, N′-methylenebisacrylamide (BIS), och 29,2% (w/v) natriumklorid (NaCl). Lös upp föreningarna i dubbelt avjoniserat vatten (ddH2O). Använd beloppen i tabell 1 som referens. beredda lösningar kan skalas upp el...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Här presenterar vi ExPath protokoll16, en variant av proExM5 som kan appliceras på de vanligaste typerna av kliniska biopsi prover som används i patologi, inklusive ffpe, H & E färgade, och färska frysta exemplar på glas diabilder. Format konvertering, antigen hämtning och immunofärgning av proverna följer vanliga protokoll som inte är specifika för ExPath. Till skillnad från den ursprungliga proExM protokoll9, expath förlitar sig på en...

Undersöka den molekylära organisationen av vävnader i en tredimensionell (3D) sammanhang kan ge ny förståelse för biologiska funktioner och sjukdomsutveckling. Dessa nanoskaliga miljöer ligger dock bortom upplösningen hos konventionella diffraktions begränsade Mikroskop (200 − 300 nm), där det minimala matchbara avståndet, d definieras av d α  λ/na. Här är λ våglängden av ljus och na är den numeriska bländare (na) i bildsystemet. Nyligen har direkt visualisering av fluorescerande märkta molekyler möjliggjorts genom nyutvecklade super-resolution Imaging tekniker1,2,3, inklusive stimulerad emission utarmning (sted), fotoaktive rad lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruktion, mikroskopi (STORM) och strukturerad belysningsmikroskopi (SIM). Även om dessa avbildningstekniker har revolutionerat förståelsen av biologisk funktion i nanoskalan, i praktiken förlitar de sig ofta på dyr och/eller specialiserad utrustning och bildbehandlings steg, kan ha långsammare förvärvs tid jämfört med konventionell optisk avbildning, kräver fluoroforer med specifika egenskaper (t. ex. foto växlings förmåga och/eller hög foto stabilitet). Dessutom är det fortfarande en utmaning att utföra 3D super-upplösning Imaging på vävnadsprover.
Expansion mikroskopi (EXM), som först infördes i 20154, ger ett alternativt sätt att Imaging nanoskala funktioner (< 70 nm) genom att fysiskt utvidga bevarade prover inbäddade i en väll polyelektrolyt hydrogel. Här är viktiga biomolekyler och/eller etiketter förankrade på plats till ett polymernät som kan utökas isotopiskt efter kemisk bearbetning. Eftersom den fysiska expansionen ökar den totala effektiva upplösningen kan molekyler av intresse sedan lösas med konventionella diffraktions-begränsade avbildningssystem. Sedan offentliggörandet av det ursprungliga protokollet, där anpassade syntetiserade fluorescerande etiketter var förankrade till polymer Network4, nya strategier har använts för att direkt förankra proteiner (protein retention EXM, eller proExM)5, 6,7,8,9 och RNA9,10,11,12 till Hydrogelen och öka den fysiska förstoringen genom iterativ expansion13 eller anpassning av gel kemin8,14,15.
Här presenterar vi en anpassad version av proExM, kallad expansion patologi (ExPath)16, som har optimerats för kliniska patologi format. Protokollet omvandlar kliniska prover, inklusive formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE), hematoxylin och eosin (H & E) färgade, och färskt frysta mänskliga vävnadsprover monterade på glas diabilder, i en stat som är kompatibel med ExM. Proteiner är sedan förankrade till hydrogel och mekanisk homogenisering utförs (figur 1)16. Med en 4-faldig linjär expansion av proverna, Multicolor super-resolution (~ 70 nm) bilder kan erhållas med hjälp av en konventionell konfokal Mikroskop med endast en ~ 300 nm upplösning och kan också kombineras med andra super-upplösning Imaging tekniker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

I modern patologi spelar optisk mikroskopi en viktig roll vid sjukdomsdiagnos genom att avslöja mikroskopiska strukturer av kliniska prover. Men den grundläggande fysiska diffraktionsgränsen förhindrar förhör av nanoskala anatomi och subtila patologiska förändringar när man använder konventionella optiska Imaging metoder. Här beskriver vi ett enkelt och billigt protokoll, kallad expansion patologi (ExPath), för nanoskala optisk avbildning av vanliga typer av kliniska primär vävnad prover, inklusive både fast frysta eller formalin-fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnad Sektioner. Denna metod kringtar den optiska diffraktionsgränsen genom att kemiskt omvandla vävnadsproverna till vävnad-hydrogel hybrid och fysiskt utvidga dem isotropically över flera skalor i rent vatten. På grund av expansion separeras tidigare oresolvable molekyler och kan därför observeras med hjälp av ett konventionellt optiskt mikroskop.

Om protokollet har genomförts framgångsrikt (figur 1), kommer proverna att visas som en platt och transparent gel efter mekanisk homogenisering (figur 3a) och kan utökas med en faktor på 3 − 4,5 x i vatten (figur 3B). ger en effektiv upplösning på ~ 70 nm beroende på den slutliga expansions faktorn och Imaging system som används5,16</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Nanoskalig avbildning av kliniska vävnadsprover kan förbättra förståelsen av sjukdomens patogenes. Expansion patologi är en version av expansionsmikroskopi (ExM), modifierad för kompatibilitet med vanliga kliniska vävnadsprover, för att utforska nanoskalens konfiguration av biomolekyler med konventionella diffraktions begränsade Mikroskop.

Nanoskopisk avbildning av mänskliga vävnads sektioner via fysisk och isotropisk expansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Vi presenterar expansion patologi, eller ExPath för korta, en låg kostnad åtgärd för att bilden biomolekyl av intresse i standarden kliniska vävnadssektioner, med nanoskala precision. ExPath kringgår diffraktionsgränsen för konventionell ljusmikroskopi genom att kemiskt infundera den kliniska vävnadssektionen med en vattensvälld hydrogel, och sedan fysiskt och jämnt utöka de behandlade proverna med cirka hundra gånger, vilket gör att tidigare överlappade fluorescerande märkta biomolekyler kan separeras och observeras med ett konventionellt optiskt mikroskop. ExPath tillåter användare att studera nano skala konfigurationer av sjukdomsrelaterade biomolekyler i vävnadsprover, utan att behöva investera i ny bildframställning hårdvara.Således, möjliggör nya insikter av sjukdomen och främja ny diagnos. Denna metod kan tillämpas på ett brett spektrum av vävnadstyper och användas för att ge ny insikt i patogenesen vid olika komplexa sjukdomar, såsom cancer, hjärnsjukdom, autoimmun sjukdom, och andra. Visuell demonstration är viktig för att illustrera hur man gör de kritiska stegen ordentligt, såsom konstruktion av geleringskammaren och hantering av geledprovet före och efter Proteinase K-matsmältning.Börja med att omvandla den vävnad av intresse till ett ExPath-kompatibelt format. Om du arbetar med FFPE kliniska prover, placera bilden med provet i en 50ml koniska rör och tillsätt 15ml av Zylene. Kapa röret och placera det horisontellt på en orbital shaker vid cirka 60rpm i tre minuter.Upprepa tvätten med ytterligare 15 ml Zylene. Sedan tvätta bilden i en serie etanol utspädningar, enligt manuskript riktningar. Om du arbetar med färgade och monterade permanenta objektglas, placera varje objektglas i ett 50 ml koniskt rör, täck sedan över det med Zylene.Ta försiktigt bort täckslien med ett rakblad. Bearbeta sedan bilden på samma sätt som de kliniska proverna för FFPE. Om du arbetar med ofixerade frysta vävnadsrutschbanor i OCT-lösning, fixera vävnaden i aceton vid 20 grader Celsius i tio minuter, tvätta sedan proverna med 1X PBS-lösning tre gånger i tio minuter per tvätt.Om bearbetning av tidigare fasta och frysta kliniska prover, lämna objektglasen i två minuter vid rumstemperatur för att smälta OTC-lösningen, tvätta sedan provet med 1X PBS tre gånger, i fem minuter per tvätt. Efter formatkonvertering utför du antigenhämtning på alla prover. Värm 20 millimol Citrate-lösningen till 100 grader Celsius i en mikrovågsugn och placera objektglaset i lösningen.Omedelbart överföra behållaren till en inkubationskammare och inkubera den i 60 grader Celsius i trettio minuter. För att färga provet, använd en hydrofoba penna för att rita en gräns runt vävnadssektionen på bilden. Placera bilden i en petriskål och inkubera sedan vävnaden med blockerande buffert i en timme vid 30 grader Celsius.Därefter inkubera vävnaderna med den primära antikroppslösningen i minst tre timmar vid rumstemperatur eller 37 grader Celsius. Efter inkubationen, tvätta vävnaden tre gånger med blockerande buffert, och inkubera den i sekundär antikroppslösning i minst en timme vid rumstemperatur, eller 37 grader Celsius. Upprepa tvättarna med den blockerande bufferten och utför sedan fluorescerande avbildning, med hjälp av ett konventionellt brett fältmikroskop eller annat val av bildbehandling.Förbered förankringslösning enligt manuskriptinstruktioner. Placera objektglasen i en 100 ml petriskål, pipet förankringslösningen över vävnaden, och inkubera dem i minst tre timmar vid rumstemperatur. Sedan, förbereda gelning lösning enligt manuskriptet riktningar.Ta bort överflödig förankringslösning från vävnadsdelen och placera tillbaka glidglaset i petriskålen. Tillsätt färsk kall geleringslösning på provet och inkubera blandningen i trettio minuter, vid fyra grader Celsius. För att konstruera en kammare på glidningen runt provet, skapa distanser genom att tunt skära bitar av täckglas med en diamantkniv.Säkra distanserna på vardera sidan av vävnaden med vatten och försiktigt placera ett täckglas lock över bilden, se till att undvika att fånga luftbubblor över vävnaden. Sedan, inkubera provet vid 37 grader Celsius i en befuktad miljö i två timmar. Ta bort locket till geleringskammaren genom att försiktigt skjuta ett rakblad under täcket och långsamt lyfta bort det från gelytan.Trimma den tomma gelen runt vävnaden för att minimera volymen, se till att skära gelen asymmetriskt för att spåra orienteringen. Späd Proteinase K en till två hundra i matsmältningsbuffert, se till att förbereda tillräckligt med lösning för att helt dränka gelen. Därefter, inkubera provet med lösningen i en sluten behållare i tre timmar vid 60 grader Celsius.Om provet inte lossnar under matsmältningen, använd ett rakblad för att försiktigt ta bort det. Använd en mjuk färgpensel för att överföra preparatet till 1X PBS i en behållare som är kompatibel med önskat bildsystem och tillräckligt stort för att rymma den helt expanderade gelén. Tvätta provet i PBS i tio minuter och om så önskas restain det med 300 millimolar DAPI.Utöka proverna genom att tvätta provet med en överskottsvolym av dubbelt destillerat vatten tre till fem gånger i tio minuter per tvätt. Sedan, utföra fluorescens avbildning. Om detta protokoll utförs framgångsrikt, prover visas som en platt och transparent gel efter mekanisk homogenisering och kan expandera med en faktor på 3 till 4,5 i vatten.En fem mikrometer tjock FFPE njure prov utökades 4,5 gånger, vilket resulterade i en upplösning på 63 nanometer med hjälp av en 0,95 NA mål. Vävnaden omvandlades sedan till en expansion patologi kompatibelt format och färgas med antikroppar för Alpha Actinin 4 och Vimentin, DAPI att visualisera nukleära DNA, och Vete Germa Glutenin att märka kolhydrater. Spinning skiva confocal mikroskopi användes sedan för att bilden provet.Njurvävnaden var sedan helt expanderat i vatten och avbildas igen. Krackning, distorsioner och förlust av märkta mål kan vara resultatet av otillräcklig förankring eller homogenisering. Hematoxylin och eosin färgade normala bröst vävnad behandlades som en FFPE prov, utvidgas, märkt med DAPI och avbildas på en snurrande skiva confocal mikroskop.Ofixerade och frysta njurskivor bearbetades också med hjälp av detta protokoll. Vävnaden var fast i kall aceton och färgas med Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI, och Vete Germa Glutenin. När du utför denna teknik, är det viktigt att komma ihåg tidpunkten för gelation steg är kritisk.För tidig gelation kan orsaka distorsioner, begränsa expansion och resultera i förlust av målmolekyler. Efter denna procedur kan fluorescerande avbildning utföras på ett mikroskop efter matsmältning och utvidgning av provet. ExPath kan tillämpas brett i både patologier och därefter.Eftersom det gör det möjligt för forskare att visualisera subtila detaljer i vävnadsprover av intresse. Därför kan det hjälpa forskare att få nya insikter i patogenesen vid sjukdomar eller mekanismer för biologiska processer.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

En Orthotopic Glioblastoma musmodell Underhålla hjärnan parenkymal fysiska begränsningar och Passar Intravital Två-foton mikroskopi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov Luminiscens avbildning av interscapular Brun fettvävnad

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI Kartläggning av Cerebrovaskulär reaktivitet via Gas Inandning Utmaningar

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

HD-Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic avbildning av mänskliga vävnadssnitt mot Förbättra patologi

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Human brun fettvävnad Depåer Segmenterad Automatiskt genom positronemissionstomografi / datortomografi och Registrerade Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknik för subkutan buken fettvävnad biopsi via en icke-diatermi metod

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D ultraljud: snabb och kostnadseffektiv morfometri muskuloskeletala vävnad

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Hela kroppen och regionala kvantifiering av aktiva mänskliga brun fettvävnad använda 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

En enzym fri metod för isolering och expansion av humana adipose-härledda mesenkymala stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optisk clearing och avbildning av Immunolabeled njure vävnad

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...