Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien unterstützt, die c.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) und Z.W. (Faculty Research Development Fund von der University of Auckland) verliehen wurden. Die Autoren danken Alhad Mahagaonkar für das fachkundige Management der Zebrafischanlage, der Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland für die Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung und Graham Lieschke für die Begabung der Tg(mpeg1:EGFP) Reporterlinie.

1. Zubereitung von drogenbeladenen Marina Blue-labeled Liposomen
HINWEIS: Liposomen, die den blauen Fluoreszenzfarbstoff, Marina Blue und das Medikament tragen, werden mit einer Dünnschichthydratationsmethode mit Post-Insertion von Poloxamer 188 hergestellt. Alle Eingriffe werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Kontrollliposomen tragen nur Marina blue und PBS. Das Beispiel hier beschreibt das Laden von Liposomen mit einem Mitochondrien-targeting-Antioxidans-Medi...

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Hier haben wir ein detailliertes Protokoll zur Formulierung von medikamentenbelasteten Liposomen zur Verfügung gestellt, um gezielt Makrophagen in Larvenzebrafischen zu zielen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle von Makrophagen in bestimmten Krankheitsmodellen zu sezieren, indem eine direkte gezielte Abgabe von Medikamenten speziell auf Makrophagen sichergestellt wird. Darüber hinaus kann es verwendet werden, wenn die allgemeine Toxizität von Medikamenten ihre Verwendung begrenzt, wenn sie auf konventio...

Das mononukleare Phagozytensystem bietet eine erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger. Dieses System besteht aus Monozyten, monozytenabgeleiteten dendritischen Zellen und Makrophagen, die aktiv fremde Krankheitserreger phagozytieren und so die Ausbreitung von Krankheitserregern begrenzen. Zusätzlich zu diesen phagozytischen und mikrobiziden Effektorfunktionen sind dendritische Zellen und Makrophagen auch in der Lage, Zytokin zu production und Antigen-Präsentation, um das adaptive Immunsystem zu aktivieren1. Von diesen Zellen haben Makrophagen aufgrund ihrer vielfältigen funktionellen Heterogenität und Beteiligung an multiplen entzündlichen Erkrankungen, von Autoimmunität und Infektionskrankheiten bis hin zu Krebs2,3,4,5,6,7,besondere Aufmerksamkeit erhalten. Die Plastizität von Makrophagen und ihre Fähigkeit, sich funktionell an die Bedürfnisse ihrer Gewebeumgebung anzupassen, erfordern experimentelle Ansätze, um diese Zellen in vivo direkt zu beobachten und zu befragen.
Larval Zebrafische sind ein idealer Modellorganismus, um die Funktion und Plastizität von Makrophagen in vivo8zu untersuchen. Die optische Transparenz von Larvenzebrafischen bietet ein Fenster, um das Verhalten von Makrophagen direkt zu beobachten, insbesondere in Verbindung mit transgenen Reporterlinien, die makrophagen markieren. Die Nutzung des Live-Bildgebungspotenzials und der experimentellen Traktionsfähigkeit von Larvenzebrafischen hat zu vielen bedeutenden Erkenntnissen über die Makrophagenfunktion geführt, die direkte Relevanz für die menschliche Krankheit haben9,10,11,12,13,14,15. Viele dieser Studien haben auch die hohe Erhaltung der Drogenaktivität bei Zebrafischen genutzt (ein Attribut, das ihre Verwendung als ganzes Tier Arzneimittel Entdeckungplattform16,17,18) durch die Verwendung chemischer Interventionen, um pharmakologisch zu manipulieren Makrophagen Funktion. Bis heute wurden diese pharmakologischen Behandlungen meist entweder durch Eintauchen, das wasserlöslich es erfordert, oder durch direkte Mikroinjektion von freiem Medikament geliefert (Abbildung 1A). Zu den Einschränkungen dieser passiven Lieferstrategien gehören Off-Target-Effekte und allgemeine Toxizität, die eine Bewertung der Auswirkungen auf die Makrophagenfunktion ausschließen können. Darüber hinaus ist bei der Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf Makrophagen nicht bekannt, ob die Medikamente auf die Makrophagen selbst oder durch indirekteMechanismen wirken. Bei der Durchführung ähnlicher chemischer Interventionsstudien zur Untersuchung der Makrophagenfunktion erkannten wir, dass es eine unerfüllte Notwendigkeit gab, eine kostengünstige und unkomplizierte Verabreichungsmethode zu entwickeln, um Medikamente speziell auf Makrophagen auszurichten.
Liposomen sind mikroskopische, biokompatible, lipidbilayerierte Vesikel, die Proteine, Nukleotide und Drogenfracht verkapseln können19. Die unilamellare oder multilamellare Lipid-Doppelschichtstruktur von Liposomen bildet ein wässriges inneres Lumen, in dem wasserlösliche Medikamente eingearbeitet werden können, während hydrophobe Medikamente in die Lipidmembranen integriert werden können. Darüber hinaus können die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Liposomen, einschließlich Größe, Ladung und Oberflächenmodifikationen, manipuliert werden, um ihre Ausrichtung auf bestimmte Zellen20,21zuzuschneiden. Diese Eigenschaften von Liposomen haben sie zu einem attraktiven Vehikel gemacht, um Medikamente zu liefern und die Präzision der aktuellen Behandlungsschemata zu verbessern20. Da Liposomen natürlich durch Makrophagen phagozytoisiert werden (ein Merkmal, das durch ihre routinemäßige Verwendung bei der Bereitstellung von Clodronat speziell für Makrophagen für Ablationsexperimente genutzt wird22), stellen sie als attraktive Option für die makrophagenspezifische Arzneimittelabgabe dar (Abbildung 1B).
Dieses Protokoll beschreibt die Formulierung von Medikamenten in blaue fluoreszierende Liposomen, die mit dem hydrophilen Polymer Poloxamer 188 beschichtet sind, das eine Schutzschicht auf der Liposomenoberfläche bildet und nachweislich die Arzneimittelretention verbessert und eine überlegene Biokompatibilitäthat 23. Poloxamer wurde für die Oberflächenbeschichtung von Liposomen ausgewählt, da unsere bisherigen Forschungen gezeigt hatten, dass Poloxamer modifizierte Liposomen im Vergleich zu Polyethylenglykolmodifizierten Liposomen eine bessere Biokompatibilität nach subkutaner Injektion von Rattenpfoten und ähnlicher Pharmakokinetik bei Kaninchen nach intravenöser Infusionzeigten 23. Protokolle werden auch für ihre Mikroinjektion in Larvenzebrafische und Live-Bildgebung beschrieben, um ihre Makrophagen-Targeting-Fähigkeit und Lokalisierung in intrazelluläre Kompartimente zu bewerten, die für den Liposomenabbau und die zytoplasmatische Arzneimittelabgabe notwendig sind. Als Proof-of-Concept haben wir diese Technik bereits verwendet, um zwei Medikamente auf Makrophagen zu zielen, um ihre Aktivierung in einem Larven-Zebrafischmodell der akuten Gichtentzündung zu unterdrücken24. Diese Medikamentenabgabetechnik erweitert das chemische "Toolkit", das Zebrafischforschern zur Verfügung steht, die eine Makrophagen-Targeting ihrer Medikamente von Interesse sicherstellen wollen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Zebrafische (Danio rerio) Larven haben sich zu einem beliebten Modell entwickelt, um Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen und den Beitrag angeborener Immunzellen zu entzündlichen Erkrankungen aufgrund ihres funktionell konservierten angeborenen Immunsystems zu untersuchen. Sie sind auch weit verbreitet, um zu untersuchen, wie angeborene Immunzellen helfen, Entwicklungsprozesse zu leiten. Durch die Nutzung der optischen Transparenz und genetischen Traktionsfähigkeit von Larvenzebrafischen konzentrieren sich diese Studien häufig auf live-bildgebende Ansätze zur funktionellen Charakterisierung fluoreszierend markierter Makrophagen und Neutrophilen innerhalb intakter Tiere. Aufgrund ihrer vielfältigen funktionellen Heterogenität und der ständig wachsenden Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten haben Makrophagen erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. Neben genetischen Manipulationen werden chemische Eingriffe nun routinemäßig eingesetzt, um das Makrophagenverhalten bei Larvenzebrafischen zu manipulieren und zu untersuchen. Die Lieferung dieser Medikamente ist in der Regel auf passive Simtung von kostenlosen Medikamenten durch direktes Eintauchen oder Mikroinjektion beschränkt. Diese Ansätze beruhen auf der Annahme, dass jede Änderung des Makrophagenverhaltens das Ergebnis einer direkten Wirkung des Arzneimittels auf die Makrophagen selbst ist und keine nachgelagerte Folge einer direkten Auswirkung auf einen anderen Zelltyp. Hier stellen wir unsere Protokolle zur Gezielten Ausrichtung auf Larvenzebrafische Makrophagen durch Mikroinjizieren von medikamentösen fluoreszierenden Liposomen vor. Wir zeigen, dass Poloxamer 188-modifizierte medikamentöse blaue fluoreszierende Liposomen leicht von Makrophagen und nicht von Neutrophilen aufgenommen werden. Wir liefern auch Beweise dafür, dass Auf diese Weise gelieferte Medikamente die Makrophagenaktivität in einer Weise beeinflussen können, die mit dem Wirkmechanismus des Medikaments im Einklang steht. Diese Technik wird für Forscher von Nutzen sein, die sicherstellen wollen, dass Medikamente auf Makrophagen ausgerichtet werden und wenn Medikamente zu toxisch sind, um mit traditionellen Methoden wie Demonsion geliefert zu werden.

Der hier beschriebene Ansatz zur Dünnschichthydratation zur Herstellung fluoreszierender Liposomen, die Arzneimittel einschließen, ist eine einfache und kostengünstige Methode. Mit dem in dieser Studie verwendeten Protokoll werden die Liposomen voraussichtlich unilamellar23,24sein. Die Größe, das Zeta-Potenzial, die Lade- und Einschließungseffizienz der hergestellten Liposomen sind in Tabelle 1zusammengefasst. Die Partikelgröße der Liposo...

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Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Hier beschreiben wir die Synthese von medikamentenbelasteten Liposomen und deren Mikroinjektion in Larvenzebrafische zum Zweck der gezielten Medikamentenabgabe an Makrophagen-Linienzellen.

Targeting Drogen zu Larval Zebrafish Makrophagen durch Injektion von Drogen-geladenen Liposomen

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Gezielten Ausrichtung von Arzneimitteln auf Larvenzebrafische Makrophagen, um die Makrophagenfunktion zu manipulieren und auszuwerten. Diese Technik hat Vorteile gegenüber traditionellen Arzneimittelabgabestrategien wie Immersion, indem sichergestellt wird, dass die Medikamente durch Liposomenverkapselung gezielt auf Makrophagen ausgerichtet sind. Wenn diese Technik auf Zebrafischmodelle von Krankheiten mit einer entzündlichen Komponente angewendet wird, hat sie das Potenzial zu klären, wie Makrophagen zu pathologischen Prozessen beitragen.Hier demonstrieren wir den Nutzen dieser Technik, indem wir ein mitochondrial-reaktives Sauerstoffspezies-hemmendes Medikament auf Makrophagen zielen, um die Aktivierung zu unterdrücken. Die Mikroinjektion von medikamentösem Liposomen in Larven kann eine Herausforderung sein, da darauf geachtet werden sollte, keine übermäßigen Epithelschäden zu verursachen, die möglicherweise immunologische Studien beeinflussen. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist wichtig, da es pharmakologische und ganze Tier-Livezellmethoden umfasst, die nicht routinemäßig in einem einzigen Labor durchgeführt werden können.Um 10 Milligramm Liposomen in einem 25-Milliliter-Rundkolben zuzubereiten, fügen Sie dem Kolben 31 Nanomolaren Meerblau und 300 Nanomolaren eines mitochondrial-reaktiven Sauerstoffspezies-hemmenden Medikaments hinzu. Beschallen Sie kurz, um sich vollständig aufzulösen, und entfernen Sie das Lösungsmittel langsam auf einem Rotationsverdampfer, der über einem 45-Grad-Celsius-Wasserbad bei 75 Umdrehungen pro Minute unter Vakuumdruck gesetzt ist. Wenn sich in den Glaswänden des Kolbens ein trockener Lipid-Dünnfilm gebildet hat, trocknen Sie den Film 45 Minuten unter Stickstoff weiter, um die vollständige Entfernung des organischen Lösungsmittels zu erleichtern.Als nächstes hydratisieren Sie den Film mit einem Milliliter PBS und versiegeln Sie den Kolben mit Paraffinfolie, bevor Sie den Kolben 20 Minuten lang mit der Hand in ein 60-Grad-Wasserbad mit 60 Grad Celsius aufbereiten. Nach sieben Zyklen des Einfrierens und Auftauens verwenden Sie einen Miniextruder und ein Mikrometer track-geätzte Polycarbonat-Membranen, um die Liposomen für zwei bis sechs Zyklen zu extrudieren. Wenn große unilamellare Vesikel erhalten wurden, kondensieren Sie die frischen Liposomen durch Ultrazentrifugation zu einem Pellet.Inkubieren Sie das Pellet mit einem Milliliter 1%Poloxamer 188 Lösung für 30 Minuten bei 45 Grad Celsius und 750 Umdrehungen pro Minute in einem ThermoMixer mit einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohraufsatz. Während der Post-Einfügung von Poloxamer 188 in die Liposomen sind die richtige Poloxamerkonzentration, Inkubationszeit und Temperatur wichtig, um die optimalen physikalisch-chemischen Eigenschaften der resultierenden Liposomen zu erreichen. Am Ende der Inkubation, ultrazentrifugieren Sie das Gemisch wieder unter den gleichen Zentrifugenbedingungen, und entfernen Sie den Überstand enthalten alle ungebundenen Polymer oder Medikament.Dann lagern Sie die Liposomenpellets bei vier Grad Celsius, vor Licht geschützt. Um die Größe und das Zeta-Potenzial der Liposomen zu bestimmen, verdünnen Sie die Liposomenformulierung mit reinem Reinstwasser im Verhältnis eins zu 100. Verwenden Sie einen dynamischen Lichtstreuungsanalysator, um die Partikelgröße, den Polydispersitätsindex und das Zeta-Potenzial in Dreifacharbeit bei 25 Grad Celsius zu messen.Um die Einschlusseffizienz und die Medikamentenbelastung der Liposomen zu berechnen, lösen Sie die Liposomen in Triton X-100 auf. Injizieren Sie 20 Mikroliter der gelösten Liposomenprobe in ein Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem mit einer Quaternärpumpe, einem Dioden-Array-Detektor auf 230 Nanometer und einer Drei-Mikrometer-, 250-mal-4,6-Millimeter-Säule. Um transgene Zebrafischlarven für die Injektion vorzubereiten, verwenden Sie Feinspitzenzangen, um 30 Stunden nach der Befruchtung Embryonen manuell zu dechorisieren und die Embryonen bis zwei Tage nach der Befruchtung bei 28,5 Grad Celsius entwickeln zu lassen.Wenn die Embryonen das entsprechende Stadium erreicht haben, verdünnen Sie eine frisch zubereitete Liposomenformulierung im Eins-zu-Eins-Verhältnis in sterilem PBS und mischen Sie die Lösung zwei bis drei Sekunden durch Wirbeln. Gießen Sie genügend 3%Methylcellulose in E3-Medium in den Deckel eines kleinen 35-Millimeter-Kulturschalendeckels, um einen dünnen Film zu bilden, der die gesamte Oberfläche bedeckt. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um einen Pool von etwa 20 bis 25 anästhesierten Larven zu sammeln.Lassen Sie die Embryonen an der Spitze der Pipette durch Schwerkraft konzentrieren, und übertragen Sie die Larven vorsichtig in die Mitte des 35-Millimeter-Kulturschalendeckels mit minimaler Lösung. Verwenden Sie einen Mikrokapillarlader, um die Larven mit ihren Vorderteilen zur Oberseite der Injektionsplatte zu ordnen, wobei die dorsale Oberfläche zur Injektion in den Hinterhirnventrikel oder mit ihren Vorderteilen links von der Injektionsplatte mit den ventralen Oberflächen zur Mikroinjektionsnadel zur Injektion in den Sinusvenosus gerichtet ist. Verwenden Sie einen Mikrokapillarlader, um eine Injektionsnadel mit etwa fünf Mikrolitern der Liposomen-Injektionsmischung zu füllen.Montieren Sie die Nadel in einen Mikromanipulator, der mit einem magnetischen Ständer und einem Druckinjektor verbunden ist, und positionieren Sie das Setup unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie saubere, feine Zangen, um die Spitze der Mikroinjektionsnadel zu schneiden, um eine Öffnung von etwa fünf Mikrometern Durchmesser zu erzeugen. Stellen Sie den Injektor auf eine Pulsdauer von ca. 50 Millisekunden und einen Injektionsdruck von etwa 40 Pfund pro Quadratzoll ein.Injizieren Sie einen Bolus in einen Tropfen Mineralöl, der über den Gitterlinien eines Hämozytometers positioniert ist, um das zu injizierende Volumen zu kalibrieren. Passen Sie dann die Pulsdauer und/oder den Einspritzdruck an, bis der Durchmesser des Bolus 2 1/2 der kleinsten Rasterlinien abdeckt. Einen Nanoliter der Liposomen-Injektionsmischung vorsichtig in die Hinterhirn-Herzkammer jeder Larve injizieren.Unmittelbar nach den Injektionen E3 medium auf die Injektionsplatte geben und eine Kunststoff-Transferpipette verwenden, um die Larven aus der Methylcellulose sanft zu rühren. Um die dorsale Oberfläche des Hinterhirns auf einem konfokalen Mikroskop mit einer Wassertauchlinse abzubilden, füllen Sie zunächst eine 35-Millimeter-Kulturschale bis zu einer Tiefe von fünf Millimetern mit Montagemedium und lassen das Medium polymerisieren. Graben sie, einen kleinen Graben in der Agarose von ausreichender Fläche, um den Dottersack des experimentellen Embryos unterzubringen, und verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit geschmolzenem Montagemedium gefüllt, um eine anästhesierte Larve zu sammeln.Legen Sie die Larve sofort in die Kulturschale ab und orientieren Sie die Dottersac-Ventralseite mit einem Mikrokapillarlader in die ausgehobenen Löcher. Halten Sie den Embryo in dieser Position, bis die Agarose polymerisiert. Überlagern Sie den Embryo mit E3-Medium, ergänzt um 200 Mikrogramm pro Milliliter Tricain.Um die Hinterhirnkammer live abzubilden, wählen Sie das 20-fache Objektiv aus, und stellen Sie das konfokale Mikroskop auf 512 x 512 Pixel und einen 2,5-fachen Zoom ein. Wenn die Mikroskopparameter festgelegt sind, erfassen Sie 40 mal drei Mikrometer Z-Stacks, die sich von der dorsal-meisten Oberfläche des Hinterhirns aus mit Hilfe von Zweikanal-Bildgebung erstrecken, um die blauen fluoreszierenden Liposomen und grünen fluoreszierenden Makrophagen abzubilden. Wenn alle Bilder erhalten sind, laden Sie die Dateien in ein entsprechendes 3D-Bildanalyse-Softwareprogramm.Ziehen Sie unter der Registerkarte Messen das Protokoll Objekte suchen in die Drag Tasks hier, um Werte zu erstellen. Wählen Sie den DAPI-Kanal aus, um die Liposomen hervorzuheben, und ziehen Sie das Werkzeug Inspect durch die Z-Abschnitte, um die liposomengeladenen Makrophagen zu erkennen. Um die Fluoreszenzintensität von Liposomen innerhalb der einzelnen Zellen zu quantifizieren, ziehen Sie das Protokoll Clip to Regions Of Interest in das Drag Tasks Here To Make Measurements Space, und verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um ein Feld um die Zelle zu zeichnen, die für die X-, Y- und Z-Bemaßung von Interesse ist.Wählen Sie dann im Dropdownmenü Messungen die Option Messelement erstellen aus, um eine Messdatei im Bibliotheksfenster zu generieren. In dieser Tabelle werden die Größe, das Zetapotenzial, die Belastung und die Einschlusseffizienz der produzierten Liposomen zusammengefasst. Wie beobachtet, ist die Partikelgröße der Liposomen mit und ohne Medikamentenbelastung ähnlich, obwohl die Oberflächenladung von medikamentösen Liposomen etwas neutraler ist als die Kontrollliposomen nur mit Marineblau.Die Mikroinjektion von marinen blau markierten Liposomen in die Hinterhirnkammer führt, wie gezeigt, zu einer schnellen Aufnahme durch gebietsansässige Makrophagen, die durch konfokale Mikroskopie durch drei Stunden nach der Injektion leicht quantifiziert werden können. Neutrophile werden jedoch selten beobachtet, um intrazelluläre Liposomen zu enthalten. Innerhalb einzelner liposomenhaltiger Makrophagen akkumulieren sich die Liposomen in den phagolysosomalen Kompartimenten, was für den Liposomenabbau und die anschließende Freisetzung des Wirkstoffgehalts in das Zytoplasma notwendig ist.Die Abgabe in den Sinus venosus kann die Liposomen über die Zirkulation an kaudalhäche hämatopoetische Gewebe-Resident-Makrophagen liefern. Die Mikroinjektion von Liposomen, die mit dem mitochondrial-reaktiven Sauerstoffspezies-hemmenden Medikament in die Hinterhirn-Herzkammer geladen sind, kann die Produktion von Mononatrium-Urate-Kristall-getriebenen mitochondrial-reaktiven Sauerstoffspezies in liposome-beladenen Hinterhirn-Resident-Makrophagen signifikant unterdrücken. Eine weitere Validierung der unterdrückenden Wirkungen von Arzneimitteln von Interesse auf Makrophagenaktivierungszustände kann durch Die Untersuchung der proinflammatorischen Zytokin-Genexpression durch gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung und die zeitliche Rekrutierung von Neutrophilen durchgeführt werden.Mit dieser Technik konnten wir Medikamente auf Makrophagen zielen, um zu bestätigen, dass ein immunmetabolischer Mechanismus ihre Aktivierung in einem Larven-Zebrafischmodell einer akuten Gichtentzündung antreibt. Zukünftige Anpassungen dieses Protokolls könnten die Durchführung einer Oberflächenmodifikation des Liposoms umfassen, um das Makrophagen-Targeting zu verbessern oder das Targeting auf andere Immunzellen wie Neutrophile zu fördern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

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Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...