Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni assegnate a C.J.H. (Health research Council of New sealand and Marsden Fund, Royal Society of New zeealand) e .W. (Faculty Research Development Fund dell'Università di Auckland). Gli autori ringraziano Alhad Mahagaonkar per la gestione esperta della struttura di pesce zebra, la Biomedical Imaging Research Unit, la School of Medical Sciences, l'Università di Auckland per l'assistenza con l'imaging confocale e Graham Lieschke per aver donato la linea di giornalisti Tg(mpeg1:EGFP).

1. Preparazione di Liposomes Marina con carico di droga
NOTA: I liposomi che portano il colorante fluorescente blu, Marina Blue e la droga vengono preparati utilizzando un metodo di idratazione del film sottile con post-inserimento del poloxamer 188. Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specificato. I liposomi di controllo portano solo Marina blu e PBS. L'esempio qui descrive il caricamento di liposomi con un farmaco antiossidante25</su...

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Qui, abbiamo fornito un protocollo dettagliato per formulare liposomi caricati da farmaci per indirizzare specificamente i macrofagi nel pesce zebra larvale. Questo metodo può essere utilizzato per sezionare il ruolo dei macrofagi in alcuni modelli di malattia garantendo la somministrazione diretta mirata di farmaci specificamente ai macrofagi. Inoltre, può essere utilizzato quando la tossicità generale dei farmaci limita il loro uso quando viene consegnato da percorsi più convenzionali, come l'immersione. Il protoco...

Il sistema di fagociti mononucleari fornisce una prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori. Questo sistema è costituito da monociti, cellule dendritiche derivate da monciti e macrofagi, che attivamente fagocitozelare patogeni estranei, limitando così la diffusione di patogeni. Oltre a queste funzioni fagocitiche e microbicide, le cellule dendritiche e i macrofagi sono anche in grado di produzione di citochine e di presentazione dell'antigene per attivare il sistema immunitario adattivo1. Di queste cellule, i macrofagi hanno ricevuto particolare attenzione a causa della loro eterogeneità funzionale diversificata e del coinvolgimento in molteplici malattie infiammatorie, dall'autoimmunità e malattie infettive al cancro2,3,4,5,6,7. La plasticità dei macrofagi e la loro capacità di adattarsi funzionalmente alle esigenze del loro ambiente tissutale richiedono approcci sperimentali per osservare e interrogare direttamente queste cellule in vivo.
Il pesce zebra larvale è un organismo modello ideale con cui studiare la funzione e la plasticità dei macrofagi in vivo8. La trasparenza ottica del pesce zebra larvale fornisce una finestra per osservare direttamente il comportamento dei macrofagi, soprattutto se accoppiati con linee di reporter transgenici marcati macrofagi. Sfruttare il potenziale di imaging dal vivo e la trattatibilità sperimentale del pesce zebra larvale ha portato a molte intuizioni significative sulla funzione del macrofago che hanno una rilevanza diretta per la malattia umana9,10,11,12,13,14,15. Molti di questi studi hanno anche approfittato dell'alta conservazione dell'attività farmacologica nel pesce zebra (un attributo che sostiene il loro uso come piattaforma di scoperta di farmaci animali16,17,18), utilizzando interventi chimici per manipolare farmacologicamente la funzione macrofago. Ad oggi, questi trattamenti farmacologici sono stati per lo più erogati sia attraverso l'immersione, che richiede che il farmaco sia solubile in acqua, o per microiniezione diretta di droga libera (Figura 1A). Le limitazioni di queste strategie di consegna passiva includono effetti off-target e tossicità generale che possono impedire di valutare qualsiasi impatto sulla funzione del macrofago. Inoltre, quando si studiano gli effetti sui farmaci sui macrofagi non è noto se i farmaci agiscono sui macrofagi stessi o attraverso meccanismi più indiretti. Quando si eseguono studi di intervento chimico simili per studiare la funzione del macrofago, abbiamo riconosciuto che c'era una necessità insoddisfatta di sviluppare un metodo di somministrazione economico e diretto per indirizzare i farmaci specificamente ai macrofagi.
I liposomi sono vesciche microscopiche, biocompatibili, lipidi che possono incapsulare proteine, nucleotidi e merci di droga19. La struttura di unilamellar o bistrato lipidico multilamellar dei liposomi forma un lumen interno acquoso dove i farmaci solubili in acqua possono essere incorporati mentre i farmaci idrofobici possono essere integrati nelle membrane lipidiche. Inoltre, le proprietà fisico dei liposomi, comprese le modifiche di dimensioni, cariche e superfici, possono essere manipolate per adattare il loro targeting a celle specifiche20,21. Queste caratteristiche dei liposomi li hanno resi un veicolo attraente per fornire farmaci e migliorare la precisione degli attuali regimi di trattamento20. Poiché i liposomi sono naturalmente fagocitoscitosamente dai macrofagi (una caratteristica sfruttata dal loro uso di routine nel fornire clodrinonato specificamente ai macrofagi per esperimenti di ablazione22), presentano come un'opzione attraente per la somministrazione di farmaci specifici per i macrofagi (Figura 1B).
Questo protocollo descrive la formulazione di farmaci in liposomi fluorescenti blu rivestiti con il poloxamer polimerico idrofilo 188, che forma uno strato protettivo sulla superficie liposomica e ha dimostrato di migliorare la ritenzione dei farmaci e avere una biocompatibilità superiore23. Poloxamer è stato scelto per il rivestimento superficiale dei liposomi come la nostra ricerca precedente aveva dimostrato che, rispetto ai liposomi modificati in polietilene glicole, i liposomi modificati poloxamer hanno mostrato una migliore biocompatibilità dopo l'iniezione sottocutanea di zampe di ratto e simili farmacocinetici nei conigli che hanno seguito l'infusione endovenosa23. I protocolli sono descritti anche per la loro microiniezione nel pesce zebra larvale e nell'imaging vivo per valutare la loro capacità di targeting dei macrofagi e la localizzazione in compartimenti intracellulari necessari per la degradazione liposomica e la somministrazione di farmaci citoplasmici. Come prova di concetto abbiamo usato questa tecnica per indirizzare due farmaci ai macrofagi per sopprimere la loro attivazione in un modello di pesce zebra larvale di infiammazione gotta acuta24. Questa tecnica di somministrazione di farmaci espande il "toolkit" chimico disponibile per i ricercatori di pesci zebra che vogliono garantire il targeting dei macrofagi dei loro farmaci di interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Le larve di pesce zebra (Danio rerio) si sono sviluppate in un modello popolare per studiare le interazioni ospite-patogeno e il contributo delle cellule immunitarie innate alle malattie infiammatorie a causa del loro sistema immunitario innato contenuto funzionalmente conservato. Essi sono anche ampiamente utilizzati per esaminare come le cellule immunitarie innate aiutano a guidare i processi di sviluppo. Sfruttando la trasparenza ottica e la trattabilità genetica del pesce zebra larvale, questi studi spesso si concentrano su approcci di imaging dal vivo per caratterizzare funzionalmente macrofagi e neutrofili marcati fluorescenti all'interno di animali intatti. A causa della loro eterogeneità funzionale diversificata e dei ruoli in continua espansione nella patogenesi della malattia, i macrofagi hanno ricevuto un'attenzione significativa. Oltre alle manipolazioni genetiche, gli interventi chimici sono ora regolarmente utilizzati per manipolare ed esaminare il comportamento dei macrofafi nel pesce zebra larvale. La consegna di questi farmaci è in genere limitata al targeting passivo di droga libera attraverso l'immersione diretta o microiniezione. Questi approcci si basano sul presupposto che qualsiasi modifica al comportamento dei macrofagi sia il risultato di un effetto diretto del farmaco sui macrofagi stessi, e non una conseguenza a valle di un effetto diretto su un altro tipo di cellula. Qui, presentiamo i nostri protocolli per indirizzare i farmaci specificamente ai macrofagi di pesci zebra larve mediante microiniezione di liposomi fluorescenti caricati da farmaci. Vi riveliamo che i liposomi fluorescenti blu carichi di pallacaneggio 188 modificati sono prontamente assorbiti dai macrofagi e non dai neutrofili. Forniamo anche la prova che i farmaci consegnati in questo modo possono avere un impatto sull'attività dei macrofazini in modo coerente con il meccanismo d'azione del farmaco. Questa tecnica sarà di valore per i ricercatori che vogliono garantire il targeting dei farmaci ai macrofagi e quando i farmaci sono troppo tossici per essere consegnati con metodi tradizionali come l'immersione.

L'approccio di idratazione delle pellicole sottili descritto qui per la preparazione di liposomi fluorescenti che racchiudono farmaci è un metodo semplice ed economico. Con il protocollo utilizzato in questo studio, i liposomi dovrebbero essere unilamellar23,24. Le dimensioni, il potenziale di zeta, il carico di droga e l'efficienza di intrappolamento dei liposomi prodotti sono riassunti nella Tabella 1. Le dimensioni delle particelle dei liposo...

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Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Qui, descriviamo la sintesi dei liposomi caricati dai farmaci e la loro microiniezione nel pesce zebra larvale allo scopo di indirizzare la somministrazione di farmaci alle cellule di macrofago-lignaggio.

Mirare i farmaci ai macrofagi di pesce zebra larvale iniettando liposomi caricati con droga

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Questo protocollo descrive una tecnica per indirizzare i farmaci di interesse per i macrofagi larvali di zebrafish per manipolare e valutare la funzione macrofagi. Questa tecnica ha vantaggi rispetto alle strategie tradizionali di somministrazione di farmaci come l'immersione garantendo che i farmaci siano specificamente mirati ai macrofagi attraverso l'incapsulamento liposoma. Se applicata ai modelli zebrafish di malattia con una componente infiammatoria, questa tecnica ha il potenziale per risolvere il modo in cui i macrofagi contribuiscono ai processi patologici.Qui, dimostriamo l'utilità di questa tecnica prendendo di mira un farmaco inibitore delle specie di ossigeno mitocondriale-reattivo ai macrofagi per sopprimere l'attivazione. La microiniezione di liposomi caricati di farmaci nelle larve può essere impegnativa, poiché si dovrebbe fare attenzione a non causare eccessivi danni epiteliali, influenzando potenzialmente gli studi immunologici. La dimostrazione visiva di questo protocollo è importante perché coinvolge metodologie farmacologiche e intere di cellule vive animali che potrebbero non essere eseguite regolarmente in un singolo laboratorio.Per preparare 10 milligrammi di liposomi in un pallone a fondo rotondo da 25 millilitri, aggiungere 31 nanomolari di blu marino e 300 nanomolari di un farmaco inibitore delle specie di ossigeno mitocondriale-reattivo al pallone. Sonicare brevemente per dissolversi completamente e rimuovere lentamente il solvente su un evaporatore rotante impostato su un bagno d'acqua Celsius di 45 gradi a 75 rotazioni al minuto sotto pressione del vuoto. Quando un film sottile lipidico secco si è formato all'interno delle pareti di vetro del pallone, asciugare ulteriormente il film per 45 minuti sotto azoto per facilitare la completa rimozione del solvente organico.Successivamente, idratare il film con un millilitro di PBS e sigillare il pallone con pellicola di paraffina prima di agitare il pallone a mano su un bagno d'acqua Celsius di 60 gradi per 20 minuti. Dopo sette cicli di congelamento e scongelamento, utilizzare un mini-estrusore e membrane in policarbonato tracciato da un micrometro per estrudere i liposomi per due o sei cicli. Quando sono state ottenute grandi vescicole unilamellari, condensare i liposomi freschi in un pellet mediante ultracentrifugazione.Incubare il pellet con un millilitro di soluzione 1%poloxamer 188 per 30 minuti a 45 gradi Celsius e 750 rotazioni al minuto in un ThermoMixer con attacco tubo microcentrifugo a due millilitri. Durante il post inserimento del poloxamero 188 nei liposomi, la corretta concentrazione di poloxamero, il tempo di incubazione e la temperatura sono importanti per raggiungere le caratteristiche fisicochimiche ottimali dei liposomi risultanti. Alla fine dell'incubazione, ultracentrifugare nuovamente la miscela nelle stesse condizioni di centrifuga e rimuovere il supernatante contenente qualsiasi polimero o farmaco non legato.Quindi conservare i pellet liposomi a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce. Per determinare le dimensioni e il potenziale zeta dei liposomi, diluire la formulazione liposoma con acqua ultrapura con un rapporto uno a 100. Utilizzare un analizzatore dinamico di diffusione della luce per misurare la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersità e il potenziale zeta in triplice copia a 25 gradi Celsius.Per calcolare l'efficienza dell'intrappolamento e il caricamento del farmaco dei liposomi, sciogliere i liposomi in Triton X-100. Iniettare 20 microlitri del campione di liposoma disciolto in un sistema di cromatografia liquida ad alta pressione con una pompa quaternaria, un rivelatore array di diodi impostato a 230 nanometri e una colonna di tre micrometri, 250 volte 4,6 millimetri. Per preparare le larve transgeniche di zebrafish per l'iniezione, utilizzare forcep a punta fine per dechorionare manualmente 30 ore dopo la fecondazione e consentire agli embrioni di svilupparsi a 28,5 gradi Celsius fino a due giorni dopo la fecondazione.Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio appropriato, diluire una formulazione liposoma preparata al momento a un rapporto uno a uno in PBS sterile e mescolare la soluzione per due o tre secondi con vortici. Versare abbastanza 3%cellulosa metile nel mezzo E3 nel coperchio di un piccolo coperchio piatto di coltura di 35 millimetri per formare un film sottile che copre l'intera superficie. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per raccogliere una piscina di circa 20-25 larve anestetizzate.Lasciare che gli embrioni si concentrino sulla punta della pipetta per gravità e trasferire attentamente le larve al centro del coperchio del piatto di coltura di 35 millimetri con una soluzione minima. Utilizzare un caricatore microcapillare per disporre le larve con i loro anteri verso la parte superiore della piastra di iniezione con la superficie dorsale rivolta verso l'ago di microiniezione per l'iniezione nel ventricolo del cervello posteriore o con i loro anteri verso sinistra della piastra di iniezione con le superfici ventrali rivolte verso l'ago di microiniezione per iniezione nel seno velenoso. Utilizzare un caricatore microcapillare per riempire di nuovo un ago di iniezione con circa cinque microlitri della miscela di iniezione liposoma.Montare l'ago in un micromanipolatore collegato a un supporto magnetico e a un iniettore di pressione e posizionare la configurazione al microscopio stereo. Utilizzare pini puliti e a punta fine per tagliare la punta dell'ago di microiniezione per generare un'apertura di circa cinque micrometri di diametro. Impostare l'iniettore su una durata dell'impulso di circa 50 millisecondi e una pressione di iniezione di circa 40 libbre per pollice quadrato.Iniettare un bolo in una goccia di olio minerale posizionata sulle linee della griglia di un emocitometro per calibrare il volume da iniettare. Quindi regolare la durata dell'impulso e/o la pressione di iniezione fino a quando il diametro del bolo copre 2 1/2 delle linee della griglia più piccole. Iniettare con cura un nanolitro della miscela di iniezione liposoma nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore di ogni larva.Immediatamente dopo le iniezioni, aggiungere il mezzo E3 alla piastra di iniezione e utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per agitare delicatamente le larve dalla cellulosa metile. Per visualizzare la superficie dorsale del cervello posteriore su un microscopio confocale dotato di una lente ad immersione in acqua, riempire prima un piatto di coltura di 35 millimetri a una profondità di cinque millimetri con mezzo di montaggio e lasciare che il mezzo polimerizzi. Scavare una piccola trincea nell'agarosio di area sufficiente per ospitare il sacco vitellino dell'embrione sperimentale e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica riempita con mezzo di montaggio fuso per raccogliere una larva anestetizzata.Depositare immediatamente la larva nel piatto di coltura e utilizzare un caricatore microcapillare per orientare il lato ventrale del sacco tuorlo verso il basso nei fori scavati. Mantenere l'embrione in questa posizione fino a quando l'agarosio polimerizza. Sovrapporre l'embrione con mezzo E3 integrato con 200 microgrammi per millilitro di tricaina.Per vivere l'immagine del ventricolo del ventricolo del cervello posteriore, selezionare l'obiettivo 20x e impostare il microscopio confocale su 512 per 512 pixel e uno zoom 2,5x. Quando i parametri del microscopio sono stati impostati, acquisire z-stack da 40 x tre micrometri che si estendono dalla superficie più dorsale del cervello posteriore usando l'imaging a due canali per immaginare i liposomi fluorescenti blu e i macrofagi fluorescenti verdi. Una volta ottenute tutte le immagini, caricare i file in un programma software di analisi delle immagini 3D appropriato.Nella scheda Misurazione trascinare il protocollo Trova oggetti nello spazio Trascina attività qui per effettuare misurazioni. Selezionate il canale DAPI per evidenziare i liposomi e trascinate lo strumento Ispeziona attraverso le sezioni Z per rilevare i macrofagi carichi di liposomi. Per quantificare l'intensità di fluorescenza dei liposomi all'interno delle singole celle, trascinate il protocollo Clip in Regioni di interesse nello spazio Trascina attività qui per effettuare misurazioni e usate lo strumento Rettangolo per disegnare una casella intorno alla cella di interesse nelle quote X, Y e Z.Quindi selezionate Crea elemento di misura (Make Measurement Item) dal menu a discesa Misure (Measurements) per generare un file di misurazione nella finestra della libreria. In questa tabella, vengono riepilogate le dimensioni, il potenziale zeta, il carico di farmaci e l'efficienza di intrappolamento dei liposomi prodotti. Come osservato, la dimensione delle particelle dei liposomi è simile e senza carico di farmaci, anche se la carica superficiale dei liposomi caricati da farmaci è leggermente più neutra dei liposomi di controllo solo con blu marino.La microiniezione di liposomi marini etichettati blu nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore, come dimostrato, si traduce in un rapido assorbimento da parte dei macrofagi residenti che può essere facilmente quantificato con microscopia confocale di tre ore dopo l'iniezione. I neutrofili, tuttavia, sono raramente osservati contenere liposomi intracellulari. All'interno dei singoli macrofagi carichi di liposomi, i liposomi si accumulano all'interno dei compartimenti fagolysosomiali, che è necessario per la degradazione liposoma e il successivo rilascio di contenuto di farmaci nel citoplasma.La consegna nel seno velenoso può consegnare i liposomi ai macrofagi caudali ematopoietici residenti nel tessuto attraverso la circolazione. La microiniezione di liposomi caricati con il farmaco inibitore dell'ossigeno mitocondriale-reattivo nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore può sopprimere significativamente la produzione di specie di ossigeno mitocondriale-reattivo a urato monosodico all'interno di macrofagi residenti in racchieri posteriori carichi di liposomi. Un'ulteriore convalida degli effetti soppressivi dei farmaci di interesse sugli stati di attivazione dei macrofagi può essere eseguita studiando l'espressione genica citochina proinflammatoria mediante ibridazione in situ a montaggio intero e il reclutamento temporale di neutrofili.Usando questa tecnica, siamo stati in grado di indirizzare i farmaci ai macrofagi per confermare che un meccanismo immunometabolico guida la loro attivazione in un modello larvale di zebrafish di infiammazione gottosa acuta. I futuri adattamenti di questo protocollo potrebbero includere l'esecuzione di modifiche superficiali del liposoma per migliorare il targeting da macrofagi o per promuovere il targeting ad altre cellule immunitarie, come i neutrofili.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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