Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Bu çalışma Carnegie Mellon Üniversitesi (YZ) ve NIH Direktörü'nün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2 OD025926-01'den YZ'ye) Fakülte Başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.

1. Stok Reaktifleri ve Çözümlerinin Hazırlanması
<ol><li>
Jelling çözeltisi bileşenlerini hazırlayın. NOT: Çözelti konsantrasyonları g/mL (w/v yüzde) olarak verilmiştir.<ol>
<li>Aşağıdaki stok çözeltileri yapın: %38 (w/v) sodyum akrilat (SA), %50 (w/v) akrilamid (AA), %2 (w/v) N,N′-methylenebisacrylamide (Bis) ve %29.2 (w/v) sodyum klorür (NaCl). Bileşikleri iki kat deiyonize suda çözün (ddH2O). Tablo 1'deki tutarları referans olarak kullanın...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Burada, ffpe, H&E vitray ve cam slaytlar üzerinde taze dondurulmuş numuneler de dahil olmak üzere patolojide kullanılan klinik biyopsi örneklerinin en yaygın türlerine uygulanabilen proExM5'in bir varyantı olan ExPathprotokol16'yısıyoruz. Biçim dönüştürme, antijen alımı ve örneklerin immünboyamı ExPath'e özgü olmayan yaygın olarak kullanılan protokolleri izler. Orijinal proExM protokolü aksine9, ExPath sindirim tampon EDTA da...

Dokuların moleküler organizasyonunun üç boyutlu (3D) bir bağlamda araştırılması, biyolojik fonksiyonlar ve hastalık gelişimi hakkında yeni bir anlayış sağlayabilir. Ancak, bu nano ölçekli ortamlar, en az çözülebilir uzaklığın d α λ / NA ile tanımlandığı konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskopların (200−300 nm) çözünürlük yeteneklerinin  ötesindedir. Burada λ ışığın dalga boyu ve NA görüntüleme sisteminin sayısal diyafram (NA) olduğunu. Son zamanlarda, floresan etiketli moleküllerin doğrudan görselleştirme mümkün yeni geliştirilen süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri1,2,3, uyarılmış emisyon tükenmesi de dahil olmak üzere (STED), foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM), stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM). Bu görüntüleme teknikleri nano ölçekte biyolojik fonksiyon anlayışında devrim yarattı, ancak pratikte, genellikle pahalı ve/veya özel ekipman ve görüntü işleme adımlarına güvenirler, geleneksel optik görüntüleme, belirli özelliklere sahip floroforlar gerektirir (fotoğraf anahtarlama yeteneği ve/veya yüksek fotostabilite gibi). Buna ek olarak, doku örnekleri üzerinde 3D süper çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmek için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir.
İlk olarak 20154yılında tanıtılan genleşme mikroskobu (ExM), şişme polielektrolit hidrojeline gömülü korunmuş numuneleri fiziksel olarak genişleterek nano ölçekli özellikleri (<70 nm) görüntülemede alternatif bir araç sağlar. Burada, anahtar biyomoleküller ve/veya etiketler, kimyasal işleme den sonra izotonik olarak genişletilebilen bir polimer ağa yerinde sabitlenir. Fiziksel genişleme toplam etkin çözünürlüğü arttırdığından, ilgi molekülleri geleneksel kırınım sınırlı görüntüleme sistemleri kullanılarak çözülebilir. Özel sentezlenmiş floresan etiketlerin polimer ağına bağlı olduğu orijinal protokolün yayınlanmasından bu yana4, proteinleri (protein tutma ExM veya proExM) doğrudan bağlamak için yeni stratejiler kullanılmıştır5, 6,7,8,9 ve RNA9,10,11,12 hidrojel için, ve yineleme ile fiziksel büyütme artırmak genişleme13 veya adapte jelkimyası 8,14,15.
Burada proExM'in genleşme patolojisi (ExPath)16olarak adlandırılan ve klinik patoloji biçimleri için optimize edilmiş uyarlanmış bir versiyonunu salıyoruz. Protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE), hemaoksilin ve eozin (H&E) lekeli ve cam slaytlara monte edilmiş taze dondurulmuş insan doku örnekleri dahil olmak üzere klinik örnekleri ExM ile uyumlu bir duruma dönüştürür. Proteinler daha sonra hidrojele sabitlenir ve mekanik homojenizasyon yapılır (Şekil 1)16. Numunelerin 4 kat lineer genişlemesi ile çok renkli süper çözünürlükte (~70 nm) görüntüler, sadece ~300 nm çözünürlüğe sahip geleneksel konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir ve diğer süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri ile de kombine edilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

Modern patolojide optik mikroskopi, klinik örneklerin mikroskobik yapılarını ortaya çıkararak hastalık tanısında önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, temel fiziksel kırınım sınırı geleneksel optik görüntüleme yaklaşımları kullanırken nanoölçekli anatomi ve ince patolojik değişikliklerin sorgulanmasını önler. Burada, hem sabit dondurulmuş hem de formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku dahil olmak üzere klinik primer doku örneklerinin ortak tiplerinin nano ölçekli optik görüntülemesi için genişleme patolojisi (ExPath) adı verilen basit ve ucuz bir protokolü tanımlıyoruz. Bölüm. Bu yöntem, doku örneklerini kimyasal olarak doku-hidrojel melezine dönüştürerek ve fiziksel olarak saf suda birden fazla pulda izole ederek optik kırınım sınırını aşar. Genişleme nedeniyle, daha önce çözülemeyen moleküller ayrılır ve böylece geleneksel optik mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir.

Protokol başarıyla uygulanmışsa(Şekil 1),numuneler mekanik homojenizasyondan sonra düz ve saydam bir jel olarak görünür (Şekil 3A) ve suda 3−4.5x faktörüile genişleyebilir (Şekil 3B), kullanılan son genleşme faktörü ve görüntüleme sistemine bağlı olarak ~70 nm etkin bir çözünürlük sağlayarak5,16. <strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Klinik doku örneklerinin nanoölçekli görüntülemesi hastalık patogenezinin anlaşılmasını iyileştirebilir. Genleşme patolojisi (ExPath), geleneksel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun araştırılması için standart klinik doku örnekleriile uyumluluk için modifiye edilen genleşme mikroskobunun (ExM) bir versiyonudur.

Fiziksel ve İzotropik Genişleme Yoluyla İnsan Doku Bölümlerinin Nanoskobik Görüntülemesi

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Nano ölçekli hassasiyetle, standart klinik doku bölümlerinde ilgi görüntü biyomolekülü için düşük maliyetli bir ölçüm, kısa genişleme patolojisi veya ExPath sıyoruz. ExPath, klinik doku bölümünü su yla şişme hidrojel ile kimyasal olarak aşılayarak ve daha sonra tedavi edilen numuneleri yaklaşık yüz kat genişleterek geleneksel ışık mikroskobunun kırınım sınırını aşarak, daha önce çakışan flüoressentetiketli biyomoleküllerin geleneksel optik mikroskopla ayrılmasını ve gözlemlemesine olanak sağlar. ExPath kullanıcıların yeni görüntüleme donanımyatırım gerek kalmadan, doku örneklerinde hastalık ile ilgili biyomoleküllerin nano ölçekli yapılandırmaları çalışma sağlar.Böylece, hastalığın yeni anlayışlar sağlayan ve yeni tanı teşvik. Bu yöntem doku tipleri geniş bir dizi uygulanabilir ve kanser, beyin hastalığı, oto-immün hastalık gibi çeşitli karmaşık hastalıkların patogenezi içine yeni bir fikir sağlamak için kullanılabilir, ve diğerleri. Görsel gösteri, jelleme odasının inşası ve Proteinaz K sindiriminden önce ve sonra jellenmiş numunenin işlenmesi gibi kritik adımların doğru şekilde nasıl atılılabildiğini göstermek için önemlidir.İlgi alan dokuyu ExPath uyumlu bir biçime dönüştürerek başlayın. FFPE klinik numuneleri ile çalışıyorsanız, 50ml konik bir tüp içinde örnek ile slayt yerleştirin ve Zylene 15ml ekleyin. Tüpü kaplayın ve yaklaşık 60rpm'de üç dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcının üzerine yatay olarak yerleştirin.Zylene başka bir 15 ml ile yıkama tekrarlayın. Sonra el yazması talimatlara göre, Etanol seyreltme bir dizi slayt yıkayın. Lekeli ve monte kalıcı slaytlar ile çalışıyorsanız, 50ml konik tüp her slayt yerleştirin, sonra Zylene ile kaplayın.Bir jilet ile kapak fişini dikkatlice çıkarın. Daha sonra, ffpe klinik örnekleri ile aynı şekilde slayt süreci. OCT çözeltisinde sabitlenmemiş dondurulmuş doku slaytları ile çalışıyorsanız, aseton doku düzeltmek 20 santigrat on dakika, sonra yıkama başına on dakika boyunca 1X PBS çözeltisi ile üç kez 1X PBS çözeltisi ile yıkama.Daha önce sabit ve dondurulmuş klinik numuneleri işliyorsanız, OTC çözeltisini eritmek için slaytları oda sıcaklığında iki dakika bekletin, ardından numuneyi yıkama başına beş dakika boyunca üç kez 1X PBS ile yıkayın. Biçim dönüştürmeden sonra, tüm örneklerde antijen alma gerçekleştirin. Isı 20 milimolar Sitrat çözeltisi 100 santigrat derece bir mikrodalga ve çözelti slayt yerleştirin.Hemen bir kuluçka odasına konteyner aktarın ve otuz dakika boyunca 60 santigrat derece kuluçka. Örneği lekelemek için, slayttaki doku bölümünün etrafına bir sınır çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Bir petri kabına slayt yerleştirin, sonra 30 santigrat derece bir saat için tampon engelleme ile doku kuluçka.Daha sonra, oda sıcaklığında veya 37 santigrat derece en az üç saat boyunca birincil antikor çözeltisi ile dokuları kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, bloke edici tampon ile üç kez doku yıkayın ve oda sıcaklığında en az bir saat veya 37 santigrat derece ikincil antikor çözeltisi içinde kuluçka. Engelleme tamponu ile yıkıntıları tekrarlayın, ardından geleneksel geniş alan mikroskobu veya tercih edilen diğer görüntüleme sistemini kullanarak floresan görüntüleme yapın.El yazması talimatlarına göre demirleme çözümlerini hazırlayın. 100 ml petri kabına slaytlar yerleştirin, doku üzerinde demirleme çözeltisi pipet, ve oda sıcaklığında en az üç saat kuluçka. Daha sonra el yazması talimatlara göre jelleme çözeltisi hazırlayın.Doku bölümünden fazla demirleme çözeltisini çıkarın ve kaydırağı petri kabına geri yerleştirin. Numuneye taze soğuk jelçözelti çözeltisi ekleyin ve karışımı 4 santigrat derecede otuz dakika kuluçkaya yatırın. Örnek etrafında slayt üzerinde bir oda inşa etmek için, ince bir elmas bıçak ile kapak cam parçaları keserek boşluk oluşturmak.Su ile dokunun her iki tarafında spacers güvenli ve dikkatle slayt üzerine bir coverglass kapak yerleştirin, doku üzerinde hava kabarcıkları bindirme önlemek için emin olun. Daha sonra, iki saat boyunca nemli bir ortamda 37 santigrat derece örnek kuluçka. Bir jileti kapak kayması altında yavaşça kaydırarak ve jel yüzeyinden yavaşça kaldırarak jel haznesinin kapağını çıkarın.Hacmi en aza indirmek için doku etrafında boş jel kırpın, oryantasyon izlemek için asimetrik jel kesmek için emin olun. Seyreltik Proteinaz K sindirim tampon bir ila iki yüz, tamamen jel batırmak için yeterli çözüm hazırlamak için emin olun. Daha sonra, 60 santigrat derece üç saat boyunca kapalı bir kapta çözelti ile örnek kuluçka.Numune sindirim sırasında ayrışmazsa, yavaşça çıkarmak için bir jilet kullanın. Numuneyi istenilen görüntüleme sistemiyle uyumlu ve tamamen genişletilmiş jeli barındıracak kadar büyük bir kapta 1X PBS'ye aktarmak için yumuşak bir boya fırçası kullanın. Numuneyi PBS'de on dakika yıkayın ve istenirse 300 milimolar DAPI ile dinlendirin.Numuneyi yıkama başına on dakika boyunca üç ila beş kez çift distile su hacmiyle yıkayarak numuneleri genişletin. Sonra floresan görüntüleme yapın. Bu protokol başarılı bir şekilde gerçekleştirilirse, numuneler mekanik homojenizasyondan sonra düz ve şeffaf bir jel olarak görünür ve suda 3 ila 4,5 kat daha genişleyebilir.Beş mikrometre kalınlığındaff böbrek örneği 4.5 kez genişletildi ve 0.95 NA hedefi kullanılarak 63 nanometre çözünürlüğe ulaştı. Doku daha sonra bir genişleme patoloji uyumlu formatına dönüştürüldü ve Alfa Actinin 4 ve Vimentin için antikorlar ile lekeli, DAPI nükleer DNA görselleştirmek için, ve Buğday Germa Glutenin karbonhidrat etiketlemek için. Daha sonra numunenin görüntülanmasında iplik disk konfokal mikroskopisi kullanıldı.Böbrek dokusu daha sonra tamamen suda genişletilmiş ve tekrar görüntülendi. Çatlama, bozulmalar ve etiketli hedeflerin kaybı yetersiz demirleme veya homojenizasyon sonucu olabilir. Hematoksilin ve eozin lekeli normal meme dokusu FFPE örneği olarak değerlendirildi, genişletildi, DAPI ile etiketlendi ve dönen disk konfokal mikroskobunda görüntülendi.Düzeltilmemiş ve dondurulmuş böbrek dilimleri de bu protokol kullanılarak işlenmiştir. Doku soğuk aseton sabit ve Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI ve Buğday Germa Glutenin ile lekeli. Bu tekniği yaparken, jelleşme adımının zamanlamasının çok önemli olduğunu unutmamak önemlidir.Erken jelleşme bozulmalara neden olabilir, genişlemeyi sınırlayabilir ve hedef moleküllerin kaybına neden olabilir. Bu işlemden sonra floresan görüntüleme, numunenin sindirimi ve genişlemesinden sonra mikroskop üzerinde yapılabilir. ExPath hem patolojilerde hem de ötesinde yaygın olarak uygulanabilir.Araştırmacıların ilgi doku örneklerinde ince ayrıntıları görselleştirmelerini sağladığı için. Bu nedenle, araştırmacılarHastalıkların patogenezi veya biyolojik süreçlerin mekanizmaları yeni anlayışlar elde etmek için yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Interskapular kahverengi adipoz dokuda arasında Çerenkov Lüminesans Görüntüleme

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

Gaz Soluma Zorluklar yoluyla Serebrovasküler Reaktivitesinin MRG Haritalama

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Yüksek çözünürlüklü Fourier Patoloji iyileştirilmesi yönünde İnsan Doku Bölümler Kızılötesi (FT-IR) Spektroskopik Görüntüleme Dönüşümü

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

İnsan Brown Yağ Dokusu Depolar otomatik Pozitron Emisyon Tomografi / Bilgisayarlı Tomografi tarafından Parçalı ve Manyetik Rezonans Görüntüler Kayıtlı

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Bir teknik subkutan karın yağ doku biyopsisi diyatermi sigara yöntemi ile için

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D ultrason görüntüleme: hızlı ve uygun maliyetli morfometri kas-iskelet dokusunun

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

18F-FDG PET/BT kullanarak yağ dokusu kahverengi tüm vücut ve bölgesel Quantification etkin insan

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...