Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par des subventions accordées à C.J.H. (Health Research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) et Z.W. (Faculty Research Development Fund de l’Université d’Auckland). Les auteurs remercient Alhad Mahagaonkar pour la gestion experte de l’installation de poisson zèbre, de l’unité de recherche en imagerie biomédicale, de l’école des sciences médicales, de l’Université d’Auckland pour son aide en imagerie confocale et graham Lieschke d’avoir offert la ligne de journalistes Tg(mpeg1:EGFP).

1. Préparation de Liposomes à étiquette bleue Marina
REMARQUE: Liposomes portant le colorant fluorescent bleu, Marina Blue et la drogue sont préparés en utilisant une méthode d’hydratation mince film avec l’insertion post de poloxamer 188. Toutes les procédures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Les liposomes de contrôle ne portent que Le bleu Marina et le PBS. L’exemple décrit ici le chargement de liposomes avec un médicament antioxydant mitoch...

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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C13orf31+(FAMIN)+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function.">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes.">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages:+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification.">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li><li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li><li>Rosen, J. 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Ici, nous avons fourni un protocole détaillé pour formuler des liposomes chargés de médicaments pour cibler spécifiquement les macrophages chez les poissons zèbres larvaires. Cette méthode peut être utilisée pour disséquer le rôle des macrophages dans certains modèles de maladies en assurant l’administration ciblée directe de médicaments spécifiquement aux macrophages. En outre, il peut être utilisé lorsque la toxicité générale des médicaments limite leur utilisation lorsqu’ils sont livrés par d...

Le système de phagocytemono mononucléaire fournit une première ligne de défense contre les agents pathogènes envahissants. Ce système se compose de monocytes, de cellules dendritiques dérivées de monocytes et de macrophages, qui phagocytos activement les agents pathogènes étrangers, limitant ainsi la propagation des agents pathogènes. En plus de ces fonctions d’effectrice phagocytique et microbicides, les cellules dendritiques et les macrophages sont également capables de produire de la cytokine et de présenter des antigènes pour activer le système immunitaire adaptatif1. Parmi ces cellules, les macrophages ont reçu une attention particulière en raison de leur hétérogénéité fonctionnelle diversifiée et de leur implication dans de multiples maladies inflammatoires, de l’auto-immunité et des maladies infectieuses au cancer2,3,4,5,6,7. La plasticité des macrophages et leur capacité à s’adapter fonctionnellement aux besoins de leur environnement tissulaire nécessite des approches expérimentales pour observer et interroger directement ces cellules in vivo.
Le poisson zèbre larvaire est un organisme modèle idéal pour étudier la fonction et la plasticité des macrophages in vivo8. La transparence optique du poisson zèbre larvaire offre une fenêtre pour observer directement le comportement des macrophages, en particulier lorsqu’il est couplé avec des lignes de reporter transgéniques de marquage macrophage. Exploiter le potentiel d’imagerie en direct et la tractabilité expérimentale du poisson zèbre larvaire a conduit à de nombreuses idées significatives dans la fonction macrophage qui ont une pertinence directe à la maladie humaine9,10,11,12,13,14,15. Bon nombre de ces études ont également profité de la forte conservation de l’activité des drogues chez le poisson zèbre (un attribut qui sous-tend leur utilisation comme une plate-forme de découverte de médicaments animaux16,17,18), en utilisant des interventions chimiques pour manipuler pharmacologiquement la fonction macrophage. Jusqu’à présent, ces traitements pharmacologiques ont été pour la plupart administrés soit par immersion, ce qui exige que le médicament soit soluble dans l’eau, soit par microinjection directe de médicaments gratuits (Figure 1A). Les limites de ces stratégies d’administration passive comprennent des effets hors cible et une toxicité générale qui peuvent empêcher d’évaluer tout impact sur la fonction de macrophage. En outre, lors de l’étude des effets des drogues sur les macrophages, on ne sait pas si les médicaments agissent sur les macrophages eux-mêmes ou par des mécanismes plus indirects. Lors de l’exécution d’études d’intervention chimique similaires pour étudier la fonction de macrophage, nous avons reconnu qu’il y avait un besoin non satisfait de développer une méthode d’administration peu coûteuse et simple pour cibler les médicaments spécifiquement aux macrophages.
Les liposomes sont des vésicules bicouches microscopiques, biocompatibles et lipidiques qui peuvent encapsuler les protéines, les nucléotides et la cargaison de médicaments19. La structure bicouche lipidique unilamellar ou multilamellar des liposomes forme un lumen intérieur aqueux où les drogues solubles dans l’eau peuvent être incorporées tandis que les drogues hydrophobes peuvent être intégrées dans les membranes lipidiques. En outre, les propriétés physicochimiques des liposomes, y compris la taille, la charge et les modifications de surface peuvent être manipulées pour adapter leur ciblage à des cellules spécifiques20,21. Ces caractéristiques des liposomes ont fait d’eux un véhicule attrayant pour livrer des médicaments et d’améliorer la précision des régimes de traitement actuels20. Comme les liposomes sont naturellement phagocytozed par les macrophages (une caractéristique exploitée par leur utilisation courante dans la livraison de clodronate spécifiquement aux macrophages pour les expériences d’ablation22), ils présentent comme une option attrayante pour l’administration de médicaments spécifiques aux macrophages (Figure 1B).
Ce protocole décrit la formulation des médicaments en liposomes fluorescents bleus recouverts du poloxamer 188 polymère hydrophile, qui forme une couche protectrice sur la surface liposome et a été montré pour augmenter la conservation de drogue et ont la biocompatibilité supérieure23. Poloxamer a été choisi pour le revêtement de surface des liposomes comme notre recherche précédente avait montré que, par rapport aux liposomes modifiés de polyéthylène glycol, les liposomes modifiés de poloxamer ont montré une meilleure biocompatibilité suivant l’injection sous-cutanée des pattes de rat et pharmacocinétique semblable dans les lapins suivant l’infusion intraveineuse23. Des protocoles sont également décrits pour leur microinjection dans le poisson zèbre larvaire et la formation image vivante pour évaluer leur capacité de ciblage de macrophage et la localisation aux compartiments intracellulaires nécessaires pour la dégradation de liposome et l’administration cytoplasmique de drogue. Comme preuve de concept, nous avons déjà utilisé cette technique pour cibler deux médicaments aux macrophages pour supprimer leur activation dans un modèle larvaire de poisson zèbre de l’inflammation goutte aigu24. Cette technique d’administration de médicaments élargit la « boîte à outils » chimique à la disposition des chercheurs sur le poisson zèbre qui veulent assurer le ciblage des macrophages de leurs médicaments d’intérêt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
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		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Les larves de poisson zèbre (Danio rerio) sont devenues un modèle populaire pour étudier les interactions hôte-pathogène et la contribution des cellules immunitaires innées aux maladies inflammatoires en raison de leur système immunitaire inné fonctionnellement conservé. Ils sont également largement utilisés pour examiner comment les cellules immunitaires innées aident à guider les processus de développement. En tirant parti de la transparence optique et de la tractabilité génétique du poisson zèbre larvaire, ces études se concentrent souvent sur des approches d’imagerie vivante pour caractériser fonctionnellement les macrophages et les neutrophiles fluorescents marqués chez les animaux intacts. En raison de leur hétérogénéité fonctionnelle diverse et de leurs rôles sans cesse croissants dans la pathogénie de la maladie, les macrophages ont reçu une attention considérable. En plus des manipulations génétiques, les interventions chimiques sont maintenant couramment utilisées pour manipuler et examiner le comportement des macrophages chez les poissons zèbres larvaires. L’administration de ces médicaments se limite généralement au ciblage passif de médicaments gratuits par immersion directe ou microinjection. Ces approches reposent sur l’hypothèse que tout changement au comportement de macrophage sont le résultat d’un effet direct du médicament sur les macrophages eux-mêmes, et non pas une conséquence en aval d’un effet direct sur un autre type de cellule. Ici, nous présentons nos protocoles pour cibler les médicaments spécifiquement aux macrophages de poissons zèbres larvaires en microinjectant des liposomes fluorescents chargés de médicaments. Nous révélons que les liposomes fluorescents bleus 188-modifiés de poloxamer-chargés de drogue sont facilement pris par des macrophages, et pas par des neutrophiles. Nous fournissons également la preuve que les médicaments livrés de cette façon peuvent avoir un impact sur l’activité des macrophages d’une manière compatible avec le mécanisme d’action du médicament. Cette technique sera utile aux chercheurs qui veulent assurer le ciblage des médicaments aux macrophages et lorsque les médicaments sont trop toxiques pour être livrés par des méthodes traditionnelles comme l’immersion.

L’approche d’hydratation des couches minces décrite ici pour la préparation de liposomes fluorescents enveloppant les médicaments est une méthode simple et rentable. Avec le protocole utilisé dans cette étude, les liposomes devraient être unilamellar23,24. La taille, le potentiel zeta, le chargement des médicaments et l’efficacité du piégeage des liposomes produits sont résumés dans le tableau 1. La taille des particules des lip...

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Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Ici, nous décrivons la synthèse des liposomes drug-charged et de leur microinjection dans le poisson zèbre larvaire dans le but de cibler l’administration de drogue aux cellules de macrophage-lignée.

Cibler les médicaments aux macrophages de poisson zèbre larvaire en injectant des liposomes chargés de drogues

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Ce protocole décrit une technique de ciblage des médicaments d’intérêt pour les macrophages larvaire du poisson zèbre pour manipuler et évaluer la fonction macrophage. Cette technique présente des avantages par rapport aux stratégies traditionnelles d’administration de médicaments, comme l’immersion, en veillant à ce que les médicaments soient spécifiquement ciblés sur les macrophages par encapsulation liposome. Lorsqu’elle est appliquée aux modèles de la maladie du poisson zèbre avec une composante inflammatoire, cette technique a le potentiel de résoudre la façon dont les macrophages contribuent aux processus pathologiques.Ici, nous démontrons l’utilité de cette technique en ciblant un médicament mitochondrial-réactif d’espèce d’oxygène inhibant aux macrophages pour supprimer l’activation. La microinjection de liposomes chargés de drogue en larves peut être difficile, car il faut prendre soin de ne pas causer de dommages épithéliales excessifs, ce qui pourrait influencer les études immunologiques. La démonstration visuelle de ce protocole est importante parce qu’elle implique des méthodologies pharmacologiques et entières de cellules vivantes animales qui peuvent ne pas être exécutées systématiquement dans un seul laboratoire.Pour préparer 10 milligrammes de liposomes dans un flacon rond-fond de 25 millilitres, ajouter 31 nanomolaires de bleu marine et 300 nanomolaires d’un médicament inhibiteur des espèces d’oxygène mitochondriale réactive au flacon. Sonicate brièvement pour dissoudre complètement, et enlever le solvant lentement sur un évaporateur rotatif placé sur un bain d’eau de 45 degrés Celsius à 75 rotations par minute sous pression sous vide. Lorsqu’un film mince lipidique sec s’est formé dans les parois vitrées du flacon, séchez davantage le film pendant 45 minutes sous azote pour faciliter l’élimination complète du solvant organique.Ensuite, hydratez le film avec un millilitre de PBS, et scellez le flacon avec du film de paraffine avant d’agiter le flacon à la main sur un bain d’eau de 60 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après sept cycles de congélation et de décongélation, utilisez un mini-extrudeuse et des membranes en polycarbonate gravées sur voie d’un micromètre pour extruder les liposomes pendant deux à six cycles. Lorsque de grandes vésicules unilamellar ont été obtenues, condensez les liposomes frais en granulés par ultracentrifugation.Incuber la pastille avec une millilitre de 1% poloxamer 188 solution pendant 30 minutes à 45 degrés Celsius et 750 rotations par minute dans un ThermoMixer avec une fixation de tube de microcentrifugeuse de deux millilitres. Pendant l’insertion de poteau du poloxamer 188 dans les liposomes, la concentration correcte de poloxamer, le temps d’incubation, et la température sont importants pour réaliser les caractéristiques physicochimiques optimales des liposomes résultants. À la fin de l’incubation, ultracentrifugez à nouveau le mélange dans les mêmes conditions de centrifugeuse, et retirez le supernatant contenant n’importe quel polymère ou médicament non lié.Rangez ensuite les granulés liposome à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Pour déterminer la taille et le potentiel zeta des liposomes, diluer la formulation liposome avec de l’eau ultrapure à un rapport d’un à 100. Utilisez un analyseur dynamique de diffusion de la lumière pour mesurer la taille des particules, l’indice de polydispersité et le potentiel de zeta en triplicate à 25 degrés Celsius.Pour calculer l’efficacité du piégeage et la charge médicamenteuses des liposomes, dissoudre les liposomes dans Triton X-100. Injectez 20 microlitres de l’échantillon liposome dissous dans un système de chromatographie liquide haute pression avec une pompe quaternaire, un détecteur de réseau de diodes réglé à 230 nanomètres et une colonne de trois micromètres, 250 fois 4,6 millimètres. Pour préparer les larves transgéniques de poisson zèbre à l’injection, utilisez des forceps à pointe fine pour déchorionner manuellement 30 heures d’embryons post-fécondation et permettre aux embryons de se développer à 28,5 degrés Celsius jusqu’à deux jours après la fécondation.Lorsque les embryons ont atteint le stade approprié, diluer une formulation liposome fraîchement préparée à un rapport un pour un dans le PBS stérile, et mélanger la solution pendant deux à trois secondes par vortex. Verser suffisamment de cellulose méthylique à 3 % dans le milieu de l’E3 dans le couvercle d’un petit couvercle de plat de culture de 35 millimètres pour former un film mince couvrant toute la surface. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour recueillir un bassin d’environ 20 à 25 larves anesthésiées.Laissez les embryons se concentrer à l’extrémité de la pipette par gravité, et transférez soigneusement les larves au milieu du couvercle de plat de culture de 35 millimètres avec une solution minimale. Utilisez une chargeuse microcapillaire pour fixer les larves avec leurs antérieurs vers le haut de la plaque d’injection avec la surface dorsale orientée vers l’aiguille de microinjection pour injection dans le ventricule de l’arrière-pensée ou avec leurs antérieurs vers la gauche de la plaque d’injection avec les surfaces ventrales orientées vers l’aiguille de microinjection pour injection dans le venosus sinusal. Utilisez une chargeuse microcapillaire pour remplir une aiguille d’injection d’environ cinq microlitres du mélange d’injection liposome.Montez l’aiguille dans un micromanipulateur relié à un support magnétique et un injecteur de pression, et placez la configuration sous un microscope stéréo. Utilisez des forceps propres à pointe fine pour couper la pointe de l’aiguille de microinjection pour générer une ouverture d’environ cinq micromètres de diamètre. Réglez l’injecteur à une durée d’impulsion d’environ 50 millisecondes et une pression d’injection d’environ 40 livres par pouce carré.Injecter un bolus dans une goutte d’huile minérale placée au-dessus des lignes de grille d’un hémocytomètre pour calibrer le volume à injecter. Ajustez ensuite la durée de l’impulsion et/ou la pression d’injection jusqu’à ce que le diamètre du bolus couvre 2 1/2 des plus petites lignes de grille. Injectez soigneusement un nanolitre du mélange d’injection liposome dans le ventricule postbrain de chaque larves.Immédiatement après les injections, ajouter le milieu E3 à la plaque d’injection et utiliser une pipette de transfert en plastique pour agiter doucement les larves hors de la cellulose méthylique. Pour visualiser la surface dorsale de l’arrière-pays sur un microscope confocal équipé d’une lentille d’immersion d’eau, remplissez d’abord un plat de culture de 35 millimètres à une profondeur de cinq millimètres avec un support de montage, et laissez le milieu polymériser. Creuser une petite tranchée dans l’agarose d’une zone suffisante pour accueillir le sac jaune de l’embryon expérimental, et utiliser une pipette de transfert en plastique rempli de milieu de montage fondu pour recueillir une larve anesthésiée.Déposez immédiatement la larve dans le plat de culture et utilisez une chargeuse microcapillaire pour orienter le côté ventral du sac jaune vers le bas dans les trous excavés. Maintenir l’embryon dans cette position jusqu’à ce que l’agarose polymérise. Superposer l’embryon avec e3 moyen complété avec 200 microgrammes par millilitre de tricaine.Pour vivre l’image du ventricule arrière, sélectionnez l’objectif 20x, et réglez le microscope confocal à 512 par 512 pixels et un zoom de 2,5 x. Lorsque les paramètres du microscope ont été définis, acquérir des piles Z de 40 micromètres sur trois s’étendant de la surface la plus dorsale de l’arrière-cerveau à l’aide de l’imagerie à deux canaux pour imager les liposomes fluorescents bleus et les macrophages fluorescents verts. Lorsque toutes les images ont été obtenues, chargez les fichiers dans un logiciel d’analyse d’image 3D approprié.Sous l’onglet Mesure, faites glisser le protocole Trouver des objets dans les tâches de traînée ici pour faire des mesures d’espace. Sélectionnez le canal DAPI pour mettre en évidence les liposomes et faites glisser l’outil Inspect à travers les sections Z pour détecter les macrophages chargés de liposophage. Pour quantifier l’intensité de fluorescence des liposomes dans les cellules individuelles, faites glisser le clip vers les régions d’intérêt dans les tâches de traînée ici pour faire des mesures d’espace, et utilisez l’outil Rectangle pour dessiner une boîte autour de la cellule d’intérêt dans les dimensions X, Y et Z.Sélectionnez ensuite Effectuer l’élément de mesure dans le menu décrochage des mesures pour générer un fichier de mesure dans la fenêtre de la bibliothèque. Dans ce tableau, la taille, le potentiel de zeta, la charge de drogue, et l’efficacité de piégeage des liposomes produits sont résumés. Comme on l’a observé, la taille des particules des liposomes est similaire avec et sans chargement de drogue, bien que la charge de surface des liposomes chargés de drogue soit légèrement plus neutre que les liposomes témoins avec le bleu marin seulement.La microinjection de liposomes marins étiquetés bleus dans le ventricule de l’arrière-facteur, comme démontré, entraîne une absorption rapide par les macrophages résidents qui peuvent être facilement quantifiés par microscopie confoccale par trois heures après l’injection. Les neutrophiles, cependant, sont rarement observés pour contenir des liposomes intracellulaires. Dans les macrophages individuels chargés de liposomes, les liposomes s’accumulent dans les compartiments phagolysosomal, ce qui est nécessaire pour la dégradation liposome et la libération subséquente de contenu de drogue dans le cytoplasme.La livraison dans le venosus de sinus peut livrer les liposomes aux macrophages hematopoietic caudal de tissu-résident par l’intermédiaire de la circulation. La microinjection des liposomes chargés du médicament inhibiteur des espèces d’oxygène mitochondrial-réactif dans le ventricule hindbrain peut supprimer de manière significative la production d’espèces d’oxygène mitochondrial-réactive monosodique urate dans les macrophages postérieurs-résidents liposome-chargés. D’autres validations des effets suppressifs des drogues d’intérêt sur des états d’activation de macrophage peuvent être exécutées en étudiant l’expression proinflammatory de gène de cytokine par hybridation in situ entière de montage et le recrutement temporel des neutrophiles.En utilisant cette technique, nous avons été en mesure de cibler les médicaments à macrophages pour confirmer qu’un mécanisme immunométabolique conduit leur activation dans un modèle larvaire poisson zèbre de l’inflammation aiguë gouty. Les adaptations futures de ce protocole pourraient inclure l’exécution de la modification de surface du liposome pour augmenter le ciblage de macrophage ou pour favoriser le ciblage à d’autres cellules immunisées, telles que des neutrophiles.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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