Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنح قُدّمإليها إلى مجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا وصندوق مارسدن، والجمعية الملكية لنيوزيلندا) ومؤسسة Z.W. (صندوق تطوير بحوث أعضاء هيئة التدريس من جامعة أوكلاند). يشكر المؤلفون الهاد ماهاغونكار على إدارة الخبراء لمرفق الحمار الوحشي ، ووحدة أبحاث التصوير الطبي الحيوي ، وكلية العلوم الطبية ، وجامعة أوكلاند للمساعدة في التصوير البؤري وغراهام Lieschke لإهداء Tg (mpeg1:EGFP) خط المراسل.

1. إعداد المخدرات المحملة مارينا الأزرق المسمى Liposomes
ملاحظة: يتم إعداد الليبوزومات التي تحمل صبغة الفلورسنت الزرقاء، مارينا بلو والمخدرات باستخدام طريقة ترطيب فيلم رقيقة مع إدخال آخر من poloxamer 188. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. مراقبة اللي...

<ol>
	<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Krenkel, O., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+macrophages+in+tissue+homeostasis+and+disease.">Liver macrophages in tissue homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).</li><li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+immunology:+turning+macrophages+on,+off+and+on+again.">Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).</li><li>Lawrence, T., Natoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+macrophage+polarization:+enabling+diversity+with+identity.">Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoresponsive+gene+1+augments+bactericidal+activity+of+macrophage-lineage+cells+by+regulating+beta-oxidation-dependent+mitochondrial+ROS+production.">Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production.</a> Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+fatty+acid-fueled+mROS+production+within+macrophages+alleviates+acute+gouty+inflammation.">Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).</li><li>Cambier, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+manipulate+macrophage+recruitment+through+coordinated+use+of+membrane+lipids.">Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids.</a> Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Madigan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrophage+Response+to+Mycobacterium+leprae+Phenolic+Glycolipid+Initiates+Nerve+Damage+in+Leprosy.">A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy.</a> Cell. 170 (5), 973-985 (2017).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lta4h+locus+modulates+susceptibility+to+mycobacterial+infection+in+zebrafish+and+humans.">The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans.</a> Cell. 140 (5), 717-730 (2010).</li><li>Volkman, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+granuloma+induction+via+interaction+of+a+bacterial+secreted+protein+with+host+epithelium.">Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium.</a> Science. 327 (5964), 466-469 (2010).</li><li>Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+the+future+of+drug+discovery:+in+vivo+chemical+screens+in+zebrafish.">Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish.</a> ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+nanoparticles:+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer.">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers.">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).</li><li>Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stealth+liposomes:+review+of+the+basic+science,+rationale,+and+clinical+applications,+existing+and+potential.">Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential.</a> International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+cells+and+bacterial+infection+in+zebrafish.">Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-insertion+of+poloxamer+188+strengthened+liposomal+membrane+and+reduced+drug+irritancy+and+in+vivo+precipitation,+superior+to+PEGylation.">Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation.</a> Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome-Mediated+Drug+Delivery+in+Larval+Zebrafish+to+Manipulate+Macrophage+Function.">Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function.</a> Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).</li><li>Cader, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C13orf31+(FAMIN)+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function.">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes.">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages:+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification.">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li><li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+zebrafish+leukocytes.">Live cell imaging of zebrafish leukocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rag-Ragulator+Complex+Regulates+Lysosome+Function+and+Phagocytic+Flux+in+Microglia.">The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia.</a> Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+to+macrophages:+role+of+physicochemical+properties+of+particulate+carriers--liposomes+and+microspheres--on+the+phagocytosis+by+macrophages.">Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).</li><li>Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+macrophages+initiating+and+driving+inflammation+in+a+monosodium+urate+monohydrate+crystal-induced+murine+peritoneal+model+of+acute+gout.">Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).</li><li>Faires, J. S., McCarty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+arthritis+in+man+and+dog+after+intrasynovial+injection+of+sodium+urate+crystals.">Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals.</a> Lancet. 280, 682-685 (1962).</li><li>Martin, W. J., Harper, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+inflammation+and+resolution+in+acute+gout.">Innate inflammation and resolution in acute gout.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).</li><li>Fenaroli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+drug+delivery+system+against+tuberculosis+in+zebrafish+embryos:+direct+visualization+and+treatment.">Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment.</a> ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).</li><li>Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Neutrophilic+Inflammation+Using+Polymersome-Mediated+Cellular+Delivery.">Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery.</a> Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li><li>Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+liposomal+drug+delivery+to+monocytes+and+macrophages.">Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).</li><li>Fidler, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+liposomes+to+improve+delivery+of+macrophage-augmenting+agents+to+alveolar+macrophages.">Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages.</a> Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).</li><li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish:+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis.">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li></ol>

هنا، قدمنا بروتوكول مفصل لصياغة الليبوزومات المحملة بالمخدرات لاستهداف الضامة على وجه التحديد في سمك اليرقات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتشريح دور الضامة في نماذج معينة من الأمراض عن طريق ضمان التسليم المباشر المستهدف للأدوية على وجه التحديد إلى الضامة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه عن?...

يوفر نظام البلعوم أحادي النواة خط دفاع أول ضد مسببات الأمراض الغازية. يتكون هذا النظام من الخلايا الأحادية والخلايا التشجرات المشتقة من الأحادية والضامة ، والتي تقوم بنشاط ببلع مسببات الأمراض الأجنبية ، وبالتالي الحد من انتشار مسببات الأمراض. بالإضافة إلى هذه وظائف المنفطي ة وmicrobicidal effector ، والخلايا التشجرة والضامة هي أيضا قادرة على إنتاج السيتوكين ومستضد العرض لتنشيط نظام المناعة التكيفي1. من هذه الخلايا ، تلقت الضامة اهتمامًا خاصًا نظرًا لتغايريتها الوظيفية المتنوعة ومشاركتها في أمراض التهابية متعددة ، من المناعة الذاتية والأمراض المعدية إلى السرطان2،3،4،5،6. إن لدونة الضامة وقدرتها على التكيف وظيفياً مع الاحتياجات إلى بيئة الأنسجة الخاصة بها تتطلب اتباع نهج تجريبية لمراقبة هذه الخلايا واستجوابها مباشرة في الجسم الحي.
حمار وحشي اليرقات هي كائن مثالي نموذجي لدراسة وظيفة واللدونة من الضامة في الجسم الحي8. توفر الشفافية البصرية لسمك الحمار الوحشي اليرقاني نافذة لمراقبة سلوك الضامة مباشرة ، خاصة عندما تقترن بخطوط المراسل المعدلة وراثياً التي تميز الضامة. وقد أدى استغلال إمكانات التصوير الحي وtractability التجريبية من حمار وحشي اليرقات إلى العديد من الأفكار الهامة في وظيفة الضامة التي لها صلة مباشرة بمرض الإنسان9،10،11،12،13،14،15. وقد استفادت العديد من هذه الدراسات أيضا من الحفاظ على ارتفاع نشاط المخدرات في حمار وحشي (السمة التي تدعم استخدامها كمنصة اكتشاف المخدرات الحيوانية كله16،17،18)، من خلال استخدام التدخلات الكيميائية للتلاعب الدوائي وظيفة الضامة. حتى الآن ، تم تسليم هذه العلاجات الدوائية في الغالب إما عن طريق الغمر ، مما يتطلب أن يكون الدواء قابلًا للذوبان في الماء ، أو عن طريق الحقن المجهري المباشر للدواء المجاني(الشكل 1A). وتشمل القيود المفروضة على استراتيجيات التسليم السلبية هذه الآثار غير المستهدفة والسمية العامة التي قد تحول دون تقييم أي تأثير على وظيفة الضامة. بالإضافة إلى ذلك ، عند التحقيق في آثار المخدرات على الضامة ، من غير المعروف ما إذا كانت الأدوية تعمل على الضامة نفسها أو من خلال آليات غير مباشرة. عند إجراء دراسات تدخل كيميائي مماثلة للتحقيق في وظيفة الضامة، أدركنا أن هناك حاجة غير ملباة لتطوير طريقة إيصال غير مكلفة ومباشرة لاستهداف الأدوية على وجه التحديد إلى الضامة.
الليبوزومات هي مجهرية، متوافقة بيولوجيا، الحويصلات ثنائية الطبقات الدهون التي يمكن أن تغلف البروتينات والنيوكليوتيدات والبضائع المخدرات19. يشكل هيكل أحادي اللاميلار أو متعدد اللاميلار من الدهون ثنائية الطبقة من الليبوزومات تجويفًا داخليًا مائيًا حيث يمكن دمج الأدوية القابلة للذوبان في الماء بينما يمكن دمج الأدوية الكارهة للماء في أغشية الدهون. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التلاعب بالخصائص الفيزيائية الكيميائية للدهون ، بما في ذلك الحجم والشحن والتعديلات السطحية لتفصيل استهدافها لخلايا محددة20،21. وقد جعلت هذه الميزات من الليبوزومات لهم وسيلة جذابة لتقديم الأدوية وتعزيز دقة نظم العلاج الحالية20. كما هي phagocytozed الليبوزومات بطبيعة الحال من قبل الضامة (ميزة استغلالها من قبل استخدامها الروتيني في تقديم كلودروناتي خصيصا لmacrophages لتجارب الاستئصال22),أنها تقدم كخيار جذاب لتسليم المخدرات الضامة محددة(الشكل 1B).
يصف هذا البروتوكول صياغة الأدوية إلى الليبوزومات الفلورية الزرقاء المغلفة بالبوليمر المائي poloxamer 188 ، التي تشكل طبقة واقية على سطح liposome وقد ثبت أنها تعزز الاحتفاظ بالأدوية ولها توافق حيوي فائق23. تم اختيار Poloxamer لطلاء سطح الليبوزومات كما أظهرت أبحاثنا السابقة أنه ، بالمقارنة مع الليبوزومات المعدلة من البولي إيثيلين ، أظهرت الليبوزومات المعدلة بولوكعامين توافقًا حيويًا أفضل بعد حقن الكفوف تحت الجلد من الكفوف الفئران والعقاقير المماثلة في الأرانب بعد التسريب الوريدي23. كما يتم وصف البروتوكولات للحقن المجهري في حمار وحشي اليرقات والتصوير الحي لتقييم قدرتها على استهداف الضامة وتوطينها إلى المقصورات داخل الخلايا اللازمة لتدهور الدهون وإيصال الأدوية السيتوبلازمية. كدليل على مفهوم استخدمنا سابقا هذه التقنية لاستهداف اثنين من الأدوية إلى الضامة لقمع تفعيلها في نموذج حمار وحشي اليرقات من التهاب النقرس الحاد24. هذه التقنية تسليم المخدرات يوسع "مجموعة الأدوات" الكيميائية المتاحة للباحثين حمار وحشي الراغبين في ضمان الضامة المستهدفة من الأدوية ذات الأهمية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

وقد تطورت اليرقات حمار وحشي(Danio rerio)إلى نموذج شعبي للتحقيق في تفاعلات الممرض المضيف ومساهمة الخلايا المناعية الفطرية في الأمراض الالتهابية بسبب نظام المناعة الفطري المحفوظة وظيفيا. كما أنها تستخدم على نطاق واسع لدراسة كيفية تساعد الخلايا المناعية الفطرية في توجيه عمليات النمو. من خلال الاستفادة من الشفافية البصرية وقابلية الوراثة لسمك اليرقان، تركز هذه الدراسات في كثير من الأحيان على أساليب التصوير الحي لتوصيف الكلمة والالعدلات الموسومة بشكل وظيفي داخل الحيوانات السليمة. ونظراً لتغايريتها الوظيفية المتنوعة وأدوارها المتزايدة باستمرار في الإمراض المرضي، فقد حظيت الضامة باهتمام كبير. بالإضافة إلى التلاعب الجيني، تستخدم التدخلات الكيميائية الآن بشكل روتيني للتلاعب ودراسة سلوك الضامة في سمك الحمار الوحشي اليرقات. يقتصر تسليم هذه الأدوية عادة على الاستهداف السلبي للدواء المجاني من خلال الغمر المباشر أو الحقن المجهري. تعتمد هذه الأساليب على افتراض أن أي تغييرات في سلوك الضامة هي نتيجة لتأثير مباشر للدواء على الضامة نفسها ، وليس نتيجة المصب للتأثير المباشر على نوع خلية أخرى. هنا ، نقدم بروتوكولاتنا لاستهداف الأدوية على وجه التحديد لالضهاض حمار وحشي اليرقات عن طريق حقن المواد الفلورية المحملة بالأدوية. نكشف أن poloxamer 188 معدلة المخدرات محملة الدهون الزرقاء الفلورسنت يتم تناولها بسهولة من قبل الضامة، وليس من قبل العدلات. كما نقدم أدلة على أن الأدوية التي يتم تسليمها بهذه الطريقة يمكن أن تؤثر على نشاط الضامة بطريقة تتسق مع آلية عمل الدواء. وستكون هذه التقنية ذات قيمة للباحثين الراغبين في ضمان استهداف الأدوية للضامة وعندما تكون الأدوية سامة للغاية بحيث لا يمكن تسليمها بالطرق التقليدية مثل الغمر.

نهج الترطيب رقيقة فيلم وصفها هنا لإعداد الليبوزومات الفلورية التي أرفقت المخدرات هو وسيلة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. مع البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة، ومن المتوقع أن تكون الليبوزومات unilamellar23،24. ويلخص الجدول 1حجم وإمكانية زيتا وتحميل المخد?...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

هنا ، نصف تركيب الليبوزومات المحملة بالأدوية وحقنها المجهري في سمك حمار وحشي اليرقات لغرض استهداف إيصال الدواء إلى خلايا النسب الضامة.

استهداف المخدرات إلى اليرقات حمار وحشي الضامة عن طريق حقن Liposomes المحملة بالمخدرات

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

يصف هذا البروتوكول تقنية لاستهداف الأدوية ذات الأهمية لمامامة أسماك الحمار الوحشي اليرقات للتلاعب بوظيفة الضامة وتقييمها. هذه التقنية لديها مزايا على استراتيجيات تسليم الأدوية التقليدية مثل الغمر من خلال ضمان أن يتم استهداف الأدوية على وجه التحديد إلى الضامة من خلال تغليف الليبوسومات. عند تطبيقها على نماذج حمار وحشي من المرض مع عنصر التهابي ، هذه التقنية لديها القدرة على حل كيفية مساهمة الضامة في العمليات المرضية.هنا ، نبرهن على فائدة هذه التقنية من خلال استهداف دواء مثبط لأنواع الأكسجين المتفاعلة من الميتوكوندريا إلى الضامة لقمع التنشيط. يمكن أن يكون الحقن المجهري للليبوسومات المحملة بالمخدرات إلى يرقات أمرًا صعبًا ، حيث يجب الحرص على عدم التسبب في ضرر ظهاري مفرط ، مما قد يؤثر على الدراسات المناعية. إن العرض التوضيحي المرئي لهذا البروتوكول مهم لأنه يتضمن منهجيات الخلايا الحية الحيوانية الكاملة والصيدلانية الكاملة التي قد لا يتم تنفيذها بشكل روتيني في مختبر واحد.لإعداد 10 ملليغرام من liposomes في قارورة 25 ملليلتر جولة القاع، إضافة 31 نانوموللار من الأزرق البحري و 300 نانوموللار من المخدرات المثبطة لأنواع الأكسجين الميتوكوندريا التفاعلية إلى القارورة. سونيكات لفترة وجيزة إلى حل كامل، وإزالة المذيب ببطء على المبخر دوارة تعيين على حمام الماء 45 درجة مئوية في 75 التناوب في الدقيقة الواحدة تحت ضغط فراغ. عندما تكون طبقة رقيقة من الدهون الجافة داخل الجدران الزجاجية للقارورة ، قم بتجفيف الفيلم لمدة 45 دقيقة تحت النيتروجين لتسهيل الإزالة الكاملة للمذيبات العضوية.بعد ذلك ، هيدرات الفيلم مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني ، وختم القارورة مع فيلم البارافين قبل يهيج القارورة باليد على حمام مائي 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد سبع دورات من التجميد والذوبان ، استخدم غشاء البولي كربونات صغير وميكرومتر واحد محفورة لقذف الدهون لمدة دورتين إلى ست دورات. عندما تم الحصول على الحويصلات unilamellar كبيرة، وتكثيف lipوزوes الطازجة في بيليه من قبل الطاردة الفائقة.احتضان بيليه مع ملليلتر واحد من 1٪ poloxamer 188 حل لمدة 30 دقيقة في 45 درجة مئوية و 750 التناوب في الدقيقة الواحدة في ThermoMixer مع اثنين ملليلتر microcentrifuge أنبوب المرفق. خلال مرحلة ما بعد إدخال poloxamer 188 في lipوزوes، والتركيز البولوكسيموم الصحيح، وقت الحضانة، ودرجة الحرارة مهمة لتحقيق الخصائص الفيزيائية الكيميائية المثلى للليبوسومات الناتجة. في نهاية الحضانة، طرد الخليط فوق المركزية مرة أخرى في ظل نفس شروط الطرد المركزي، وإزالة فوق التي تحتوي على أي البوليمر غير منضم أو المخدرات.ثم تخزين الكريات ليبوسووم في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء. لتحديد حجم و إمكانات زيتا من liposomes، وتمييع تركيبة الدهون مع الماء فائقة الخطورة بنسبة واحد إلى 100. استخدم محلل تشتت ضوئي ديناميكي لقياس حجم الجسيمات ومؤشر تعدد التخصصات وإمكانات زيتا في ثلاث ية عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.لحساب كفاءة الفخ وتحميل المخدرات من lipوزوes، حل lipوزوes في تريتون X-100. حقن 20 ميكرولترات من عينة liposome الذائبة في نظام الكروماتوغرافيا السائلة الضغط العالي مع مضخة رباعية، كاشف صفيف ثنائي مجموعة في 230 نانومتر، وثلاثة ميكرومتر، 250 مرات-4.6 ملليمتر العمود. لإعداد يرقات أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا للحقن، استخدم ملقط البقشيش الدقيق لتدبير الأجنة يدويا بعد الإخصاب 30 ساعة، والسماح للأجنة لتطوير في 28.5 درجة مئوية حتى يومين بعد الإخصاب.عندما تكون الأجنة قد وصلت إلى المرحلة المناسبة ، تمييع تركيبة ليبسوم الطازجة المعدة بنسبة واحد إلى واحد في PBS العقيمة ، وخلط الحل لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عن طريق الدوامة. صب ما يكفي من السليلوز الميثيل 3٪ في E3 المتوسطة في غطاء صغير، غطاء طبق ثقافة 35 ملليمتر لتشكيل طبقة رقيقة تغطي السطح بأكمله. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لجمع بركة من 20 إلى 25 يرقة تخدير تقريبًا.السماح للأجنة للتركيز على غيض من الماصات عن طريق الجاذبية، ونقل بعناية اليرقات في منتصف غطاء طبق ثقافة 35 ملليمتر مع الحد الأدنى من الحل. استخدام محمل microcapillary لترتيب اليرقات مع اليرقاتteriors نحو الجزء العلوي من لوحة الحقن مع سطح الظهرية التي تواجه نحو إبرة الحقن المجهري للحقن في البطين ندبين أو مع الادراء نحو يسار لوحة الحقن مع الأسطح البطنية التي تواجه نحو إبرة الحقن المجهري للحقن في الأنف الجيب. استخدام محمل microcapillary لتعبئة مرة أخرى إبرة حقن مع ما يقرب من خمسة ميكرولترات من مزيج حقن الدهون.جبل الإبرة في micromanipulator متصلة موقف مغناطيسي وحاقن الضغط، ووضع الإعداد تحت مجهر ستيريو. استخدام نظيفة، غرامة تلميح ملقط لقطع غيض من إبرة الحقن المجهري لتوليد فتحة من ما يقرب من خمسة ميكرومتر في القطر. تعيين حاقن إلى مدة نبض حوالي 50 مللي ثانية وضغط الحقن من حوالي 40 جنيه لكل بوصة مربعة.حقن بولوس في قطرة من النفط المعدني المتمركزة على خطوط الشبكة من قياس الهيموسيت لمعايرة حجم ليتم حقنها. ثم ضبط مدة النبض و / أو ضغط الحقن حتى قطر البلينوس يغطي 2 1/2 من أصغر خطوط الشبكة. حقن بعناية نانولتر واحد من مزيج حقن الدهون في البطين هدبرين من كل يرقات.مباشرة بعد الحقن، إضافة E3 المتوسطة إلى لوحة الحقن، واستخدام ماصة نقل البلاستيك لتهيج بلطف اليرقات من السليلوز الميثيل. لتصوير السطح الظهري للـ hindbrain على مجهر confocal مجهز بعدسة غمر الماء ، قم أولاً بملء طبق ثقافة 35 ملليمترًا إلى عمق خمسة ملليمترات مع وسيط متصاعد ، والسماح للبليمرة المتوسطة. حفر خندق صغير في agarose من مساحة كافية لاستيعاب كيس صفار الجنين التجريبي، واستخدام ماصة نقل البلاستيك مليئة المتوسطة المنصهرة تصاعد لجمع يرقة تخدير.قم على الفور بإيداع اليرقة في طبق الثقافة ، واستخدم محملًا صغيرًا لتوجيه الجانب البطني التاجي الصفير إلى أسفل إلى الثقوب المحفورة. الحفاظ على الجنين في هذا الموقف حتى يتممرر agarose. تراكب الجنين مع E3 المتوسطة تكمل مع 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من tricaine.ولعيش صورة البطين الخلفي، حدد الهدف 20x، وقم بتعيين المجهر confocal إلى 512 في 512 بكسل و 2.5x التكبير. عندما تم تعيين المعلمات المجهر، والحصول على 40 في ثلاثة ميكرومتر Z-مد مد من سطح الظهر معظم من hindbrain باستخدام التصوير بقناتين لتصوير الدهنية الفلورية الزرقاء و الضامة الفلورية الخضراء. عندما يتم الحصول على كافة الصور، قم بتحميل الملفات في برنامج تحليل الصور ثلاثية الأبعاد المناسب.ضمن علامة التبويب القياس، اسحب بروتوكول البحث عن الكائنات إلى مساحة السحب المهام هنا لإجراء القياسات. حدد قناة DAPI لتمييز الليبوسومات، واسحب أداة الفحص من خلال المقاطع Z للكشف عن الضامة المحملة بالزبس. لقياس كثافة الفلوريسنس من liposomes داخل الخلايا الفردية، اسحب مقطع إلى المناطق ذات الأهمية البروتوكول إلى مهام السحب هنا لجعل القياسات الفضاء، واستخدام أداة المستطيل لرسم مربع حول الخلية من الاهتمام في الأبعاد س، ص، و Z.ثم حدد جعل عنصر القياس من القائمة المنسدلة القياسات لإنشاء ملف قياس في نافذة المكتبة. في هذا الجدول، يتم تلخيص حجم، زيتا المحتملة، تحميل المخدرات، وكفاءة الفخ من liposomes المنتجة. كما لوحظ، حجم الجسيمات من liposomes مماثلة مع وبدون تحميل المخدرات، على الرغم من أن تهمة سطح liposomes محملة بالمخدرات قليلا أكثر حيادا من liposomes السيطرة مع الأزرق البحري فقط.الحقن المجهري للليبوسومات البحرية ذات العلامات الزرقاء في البطين الخلفي ، كما هو موضح ، يؤدي إلى امتصاص سريع من قبل الضامة المقيمة التي يمكن تحديدها بسهولة عن طريق المجهر confocal بواسطة ثلاث ساعات بعد الحقن. ومع ذلك، نادراً ما تلاحظ العدلات لاحتواء ليبوسومات داخل الخلايا. داخل الضامة الفردية المحملة بالليبوسومات ، تتراكم الليبوسومات داخل مقصورات الفومرسيوم ، وهو أمر ضروري لتحلل الليبوسومات ومحتوى المخدرات اللاحقة في السيتوبلازم.يمكن التسليم في الجيوب الأنفية venosus تسليم الدهون إلى الضامة الأنسجة ال دموي السدية المقيم عبر الدورة الدموية. يمكن للدمج المجهري للليبوسومات الدهنية المحملة بالمخدرات المثبطة لأنواع الأكسجين التفاعلية الميتوكوندريا في البطين الخلفي أن يقمع بشكل كبير أحادي الصوديوم urate الذي يحركه الكريستال يحركها إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الميتوكوندريا داخل الضامة الهندية المقيمة في الليبوسومات. مزيد من التحقق من الآثار القمعية للأدوية ذات الأهمية على الدول تنشيط الضامة يمكن أن يؤديها عن طريق التحقيق في التعبير الجيني cytokine proinflammatory من قبل جبل كامل في التهجين الموقعي والتجنيد الزمني من العدلات.باستخدام هذه التقنية ، تمكنا من استهداف الأدوية للضامة للتأكد من أن آلية استقلاب المناعة تدفع تنشيطها في نموذج حمار وحشي يرقات من التهاب النقرس الحاد. ويمكن أن تشمل عمليات التكيف المستقبلية لهذا البروتوكول إجراء تعديل سطحي للليبوسومات لتعزيز استهداف الضامة أو لتعزيز الاستهداف للخلايا المناعية الأخرى، مثل العدلات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

أنسنة نموذج الفأر لدراسة الالتهابات البكتيرية استهداف الأوعية الدموية الدقيقة

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

البروتين من التنميط الضامة التي كتبها 2D الكهربائي

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...