Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) en Z.W. (Faculty Research Development Fund van de Universiteit van Auckland). De auteurs bedanken Alhad Mahagaonkar voor deskundig beheer van de zebravis faciliteit, de Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, Universiteit van Auckland voor hulp bij confocale beeldvorming en Graham Lieschke voor gifting de Tg (mpeg1:EGFP) reporter lijn.

1. Voorbereiding van drug-geladen Marina Blue-gelabeld Liposomen
OPMERKING: Liposomen die de blauwe fluorescerende kleurstof, Marina Blue en drug worden bereid met behulp van een dunne film hydratatie methode met post inbrengen van poloxamer 188. Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Controle liposomen dragen alleen Marina blauw en PBS. Het voorbeeld hier beschrijft het laden van liposomen met een mitochondria-targeting antioxidant drug<sup class="xref...

<ol>
	<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Krenkel, O., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+macrophages+in+tissue+homeostasis+and+disease.">Liver macrophages in tissue homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).</li><li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+immunology:+turning+macrophages+on,+off+and+on+again.">Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).</li><li>Lawrence, T., Natoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+macrophage+polarization:+enabling+diversity+with+identity.">Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoresponsive+gene+1+augments+bactericidal+activity+of+macrophage-lineage+cells+by+regulating+beta-oxidation-dependent+mitochondrial+ROS+production.">Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production.</a> Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+fatty+acid-fueled+mROS+production+within+macrophages+alleviates+acute+gouty+inflammation.">Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).</li><li>Cambier, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+manipulate+macrophage+recruitment+through+coordinated+use+of+membrane+lipids.">Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids.</a> Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Madigan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrophage+Response+to+Mycobacterium+leprae+Phenolic+Glycolipid+Initiates+Nerve+Damage+in+Leprosy.">A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy.</a> Cell. 170 (5), 973-985 (2017).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lta4h+locus+modulates+susceptibility+to+mycobacterial+infection+in+zebrafish+and+humans.">The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans.</a> Cell. 140 (5), 717-730 (2010).</li><li>Volkman, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+granuloma+induction+via+interaction+of+a+bacterial+secreted+protein+with+host+epithelium.">Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium.</a> Science. 327 (5964), 466-469 (2010).</li><li>Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+the+future+of+drug+discovery:+in+vivo+chemical+screens+in+zebrafish.">Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish.</a> ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+nanoparticles:+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer.">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers.">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).</li><li>Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stealth+liposomes:+review+of+the+basic+science,+rationale,+and+clinical+applications,+existing+and+potential.">Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential.</a> International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+cells+and+bacterial+infection+in+zebrafish.">Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-insertion+of+poloxamer+188+strengthened+liposomal+membrane+and+reduced+drug+irritancy+and+in+vivo+precipitation,+superior+to+PEGylation.">Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation.</a> Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome-Mediated+Drug+Delivery+in+Larval+Zebrafish+to+Manipulate+Macrophage+Function.">Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function.</a> Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).</li><li>Cader, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C13orf31+(FAMIN)+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function.">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes.">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages:+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification.">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li><li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+zebrafish+leukocytes.">Live cell imaging of zebrafish leukocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rag-Ragulator+Complex+Regulates+Lysosome+Function+and+Phagocytic+Flux+in+Microglia.">The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia.</a> Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+to+macrophages:+role+of+physicochemical+properties+of+particulate+carriers--liposomes+and+microspheres--on+the+phagocytosis+by+macrophages.">Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).</li><li>Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+macrophages+initiating+and+driving+inflammation+in+a+monosodium+urate+monohydrate+crystal-induced+murine+peritoneal+model+of+acute+gout.">Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).</li><li>Faires, J. S., McCarty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+arthritis+in+man+and+dog+after+intrasynovial+injection+of+sodium+urate+crystals.">Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals.</a> Lancet. 280, 682-685 (1962).</li><li>Martin, W. J., Harper, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+inflammation+and+resolution+in+acute+gout.">Innate inflammation and resolution in acute gout.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).</li><li>Fenaroli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+drug+delivery+system+against+tuberculosis+in+zebrafish+embryos:+direct+visualization+and+treatment.">Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment.</a> ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).</li><li>Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Neutrophilic+Inflammation+Using+Polymersome-Mediated+Cellular+Delivery.">Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery.</a> Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li><li>Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+liposomal+drug+delivery+to+monocytes+and+macrophages.">Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).</li><li>Fidler, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+liposomes+to+improve+delivery+of+macrophage-augmenting+agents+to+alveolar+macrophages.">Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages.</a> Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).</li><li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish:+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis.">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li></ol>

Hier hebben we een gedetailleerd protocol om met drugs geladen liposomen te formuleren om specifiek macrofagen bij larve zebravissen aan te pakken. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van macrofagen in bepaalde ziektemodellen te ontleden door te zorgen voor directe gerichte levering van geneesmiddelen specifiek aan macrofagen. Bovendien kan het worden gebruikt wanneer de algemene toxiciteit van geneesmiddelen het gebruik ervan beperkt wanneer ze worden geleverd door meer conventionele routes, zoals onderdompeling....

Het mononucleaire fagocytesysteem biedt een eerste verdedigingslinie tegen binnendringende ziekteverwekkers. Dit systeem bestaat uit monocyten, monocyten-afgeleide dendritische cellen en macrofagen, die actief fagocytoze vreemde ziekteverwekkers, waardoor de verspreiding van ziekteverwekkers wordt beperkt. Naast deze fagocytische en microbicidale effectorfuncties zijn dendritische cellen en macrofagen ook in staat cytokineproductie en antigeenpresentatie om het adaptieve immuunsysteem te activeren1. Van deze cellen hebben macrofagen bijzondere aandacht gekregen vanwege hun diverse functionele heterogeniteit en betrokkenheid bij meervoudige ontstekingsziekten, van auto-immuniteit en infectieziekten tot kanker2,3,4,5,6,7. De plasticiteit van macrofagen en hun vermogen om zich functioneel aan te passen aan de behoeften aan hun weefselomgeving vereisen experimentele benaderingen om deze cellen in vivo rechtstreeks te observeren en te ondervragen.
Larve zebravissen zijn een ideaal model organisme waarmee de functie en plasticiteit van macrofagen in vivo8te bestuderen. De optische transparantie van larve zebravissen biedt een venster om het gedrag van macrofagen direct te observeren, vooral in combinatie met macrofaagmarkeringtransgene reporterlijnen. Het benutten van het levende beeldvormingspotentieel en de experimentele traktaat van larvezebravissen heeft geleid tot veel significante inzichten in de macrofaagfunctie die direct relevant zijn voor de menselijke ziekte9,10,11,12,13,14,15. Veel van deze studies hebben ook gebruik gemaakt van de hoge instandhouding van de activiteit van drugs bij zebravissen (een attribuut dat hun gebruik als een hele dierlijke drug discovery platform16,17,18), door gebruik te maken van chemische interventies om farmacologisch te manipuleren macrofaag functie. Tot op heden zijn deze farmacologische behandelingen meestal geleverd door onderdompeling, waardoor het medicijn in water oplosbaar moet zijn, of door directe micro-injectie van vrij geneesmiddel(figuur 1A). Beperkingen van deze passieve leveringsstrategieën omvatten off-target effecten en algemene toxiciteit die de beoordeling van eventuele gevolgen voor de macrofaagfunctie kunnen uitsluiten. Bovendien, bij het onderzoeken van drugseffecten op macrofagen is het onbekend of de geneesmiddelen handelen op de macrofagen zelf of door meer indirecte mechanismen. Bij het uitvoeren van soortgelijke chemische interventie studies om macrofaag functie te onderzoeken, erkenden we dat er een onvervulde noodzaak om een goedkope en eenvoudige leveringsmethode te ontwikkelen om drugs specifiek richten op macrofagen.
Liposomen zijn microscopisch, biocompatibel, lipide tweelaagse blaasjes die eiwitten, nucleotiden en drugslading kunnen inkapselen19. De unilamellar of multilamellar lipide bilayer structuur van liposomen vormt een waterig binnenlumen waar in water oplosbare geneesmiddelen kunnen worden opgenomen, terwijl hydrofobe geneesmiddelen kunnen worden geïntegreerd in de lipide membranen. Bovendien kunnen de fysischchemische eigenschappen van liposomen, waaronder grootte, lading en oppervlaktemodificaties, worden gemanipuleerd om hun targeting af te stemmen op specifieke cellen20,21. Deze kenmerken van liposomen hebben ze een aantrekkelijk voertuig om drugs te leveren en de precisie van de huidige behandeling regimes20te verbeteren. Aangezien liposomen van nature worden gefagocytozed door macrofagen (een functie die wordt uitgebuit door hun routinematiggebruik bij het specifiek leveren van clodronaat aan macrofagen voor ablatieexperimenten22),presenteren zij zich als een aantrekkelijke optie voor macrofaagspecifieke geneesmiddelenlevering(figuur 1B).
Dit protocol beschrijft de formulering van geneesmiddelen in blauwe fluorescerende liposomen bekleed met de hydrofiele polymeer poloxamer 188, dat vormt een beschermende laag op het liposoom oppervlak en is aangetoond dat het behoud van geneesmiddelen te verbeteren en hebben superieure biocompatibiliteit23. Poloxamer werd gekozen voor oppervlaktecoating van liposomen, omdat ons vorige onderzoek had aangetoond dat, in vergelijking met polyethyleenglycol gemodificeerde liposomen, poloxamer gemodificeerde liposomen betere biocompatibiliteit vertoonden na onderhuidse injectie van rattenpoten en soortgelijke farmacokinetiek bij konijnen na intraveneuze infusie23. Protocollen worden ook beschreven voor hun micro-injectie in larve zebravissen en live beeldvorming om hun macrofaag-targeting vermogen en lokalisatie te beoordelen naar intracellulaire compartimenten die nodig zijn voor liposoomafbraak en cytoplasmatische drug levering. Als proof-of-concept hebben we deze techniek eerder gebruikt om twee geneesmiddelen op macrofagen te richten om hun activering te onderdrukken in een larve zebravismodel van acute jichtontsteking24. Deze drug levering techniek breidt de chemische "toolkit" beschikbaar voor zebravis onderzoekers willen macrofaag-targeting van hun drugs van belang te waarborgen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Zebravissen (Danio rerio) larven hebben zich ontwikkeld tot een populair model om gastheer-pathogene interacties en de bijdrage van aangeboren immuuncellen aan ontstekingsziekten te wijten aan hun functioneel bewaard gebleven immuunsysteem te onderzoeken. Ze worden ook veel gebruikt om te onderzoeken hoe aangeboren immuuncellen helpen bij het begeleiden van ontwikkelingsprocessen. Door gebruik te maken van de optische transparantie en genetische aallaatbaarheid van larve zebravissen, richten deze studies zich vaak op live beeldvormingsbenaderingen om fluorescerend gemarkeerde macrofagen en neutrofielen binnen intacte dieren functioneel te karakteriseren. Door hun diverse functionele heterogeniteit en steeds groeiende rollen bij pathogenese van ziekten, hebben macrofagen veel aandacht gekregen. Naast genetische manipulaties worden chemische interventies nu routinematig gebruikt om macrofaaggedrag bij larve zebravissen te manipuleren en te onderzoeken. Levering van deze geneesmiddelen is meestal beperkt tot passieve targeting van gratis drug door middel van directe onderdompeling of micro-injectie. Deze benaderingen vertrouwen op de veronderstelling dat eventuele veranderingen in macrofaaggedrag het resultaat zijn van een direct effect van het medicijn op de macrofagen zelf, en niet een stroomafwaarts gevolg van een direct effect op een ander celtype. Hier presenteren we onze protocollen voor het specifiek richten van drugs op larve zebravissen macrofagen door microinjecterende door drugs geladen fluorescerende liposomen. We onthullen dat poloxamer 188-gemodificeerde drug-loaded blauwe fluorescerende liposomen gemakkelijk worden opgenomen door macrofagen, en niet door neutrofielen. We leveren ook bewijs dat drugs die op deze manier worden geleverd, macrofaagactiviteit kunnen beïnvloeden op een manier die in overeenstemming is met het werkingsmechanisme van het medicijn. Deze techniek zal van waarde zijn voor onderzoekers die ervoor willen zorgen dat geneesmiddelen worden gericht op macrofagen en wanneer geneesmiddelen te giftig zijn om te worden geleverd met traditionele methoden zoals onderdompeling.

De dunne film hydratatie aanpak hier beschreven voor de voorbereiding van fluorescerende liposomen omsluiten van drugs is een eenvoudige en kosteneffectieve methode. Met het protocol dat in deze studie wordt gebruikt, zullen de liposomen naar verwachting unilamellar23,24zijn. De grootte, zeta potentieel, drug laden en beknelling efficiëntie van de geproduceerde liposomen zijn samengevat in tabel 1. De deeltjesgrootte van de liposomen (voor en na...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Hier beschrijven we de synthese van door drugs geladen liposomen en hun micro-injectie in larve zebravissen met als doel de levering van geneesmiddelen aan macrofaagcellen te richten.

Targeting Drugs aan Larvale Zebrafish Macrofagen door injecterendrug-loaded Liposomen

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Dit protocol beschrijft een techniek voor het richten van geneesmiddelen van belang zijn op larve zebravis macrofagen te manipuleren en te evalueren macrofaag functie. Deze techniek heeft voordelen ten opzichte van traditionele drug delivery strategieën zoals onderdompeling door ervoor te zorgen dat de drugs specifiek zijn gericht op macrofagen door liposoom inkapseling. Wanneer toegepast op zebravismodellen van ziekte met een ontstekingscomponent, heeft deze techniek het potentieel om op te lossen hoe macrofagen bijdragen aan pathologische processen.Hier demonstreren we het nut van deze techniek door ons te richten op een mitochondriaal-reactief zuurstofsoortremmend medicijn tot macrofagen om activering te onderdrukken. De micro-injectie van door geneesmiddelen geladen liposomen in larven kan een uitdaging zijn, omdat ervoor moet worden gezorgd dat er geen overmatige epitheliale schade wordt veroorzaakt, wat mogelijk immunologische studies beïnvloedt. Visuele demonstratie van dit protocol is belangrijk omdat het gaat om farmacologische en hele dierlijke levende celmethoden die niet routinematig in één laboratorium kunnen worden uitgevoerd.Om 10 milligram liposomen in een kolf van 25 milliliter ronde bodem te bereiden, voeg 31 nanomolars zeeblauw en 300 nanomolars van een mitochondriaal-reactief zuurstofsoortremmend medicijn toe aan de kolf. Sonicate kort om volledig op te lossen, en verwijder het oplosmiddel langzaam op een roterende verdamper set over een 45-graden Celsius waterbad op 75 rotaties per minuut onder vacuümdruk. Wanneer zich een droge lipide dunne film heeft gevormd binnen de glazen wanden van de kolf, verder drogen van de film gedurende 45 minuten onder stikstof om de volledige verwijdering van het organische oplosmiddel te vergemakkelijken.Hydrateer vervolgens de film met een milliliter PBS en verzegel de kolf met paraffinefilm voordat u de kolf 20 minuten met de hand over een waterbad van 60 graden Celsius roert. Na zeven cycli van bevriezing en ontdooien, gebruik maken van een mini-extruder en een micrometer track-geëtste polycarbonaat membranen om de liposomen extruderen voor twee tot zes cycli. Wanneer grote unilamellar aderelingen zijn verkregen, condenseren de verse liposomen in een pellet door ultracentrifugatie.Incubeer de pellet met een milliliter van 1%poloxamer 188 oplossing gedurende 30 minuten bij 45 graden Celsius en 750 rotaties per minuut in een ThermoMixer met een twee-milliliter microcentrifuge buis bevestiging. Tijdens het inbrengen na het inbrengen van poloxamer 188 in de liposomen zijn de juiste poloxamerconcentratie, incubatietijd en temperatuur belangrijk voor het bereiken van de optimale fysisch-chemische kenmerken van de resulterende liposomen. Aan het einde van de incubatie, ultracentrifuge het mengsel weer onder dezelfde centrifuge voorwaarden, en verwijder de supernatant met een niet-gebonden polymeer of drug.Bewaar vervolgens de liposoom pellets op vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Om de grootte en zeta potentieel van de liposomen te bepalen, verdun de liposoom formulering met ultrazuiver water op een one-to-100 verhouding. Gebruik een dynamische lichtverstrooiingsanalyseer om de deeltjesgrootte, polydispersiteitsindex en zeta-potentieel in drievoud bij 25 graden Celsius te meten.Los de liposomen op in Triton X-100 om de beknellingsefficiëntie en het laden van de liposomen te berekenen. Injecteer 20 microliter van het opgeloste liposoommonster in een hogedrukwindchromatografiesysteem met een quaternaire pomp, een diodearramtor op 230 nanometer en een drie-micrometer, 250-keer-4,6-millimeter kolom. Om transgene zebravislarven voor te bereiden op de injectie, gebruikt u fijnpuntskrachten om 30 uur na de bevruchting van embryo's handmatig te dechorioneren en de embryo's zich bij 28,5 graden Celsius te laten ontwikkelen tot twee dagen na de bevruchting.Wanneer de embryo's het juiste stadium hebben bereikt, verdun een vers bereide liposoomformulering bij een één-op-één verhouding in steriele PBS en meng de oplossing gedurende twee tot drie seconden door vortexing. Giet voldoende 3%methylcellulose in E3 medium in het deksel van een kleine, 35-millimeter kweekschotel deksel om een dunne film te vormen die het hele oppervlak bedekt. Gebruik een plastic transfer pipet om een poel van ongeveer 20 tot 25 verdoofde larven te verzamelen.Laat de embryo's zich concentreren op het puntje van de pipet door de zwaartekracht en breng de larven voorzichtig over in het midden van het 35-millimeter kweekschoteldeksel met minimale oplossing. Gebruik een microcapillaire lader om de larven met hun voorlopers naar de bovenkant van de injectieplaat te schikken met het dorsale oppervlak dat naar de microinjectienaald gericht is voor injectie in de achterspierven of met hun voorlopers links van de injectieplaat met de ventrale oppervlakken die naar de microinjectienaald gericht zijn voor injectie in de sinusvenosus. Gebruik een microcapillaire lader om een injectienaald te vullen met ongeveer vijf microliters van de liposoom injectiemix.Monteer de naald in een micromanipulator aangesloten op een magnetische standaard en een drukinjector, en plaats de setup onder een stereomicroscoop. Gebruik schone, fijne-tip tangen om de punt van de micro-injectie naald te snijden om een opening van ongeveer vijf micrometer in diameter te genereren. Stel de injector op een pulsduur van ongeveer 50 milliseconden en een injectiedruk van ongeveer 40 pond per vierkante inch.Injecteer een bolus in een druppel minerale olie die over de rasterlijnen van een hemocytometer wordt geplaatst om het te injecteren volume te kalibreren. Pas vervolgens de pulsduur en/of de injectiedruk aan totdat de diameter van de bolus 2 1/2 van de kleinste rasterlijnen bedekt. Injecteer voorzichtig een nanoliter van de liposoom injectiemix in de achterhersenenvenkel van elke larven.Voeg onmiddellijk na de injecties E3-medium toe aan de injectieplaat en gebruik een plastic transferpipet om de larven voorzichtig uit de methylcellulose te roeren. Om het dorsale oppervlak van het achterbrein op een confocale microscoop uitgerust met een wateronderdompelingslens in beeld te brengen, vul je eerst een 35-millimeter kweekschotel tot een diepte van vijf millimeter met montagemedium en laat het medium polymeriseren. Graaf een kleine geul in de agarose van voldoende gebied om de dooier zak van het experimentele embryo tegemoet te komen, en gebruik een plastic overdracht pipet gevuld met molten montage medium om een verdoofde larve te verzamelen.Deponeer de larve onmiddellijk in de kweekschaal en gebruik een microcapillaire lader om de dooier sac ventrale kant naar beneden te oriënteren in de opgegraven gaten. Houd het embryo in deze positie totdat de agarose polymeriseert. Overlay het embryo met E3 medium aangevuld met 200 microgram per milliliter tricaine.Als u de achterstebrainvenkel wilt livebeelden, selecteert u de 20x-doelstelling en stelt u de confocale microscoop in op 512 bij 512 pixels en een zoom van 2,5x. Wanneer de microscoop parameters zijn ingesteld, verwerven 40-bij-drie-micrometer Z-stapels die zich uitstrekken van dorsale-meest oppervlak van het achterstebrain met behulp van twee-kanaals beeldvorming aan de blauwe fluorescerende liposomen en groene fluorescerende macrofagen beeld. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, laadt u de bestanden in een geschikt 3D-softwareprogramma voor beeldanalyse.Sleep onder het tabblad Meten het protocol Objecten zoeken naar de ruimte Taken slepen hier om metingen te maken. Selecteer het DAPI-kanaal om de liposomen te markeren en sleep het gereedschap Inspecteren door de Z-secties om de met liposoom beladen macrofagen te detecteren. Als u de fluorescentieintensiteit van liposomen in de afzonderlijke cellen wilt kwantificeren, sleept u het protocol Clip naar regio's van belang naar de ruimte Taken slepen hier om metingen te maken en gebruikt u het gereedschap Rechthoek om een vak te tekenen rond de interessecel in de dimensies X, Y en Z.Selecteer vervolgens Meetitem maken in het vervolgkeuzemenu Metingen om een meetbestand in het bibliotheekvenster te genereren. In deze tabel worden de grootte, zeta-potentieel, het laden van drugs en de beknellingsefficiëntie van de geproduceerde liposomen samengevat. Zoals waargenomen, is de deeltjesgrootte van de liposomen vergelijkbaar met en zonder drugsbelasting, hoewel de oppervlaktelading van door drugs geladen liposomen iets neutraler is dan de controleliposomen met alleen zeeblauw.Microinjectie van mariene blauw-gelabelde liposomen in de achterscheuren ventrikel, zoals aangetoond, resulteert in een snelle opname door resident macrofagen die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd door confocale microscopie door drie uur na injectie. Neutrofielen worden echter zelden waargenomen om intracellulaire liposomen te bevatten. Binnen individuele liposoom-beladen macrofagen, de liposomen accumuleren binnen de fagolysosomale compartimenten, die nodig is voor liposoom afbraak en de daaropvolgende drug inhoud release in het cytoplasma.Levering in de sinus venosus kan de liposomen leveren aan caudale hematopoietische weefsel-ingezetene macrofagen via de circulatie. Microinjectie van liposomen geladen met de mitochondriaal-reactieve zuurstof soorten-remmende drug in de hindbrain ventrikel kan aanzienlijk onderdrukken mononatrium urate kristal-gedreven mitochondriaal-reactieve zuurstof soorten productie binnen lipososome-beladen hindbrain-resident macrofagen. Verdere validatie van de onderdrukkende effecten van geneesmiddelen van belang op macrofaag activering staten kunnen worden uitgevoerd door het onderzoeken van proinflammerende cytokine genexpressie door hele mount in situ hybridisatie en de tijdelijke werving van neutrofielen.Met behulp van deze techniek, hebben we in staat geweest om medicijnen te richten op macrofagen om te bevestigen dat een immunometabolisch mechanisme hun activering drijft in een larven zebravis model van acute jichtontsteking. Toekomstige aanpassingen van dit protocol kunnen het uitvoeren van oppervlaktemodificatie van het liposoom omvatten om macrofaagtargeting te verbeteren of om targeting op andere immuuncellen, zoals neutrofielen, te bevorderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; Salmonella</em&gt; In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...