Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud til C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) og Z.W. (Faculty Research Development Fund from the University of Auckland). Forfatterne takker Alhad Mahagaonkar for ekspertledelse af zebrafisk facilitet, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland for bistand med konfokale billeddannelse og Graham Lieschke for gaver Tg (mpeg1: EGFP) reporter linje.

1. Forberedelse af Drug-loaded Marina Blå-mærket Liposomer
BEMÆRK: Liposomer transporterer den blå fluorescerende farvestof, Marina Blue og narkotika er udarbejdet ved hjælp af en tynd film hydrering metode med post indsættelse af poloxamer 188. Alle procedurer udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Kontrol liposomer kun bære Marina blå og PBS. Eksemplet her beskriver lastning liposomer med en mitokondrier-målretning antioxidant stof25, der brug...

<ol>
	<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Krenkel, O., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+macrophages+in+tissue+homeostasis+and+disease.">Liver macrophages in tissue homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).</li><li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+immunology:+turning+macrophages+on,+off+and+on+again.">Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).</li><li>Lawrence, T., Natoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+macrophage+polarization:+enabling+diversity+with+identity.">Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoresponsive+gene+1+augments+bactericidal+activity+of+macrophage-lineage+cells+by+regulating+beta-oxidation-dependent+mitochondrial+ROS+production.">Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production.</a> Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+fatty+acid-fueled+mROS+production+within+macrophages+alleviates+acute+gouty+inflammation.">Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).</li><li>Cambier, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+manipulate+macrophage+recruitment+through+coordinated+use+of+membrane+lipids.">Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids.</a> Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Madigan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrophage+Response+to+Mycobacterium+leprae+Phenolic+Glycolipid+Initiates+Nerve+Damage+in+Leprosy.">A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy.</a> Cell. 170 (5), 973-985 (2017).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lta4h+locus+modulates+susceptibility+to+mycobacterial+infection+in+zebrafish+and+humans.">The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans.</a> Cell. 140 (5), 717-730 (2010).</li><li>Volkman, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+granuloma+induction+via+interaction+of+a+bacterial+secreted+protein+with+host+epithelium.">Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium.</a> Science. 327 (5964), 466-469 (2010).</li><li>Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+the+future+of+drug+discovery:+in+vivo+chemical+screens+in+zebrafish.">Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish.</a> ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+nanoparticles:+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer.">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers.">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).</li><li>Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stealth+liposomes:+review+of+the+basic+science,+rationale,+and+clinical+applications,+existing+and+potential.">Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential.</a> International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+cells+and+bacterial+infection+in+zebrafish.">Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-insertion+of+poloxamer+188+strengthened+liposomal+membrane+and+reduced+drug+irritancy+and+in+vivo+precipitation,+superior+to+PEGylation.">Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation.</a> Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome-Mediated+Drug+Delivery+in+Larval+Zebrafish+to+Manipulate+Macrophage+Function.">Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function.</a> Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).</li><li>Cader, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C13orf31+(FAMIN)+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function.">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes.">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages:+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification.">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li><li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+zebrafish+leukocytes.">Live cell imaging of zebrafish leukocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rag-Ragulator+Complex+Regulates+Lysosome+Function+and+Phagocytic+Flux+in+Microglia.">The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia.</a> Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+to+macrophages:+role+of+physicochemical+properties+of+particulate+carriers--liposomes+and+microspheres--on+the+phagocytosis+by+macrophages.">Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).</li><li>Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+macrophages+initiating+and+driving+inflammation+in+a+monosodium+urate+monohydrate+crystal-induced+murine+peritoneal+model+of+acute+gout.">Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).</li><li>Faires, J. S., McCarty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+arthritis+in+man+and+dog+after+intrasynovial+injection+of+sodium+urate+crystals.">Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals.</a> Lancet. 280, 682-685 (1962).</li><li>Martin, W. J., Harper, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+inflammation+and+resolution+in+acute+gout.">Innate inflammation and resolution in acute gout.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).</li><li>Fenaroli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+drug+delivery+system+against+tuberculosis+in+zebrafish+embryos:+direct+visualization+and+treatment.">Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment.</a> ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).</li><li>Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Neutrophilic+Inflammation+Using+Polymersome-Mediated+Cellular+Delivery.">Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery.</a> Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li><li>Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+liposomal+drug+delivery+to+monocytes+and+macrophages.">Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).</li><li>Fidler, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+liposomes+to+improve+delivery+of+macrophage-augmenting+agents+to+alveolar+macrophages.">Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages.</a> Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).</li><li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish:+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis.">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li></ol>

Her har vi givet en detaljeret protokol til at formulere narkotika-loaded liposomer til specifikt at målrette makrofager i larve zebrafisk. Denne metode kan bruges til at dissekere makrofagers rolle i visse sygdomsmodeller ved at sikre direkte målrettet levering af lægemidler specifikt til makrofager. Desuden kan det bruges, når generel toksicitet af narkotika begrænser deres anvendelse, når de leveres af mere konventionelle ruter, som nedsænkning. Den protokol, der er beskrevet her, er et alternativ til andre nan...

Den mononukleare fagocyt system giver en første linje i forsvaret mod invaderende patogener. Dette system består af monocytter, monocyt-afledte dendritiske celler og makrofager, som aktivt fagocytoze udenlandske patogener, hvilket begrænser patogenspredning. Ud over disse fagocytiske og mikrobiske effektor funktioner, dendritiske celler og makrofager er også i stand til cytokin produktion og antigen-præsentation for at aktivere adaptive immunsystem1. Af disse celler, makrofager har fået særlig opmærksomhed på grund af deres forskelligartede funktionelle heterogenitet og engagement i flere inflammatoriske sygdomme, fra autoimmune og smitsomme sygdomme til kræft2,3,4,5,6,7. Makrofagers plasticitet og deres evne til funktionelt at tilpasse sig behovene i deres vævsmiljø kræver eksperimentelle tilgange til direkte at observere og afhøre disse celler in vivo.
Larve zebrafisk er en ideel model organisme til at studere funktionen og plasticitet makrofager i vivo8. Den optiske gennemsigtighed af larve zebrafisk giver et vindue til direkte at observere adfærd makrofager, især når kombineret med makrofag-mærkning transgene reporter linjer. Udnyttelse af larvezebrafisks live billeddannelsespotentiale og eksperimentelle tractability har ført til mange væsentlige indsigter i makrofagsfunktion , der har direkte relevans for sygdomme hos mennesker9,10,11,12,13,14,15. Mange af disse undersøgelser har også benyttet sig af den høje bevarelse af narkotikaaktivitet i zebrafisk (en egenskab, der understøtter deres anvendelse som en hel dyr drug discovery platform16,17,18), ved at udnytte kemiske indgreb til farmakologisk manipulere makrofag funktion. Til dato, disse farmakologiske behandlinger er for det meste blevet leveret enten gennem nedsænkning, som kræver, at stoffet skal være vandopløseligt, eller ved direkte mikroinjektion af gratis stof(figur 1A). Begrænsninger af disse passive leveringsstrategier omfatter off-target effekter og generel toksicitet, der kan udelukke at vurdere enhver indvirkning på makrofag funktion. Derudover, når man undersøger narkotika effekter på makrofager er det uvist, om narkotika handler på makrofager selv eller gennem mere indirekte mekanismer. Når vi udfører lignende kemiske indgreb undersøgelser for at undersøge makrofag funktion, vi erkendte, at der var et udækket behov for at udvikle en billig og ligetil leveringsmetode til at målrette lægemidler specifikt til makrofager.
Liposomer er mikroskopiske, biokompatible, lipid tolagede vesikler, der kan indkapsle proteiner, nukleotider og narkotika last19. Den unilamellar eller multilamellar lipid tolags struktur liposomer danner en vandig indre lumen, hvor vandopløselige lægemidler kan indarbejdes, mens hydrofobe lægemidler kan integreres i lipid membraner. Desuden kan de fysisk-kemiske egenskaber liposomer, herunder størrelse, opladning og overflade ændringer manipuleres til at skræddersy deres målretning til specifikke celler20,21. Disse funktioner i liposomer har gjort dem til et attraktivt middel til at levere narkotika og øge præcisionen af de nuværende behandlingsregimer20. Som liposomer er naturligt fagocytozed af makrofager (en funktion udnyttes ved deres rutinemæssige brug i at levere clodronate specifikt til makrofager til ablation eksperimenter22),de præsenterer som en attraktiv mulighed for makrofag-specifikke stof levering(Figur 1B).
Denne protokol beskriver formuleringen af lægemidler i blå fluorescerende liposomer belagt med hydrofile polymer poloxamer 188, der danner et beskyttende lag på liposom overfladen og har vist sig at forbedre opbevaring af lægemidler og har overlegen biokompatibilitet23. Poloxamer blev valgt til overfladebelægning af liposomer som vores tidligere forskning havde vist, at sammenlignet med polyethylenglycol modificeret liposomer, poloxamer modificerede liposomer viste bedre biokompatibilitet efter subkutan injektion af rotte poter og lignende farmakokinetik hos kaniner efter intravenøs infusion23. Protokoller er også beskrevet for deres mikroinjektion i larve zebrafisk og levende billeddannelse til at vurdere deres makrofag-målretning evne og lokalisering til intracellulære rum er nødvendige for liposom nedbrydning og cytoplasmatisk stof levering. Som et proof-of-concept har vi tidligere brugt denne teknik til at målrette to lægemidler til makrofager at undertrykke deres aktivering i en larve zebrafisk model af akut gigt inflammation24. Dette stof levering teknik udvider den kemiske "værktøjskasse" til rådighed for zebrafisk forskere, der ønsker at sikre makrofag-målretning af deres lægemidler af interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Zebrafisk(Danio rerio)larver har udviklet sig til en populær model til at undersøge host-patogen interaktioner og bidraget fra medfødte immunceller til inflammatorisk sygdom på grund af deres funktionelt bevarede medfødte immunsystem. De er også meget udbredt til at undersøge, hvordan medfødte immunceller hjælpe guide udviklingsmæssige processer. Ved at drage fordel af den optiske gennemsigtighed og genetiske tractability af larve zebrafisk, disse undersøgelser ofte fokusere på levende billeddannelse tilgange til funktionelt karakterisere fluorescerende markerede makrofager og neutrofiler i intakte dyr. På grund af deres forskelligartede funktionelle heterogenitet og stadigt voksende roller i sygdompatogenese, makrofager har fået betydelig opmærksomhed. Ud over genetiske manipulationer, kemiske indgreb er nu rutinemæssigt bruges til at manipulere og undersøge makrofag adfærd i larve zebrafisk. Levering af disse stoffer er typisk begrænset til passiv målretning af gratis stof gennem direkte nedsænkning eller mikroinjektion. Disse tilgange er afhængige af den antagelse, at eventuelle ændringer i makrofag adfærd er resultatet af en direkte effekt af lægemidlet på makrofager selv, og ikke en downstream konsekvens af en direkte effekt på en anden celle type. Her præsenterer vi vores protokoller for målretning af lægemidler specifikt til larve zebrafisk makrofager ved microinjecting stof-loaded fluorescerende liposomer. Vi afslører, at poloxamer 188-modificerede stof-loaded blå fluorescerende liposomer er let taget op af makrofager, og ikke af neutrofiler. Vi fremlægger også bevis for, at lægemidler leveret på denne måde kan påvirke makrofagaktivitet på en måde, der er i overensstemmelse med stoffets virkningsmekanisme. Denne teknik vil være af værdi for forskere, der ønsker at sikre målretning af lægemidler til makrofager, og når narkotika er for giftige til at blive leveret ved traditionelle metoder som nedsænkning.

Den tynde film hydrering tilgang beskrevet her til fremstilling af fluorescerende liposomer omslutter narkotika er en enkel og omkostningseffektiv metode. Med den protokol, der anvendes i denne undersøgelse, liposomer forventes at være unilamellar23,24. Størrelsen, zeta potentiale, narkotika lastning og fastklemning effektivitet af liposomer produceret er sammenfattet i tabel 1. Partikelstørrelsen af liposomerne (før og efter indlæsning af ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Her beskriver vi syntesen af narkotikabelastede liposomer og deres mikroinjektion i larvezebrafisk med det formål at målrette lægemiddellevering til makrofag-afstamning celler.

Målretning narkotika til Larval Zebrafish makrofager ved indsprøjtning Drug-Loaded Liposomer

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Denne protokol beskriver en teknik til målretning af lægemidler af interesse for larve zebrafisk makrofager til at manipulere og evaluere makrofag funktion. Denne teknik har fordele i forhold til traditionelle narkotika levering strategier såsom nedsænkning ved at sikre, at narkotika er specifikt rettet mod makrofager gennem liposom indkapsling. Når denne teknik anvendes på zebrafiskmodeller af sygdom med en inflammatorisk komponent, har den potentiale til at løse, hvordan makrofager bidrager til patologiske processer.Her demonstrerer vi nytten af denne teknik ved at målrette et mitokondrielt-reaktivt iltartshæmmende lægemiddel til makrofager for at undertrykke aktivering. Mikroinjektion af lægemiddelbelastede liposomer i larver kan være udfordrende, da der bør drages omsorg for ikke at forårsage overdreven epitelskade, hvilket potentielt kan påvirke immunologiske undersøgelser. Visuel demonstration af denne protokol er vigtig, fordi den omfatter farmakologiske og hele dyrs levende cellemetoder, som ikke rutinemæssigt udføres i et enkelt laboratorium.For at forberede 10 milligram liposomer i en 25-milliliter rund-bund kolbe, tilsæt 31 nanomomolarer af marine blå og 300 nanomolars af et mitokondrielle-reaktive ilt arter-hæmmende stof til kolben. Sonikere kort for at opløse det helt og langsomt fjerne opløsningsmidlet på en roterende fordamper, der er sat over et 45-graders Celsius-vandbad ved 75 rotationer i minuttet under vakuumtryk. Når en tør lipid tynd film har dannet inden for glasvægge af kolben, yderligere tørre filmen i 45 minutter under kvælstof for at lette fuldstændig fjernelse af det organiske opløsningsmiddel.Dernæst fugte filmen med en milliliter PBS, og forsegle kolben med paraffin film, før omrørning af kolben i hånden over en 60-graders Celsius vandbad i 20 minutter. Efter syv cyklusser af frysning og optøning, bruge en mini-ekstruder og et-mikrometer spor-ætset polycarbonat membraner til at ekstrudere liposomer for to til seks cyklusser. Når store unilamellar vesikler er opnået, kondensere de friske liposomer i en pellet ved ultracentrifugering.Inkuber pellet med en milliliter 1%poloxamer 188 opløsning i 30 minutter ved 45 grader Celsius og 750 rotationer i minuttet i en ThermoMixer med en to-milliliter mikrocentrifuge rør vedhæftet fil. Under stillingen indsættelse af poloxamer 188 i liposomer, den korrekte poloxamer koncentration, inkubationstid, og temperatur er vigtige for at opnå de optimale fysisk-kemiske egenskaber af de resulterende liposomer. Ved slutningen af inkubationen, ultracentrifuge blandingen igen under de samme centrifuge betingelser, og fjerne supernatant, der indeholder enhver ubundet polymer eller stof.Derefter opbevare liposome pellets på fire grader Celsius, beskyttet mod lys. For at bestemme størrelsen og zeta potentialet af liposomer, fortynde liposom formulering med ultrapure vand på en en-til-100 forholdet. Brug en dynamisk lysspredningsanalysator til at måle partikelstørrelsen, polydispersitetsindekset og zetapotentialet i tre eksemplarer ved 25 grader Celsius.For at beregne entrapment effektivitet og narkotika belastning af liposomer, opløse liposomer i Triton X-100. Injicer 20 mikroliter af den opløste liposomprøve i et højtryksvæskekromatografisystem med en kvaternær pumpe, en diodearraydetektor, der er indstillet til 230 nanometer, og et tremikrometer, 250 gange-4,6 millimeter kolonne. For at forberede transgene zebrafisk larver til injektion, bruge fine-tip kraftforkreter til manuelt dechorionate 30 timer efter befrugtning embryoner, og lad embryonerne til at udvikle ved 28,5 grader Celsius indtil to dage efter befrugtning.Når embryonerne har nået det rette stadium, fortyndes en frisklavet liposom formulering i et en-til-en forhold i steril PBS, og opløsningen blandes i to til tre sekunder ved at hvirvle. Hæld nok 3% methyl cellulose i E3 medium i låget af en lille, 35-millimeter kultur skål låg til at danne en tynd film, der dækker hele overfladen. Brug en plastoverførselspipette til at indsamle en pulje på ca. 20 til 25 bedøvede larver.Lad embryonerne koncentrere sig i spidsen af pipetten ved hjælp af tyngdekraften, og overfør forsigtigt larverne ind i midten af det 35 millimeter kulturskålslåg med minimal opløsning. Brug en mikrokapillær læsser til at arrangere larverne med deres anteriorer mod toppen af injektionspladen med dorsaloverfladen vendt mod mikroinjektionsnålen til injektion i hindbrainsyrkel eller med deres forreste mod venstre side af injektionspladen med ventrale overflader vendt mod mikroinjektionsnålen til injektion i sinusvenosus. Brug en mikrokapillær læsser til at fylde en injektionsnål med ca. fem mikroliter af liposominjektionsblandingen.Fastbevar nålen i en mikromanipulator, der er forbundet med et magnetisk stativ og en trykinjektor, og placer opsætningen under et stereomikroskop. Brug rene, fine-tip kraftpind til at skære spidsen af mikroinjektion nålen til at generere en åbning på ca fem mikrometer i diameter. Indstil injektoren til en puls varighed på ca 50 millisekunder og en injektion tryk på ca 40 pounds per kvadrattomme.Indsprøjt en bolus i en dråbe mineralsk olie placeret over gitterlinjerne i et hæmocytometer for at kalibrere det volumen, der skal injiceres. Juster derefter pulsens varighed og/eller injektionstrykket, indtil bolusdiameteren dækker 2 1/2 af de mindste gitterlinjer. Injicer forsigtigt en nanoliter af liposom injektion mix i baghjernen ventrikel af hver larver.Umiddelbart efter injektionerne tilsættes E3-mediet til injektionspladen, og der anvendes en plastoverførselspipette til forsigtigt at omrøre larverne ud af methylcellulose. For at forestille sig baghjernens dorsale overflade på et konfokalt mikroskop udstyret med en vandnedsænkningslinse, skal du først fylde en 35-millimeter kulturskål til en dybde på fem millimeter med monteringsmedium og lade mediumpolymerisere. Udgrave en lille grøft i agarose af tilstrækkeligt område til at rumme æggeblomme sæk af den eksperimentelle embryo, og bruge en plast overførsel pipette fyldt med smeltet montering medium til at indsamle en bedøvet larver.Straks deponere larver i kultur parabol, og bruge en mikrokapillende loader til at orientere blomme sakken ventrale side ned i de udgravede huller. Vedligehold embryonet i denne position, indtil agarose polymerizes. Overlejre embryonet med E3-medium suppleret med 200 mikrogram pr. milliliter tricain.For at levende billede hindbrain hjertekammer, skal du vælge 20x mål, og indstille konfokale mikroskop til 512 med 512 pixels og en 2,5 x zoom. Når mikroskop parametrene er blevet indstillet, erhverve 40-by-tre-mikrometer Z-stakke strækker sig fra dorsal-mest overflade af baghjernen ved hjælp af to-kanals billeddannelse til billede af de blå fluorescerende liposomer og grønne fluorescerende makrofager. Når alle billederne er hentet, skal du indlæse filerne i et passende 3D-billedanalysesoftwareprogram.Træk protokollen Find objekter til pladsen Træk opgaver her for at foretage målinger under fanen Måling. Vælg DAPI-kanalen for at fremhæve liposomerne, og træk undersøgværktøjet gennem Z-sektionerne for at registrere de liposome-belæssede makrofager. Hvis du vil kvantificere fluorescensintensiteten af liposomer i de enkelte celler, skal du trække protokollen Klip til interesseområder til trækopgaverne hertil for at gøre måleplads og bruge rektangelværktøjet til at tegne en boks rundt om interessecellen i dimensionerne X, Y og Z.Vælg derefter Gør måleelement i rullemenuen Målinger for at oprette en målefil i biblioteksvinduet. I denne tabel, er størrelsen, zeta potentiale, narkotika lastning, og entrapment effektivitet af de producerede liposomer opsummeres. Som observeret, partikelstørrelsen af liposomer er ens med og uden narkotika belastning, selv om overfladen afgift af narkotika-loaded liposomer er lidt mere neutral end kontrol liposomer med marine blå alene.Mikroinjektion af marine blå-mærkede liposomer i baghjernen ventrikel, som påvist, resulterer i en hurtig optagelse af hjemmehørende makrofager, der let kan kvantificeres ved konfokal mikroskopi ved tre timer efter injektion. Neutrofiler, dog, er sjældent observeret for at indeholde intracellulære liposomer. Inden for individuelle liposom-laden makrofager, liposomer ophobes i de fagagolysosomale rum, som er nødvendig for liposom nedbrydning og efterfølgende stofindhold frigivelse i cytoplasmaet.Levering i sinus venosus kan levere liposomer til caudal hæmatopoietiske væv-hjemmehørende makrofager via cirkulationen. Mikroinjektion af liposomer lastet med mitokondrielle-reaktive ilt arter-hæmmende stof i baghjernen ventrikel kan i væsentlig grad undertrykke mononatrium urat krystal-drevet mitokondrielle-reaktive ilt arter produktion inden liposome-lastet hindbrain-hjemmehørende makrofager. Yderligere validering af de undertrykkende virkninger af lægemidler af interesse på makrofag aktivering stater kan udføres ved at undersøge proinflammatoriske cytokin genekspression af hele mount in situ hybridisering og den tidsmæssige rekruttering af neutrofiler.Ved hjælp af denne teknik, vi har været i stand til at målrette lægemidler til makrofager for at bekræfte, at en immunometabolisk mekanisme driver deres aktivering i en larve zebrafisk model af akut gigt betændelse. Fremtidige tilpasninger af denne protokol kan omfatte udførelse overflade ændring af liposomet til at forbedre makrofag målretning eller fremme målretning til andre immunceller, såsom neutrofiler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humaniseret Mouse Model til Study bakterieinfektioner Målretning mikrovaskulaturen

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Anvendelse af<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; For at studere autofagi-Cytoskeleton interaktioner

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere antisvampeaktivitet Isoleret alveolære makrofager ved konfokal mikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Stærkt Effektiv Transfektion af menneskelige THP-1 makrofager ved nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modeling Mucosal Candidiasis i Larve Zebrafisk af swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomisk Profilering af makrofager ved 2D elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Ikke-invasiv billeddannelse af Innate immunrespons i en zebrafisk Larve Model af<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantificering af Cytosolisk vs. vakuolær<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primære Makrofager af Differential Permeabilisering

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fænotypisk karakterisering af makrofager fra rottenyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Brug zebrafisk modeller af human influenza A-virus infektioner at Screen antivirale lægemidler og karakterisere værtsimmunsystem Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...