Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

이 작품은 C.J.H. (뉴질랜드와 마스덴 기금의 건강 연구 위원회, 뉴질랜드 왕립 학회) 및 Z.W. (오클랜드 대학에서 교수 연구 개발 기금)에 수여 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 제브라피시 시설의 전문가 관리를 위한 Alhad Mahagaonkar, 생물 의학 화상 진찰 연구 단위, 의학 과학의 학교, 공초점 화상 진찰을 가진 원조를 위한 오클랜드 대학 및 Tg (mpeg1:EGFP) 기자 라인을 선물을 위한 그레이엄 리슈케에게 감사드립니다.

1. 마약이 적재된 마리나 블루 라벨 리포솜의 준비
참고: 청색 형광 염료, 마리나 블루 및 약물을 운반하는 리포좀은 폴록사머 188의 사후 삽입과 함께 박막 수화 방법을 사용하여 제조된다. 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 제어 리포솜은 마리나 블루와 PBS만 운반합니다. 여기서 본 예는 대표적인 개념 증명으로 사용되는 미토콘드리아 표적 항산화제<sup...

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여기에서, 우리는 애벌레 얼룩말물고기에 있는 대식세포를 구체적으로 표적으로 하기 위하여 약 로드한 리포좀을 공식화하는 상세한 프로토콜을 제공했습니다. 이 방법은 특정 질병 모델에서 대식세포의 역할을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 약물의 일반적인 독성이 침수와 같은 보다 전통적인 경로에 의해 전달될 때 그들의 사용을 제한할 때 사용될 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜...

단핵 식세포 시스템은 침입 병원균에 대한 첫 번째 방어선을 제공합니다. 이 시스템은 단핵구, 단핵구 유래 수지상 세포 및 대식세포로 구성되어 있으며, 이는 적극적으로 외래 병원균을 식균화하여 병원균 확산을 제한합니다. 이러한 식균 및 미생물 이펙터 기능 이외에, 수지상 세포 및 대식세포는 또한 적응형 면역 계통을 활성화시키기 위해 사이토카인 생산 및 항원-프리젠테이션이 가능하다1. 이들 세포 중 대식세포는 자가면역 및 감염성 질환에서암2,3,4,5,6,7에이르는 다양한 기능적 이질성 및 다중 염증성 질환에 의한 참여로 인해 특별한 주목을 받고 있다. 대식세포의 가소성과 기능적으로 그들의 조직 환경에 대한 요구에 적응하는 능력은 생체 내에서 이 세포를 직접 관찰하고 심문하는 실험적인 접근법을 필요로 합니다.
애벌레 얼룩말은 생체 내 대식세포의 기능과 가소성을 연구하는 이상적인 모델 유기체이다8. 애벌레 제브라피시의 광학 투명성은 대식세포의 동작을 직접 관찰할 수 있는 창을 제공하며, 특히 대식세포 표시 형질전환 리포터 라인과 결합될 때 더욱 이같이 말합니다. 애벌레 제브라피시의 살아있는 이미징 전위 및 실험적 견인력을 이용하는것은 인간 질병9,10,11, 12,13,14,15와직접적인 관련이 있는 대식세포 기능에 대한 많은 중요한 통찰력을 이끌어 내고 있다. 이러한 연구의 대부분은 또한 제브라피시의 약물 활성의 높은 보존을 활용하고있다 (전체 동물 약물 발견 플랫폼으로 자신의 사용을 뒷받침하는 속성16,17,18),약리학적으로 대식세포 기능을 조작하는 화학 적 개입을 활용하여. 현재까지, 이러한 약리학적 치료는 대부분 침수를 통해 전달되어 왔으며, 이는 수용성 약물을 요구하거나, 또는 자유 약물의 직접 미세 주입에 의해(그림 1A). 이러한 수동 전달 전략의 한계는 대식 세포 기능에 미치는 영향을 평가 하는 것을 배제할 수 있는 오프 대상 효과 및 일반적인 독성을 포함 합니다. 또한, 대 식 세포에 약물 효과 조사 할 때 그것은 약물 이 대식 세포 자체에 행동 또는 더 간접 적인 메커니즘을 통해 알 수 없습니다. 대식세포 기능을 조사하기 위해 유사한 화학 적 개입 연구를 수행 할 때, 우리는 대식 세포에 특별히 약물을 대상으로 저렴하고 간단한 전달 방법을 개발하는 충족되지 않은 필요성이 있음을 인식했다.
리포솜은 단백질, 뉴클레오티드 및 약물화물(19)을캡슐화할 수 있는 현미경, 생체 적합성, 지질 이중층 소포이다. 리포좀의 단일 또는 다층 지질 이중층 구조는 수용성 약물이 통합될 수 있는 수성 내부 루멘을 형성하고 소수성 약물은 지질 막에 통합될 수 있습니다. 또한, 크기, 전하 및 표면 변형을 포함하는 리포좀의 물리화학적 특성은 특정세포(20,21)에그들의 표적화를 맞춤화하도록 조작될 수 있다. 리포솜의 이러한 특징은 그들에게 약물을 전달하고 현재 치료 요법20의정밀도를 향상시키는 매력적인 차량으로 만들었습니다. 리포솜은 대식세포에 의해 자연적으로 식세포화(절제 실험을 위한 대식세포에 특이적으로 클로드로네이트를 전달하는 데 일상적인 사용에 의해 악용되는 특징22),그들은 대식세포 특이적 약물 전달을 위한 매력적인 옵션으로 제시한다(그림1B).
이 프로토콜은 친수성 폴리머 폴록사머(188)로 코팅된 청색 형광 지질종으로 약물의 제형을 설명하고, 이는 리포솜 표면에 보호층을 형성하고 약물 보유를 향상시키고 우수한 생체적합성(23)을갖는다는 것을 나타내었다. 폴록사머는 우리의 이전 연구에서 리포솜의 표면 코팅을 위해 선택되었다, 폴리에틸렌 글리콜 수정 리포좀에 비해, 폴록사머 수정 리포좀은 정맥 주입 다음 토끼에 쥐 발 및 유사한 약동학의 피하 주입 다음 더 나은 생체 적합성을 보였다23. 프로토콜은 또한 유충 제브라피시및 살아있는 이미징으로 의학적 주사를 위해 설명되어 리포좀 분해 및 세포질 약물 전달에 필요한 세포내 구획에 대한 대식세포 표적화 능력 및 국소화를 평가합니다. 개념 증명으로 우리는 이전에 급성 gouty 염증(24)의애벌레 얼룩말 모델에서 자신의 활성화를 억제하기 위해 대식세포에 두 약물을 대상으로이 기술을 사용했다. 이 약물 전달 기술은 관심 있는 약물의 대식세포 타겟팅을 보장하고자 하는 제브라피시 연구원들이 사용할 수 있는 화학 "툴킷"을 확장합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Zebrafish(Danio rerio)유충은 기능적으로 보존된 선천적 면역 계통으로 인해 염증성 질환에 대한 항성 병원체 상호 작용 및 선천성 면역 세포의 기여를 조사하는 인기있는 모델로 개발되었습니다. 그(것)들은 또한 선천적인 면역 세포가 발달 과정을 인도하는 것을 어떻게 돕기 위하여 검토하기 위하여 널리 이용됩니다. 애벌레 얼룩말피시의 광학 투명성 및 유전적 견인성을 활용함으로써, 이러한 연구는 종종 기능적으로 형광으로 표시된 대식세포와 호중구를 그대로 동물 내에서 특성화하는 라이브 이미징 접근법에 초점을 맞춥니다. 다양한 기능성 이질성과 질병 발병기전에서 끊임없이 확장되는 역할로 인해 대식세포는 상당한 주목을 받고 있습니다. 유전자 조작 이외에, 화학적 개입은 지금 애벌레 얼룩말물고기에 있는 대식세포 행동을 조작하고 검토하기 위하여 일상적으로 이용됩니다. 이들 약물의 전달은 전형적으로 직접 침지 또는 미세 주입을 통한 자유 약물의 수동 표적화로 제한된다. 이러한 접근법은 대식세포 거동에 대한 모든 변화가 대식세포 자체에 대한 약물의 직접적인 영향의 결과이며 다른 세포 유형에 직접적인 영향을 미치는 다운스트림 결과가 아니라는 가정에 의존합니다. 여기에서는 약물로드 형광 리포좀을 마이크로 주입하여 애벌레 제브라피시 대식세포에 대한 표적화 약물을 대상으로 하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 poloxamer 188 개량한 약 로드된 청색 형광 리포좀이 호중구가 아니라 대식세포에 의해 쉽게 채택된다는 것을 밝힙니다. 우리는 또한 이 방법으로 전달된 약이 약물의 작용 기계장치와 일치하는 방식으로 대식세포 활동에 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공합니다. 이 기술은 대식세포에 약물의 표적을 보장하고자하는 연구자와 약물이 침수와 같은 전통적인 방법에 의해 전달되기에 너무 독성이있을 때 가치가있을 것입니다.

약물을 둘러싸는 형광 리포좀의 제조를 위해 여기에 기술된 박막 수화 접근법은 간단하고 비용 효율적인 방법이다. 본 연구에 사용된 프로토콜로, 리포솜은23,24. 생산된 리포좀의 크기, 제타 전위, 약물 로딩 및 포획 효율은 표 1에요약되어 있다. 리포좀의 입자 크기(약물 로딩 전후)는유사하다(표 1). 약물로 충전된 리포좀의 표?...

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Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

여기서, 우리는 대식세포 혈통 세포에 대한 약물 전달을 표적으로 하기 위한 목적으로 약물로드 리포좀과 그들의 미세 주입을 애벌레 얼룩말어로 합성하는 것을 기술한다.

약물이 탑재된 리포좀을 주입하여 애벌레 얼룩말 대식세포에 약물을 타겟팅

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

이 프로토콜은 대식세포 기능을 조작하고 평가하기 위해 애벌레 얼룩말 대식세포에 관심있는 약물을 대상으로하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 약물이 특히 리포솜 캡슐화를 통해 대식세포에 표적으로 한다는 것을 확인해서 침수와 같은 전통적인 약 납품 전략에 비해 이점이 있습니다. 염증 성분을 가진 질병의 제브라피시 모델에 적용될 때, 이 기술은 대식세포가 병리학 적 과정에 기여하는 방법을 해결할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.여기서, 우리는 활성화를 억제하기 위해 대식세포에 미토콘드리아 반응성 산소 종 억제 약물을 표적으로 하여이 기술의 유용성을 입증한다. 애벌레에 약물로드 리포솜의 미세 주입은 도전이 될 수 있습니다, 과도한 상피 손상을 유발하지 않도록주의가 취해야하기 때문에, 잠재적으로 면역 학적 연구에 영향을 미치는. 이 프로토콜의 시각적 데모는 단일 실험실에서 일상적으로 수행되지 않을 수 있는 약리학 및 전체 동물 라이브 세포 방법론을 수반하기 때문에 중요합니다.25 밀리리터 라운드 하단 플라스크에서 10 밀리그램의 리포솜을 준비하려면 31 나노몰라의 마린 블루와 미토콘드리아 반응성 산소 종 억제 약물의 300 나노몰라를 플라스크에 첨가하십시오. 진공 압력하에서 분당 섭씨 75도 회전시 45도 이상의 회전 증발기에서 용매를 천천히 제거하여 간단히 초음파 처리합니다. 플라스크의 유리 벽 내에 건조한 지질 박막이 형성되면, 유기 용매의 완전한 제거를 용이하게하기 위해 질소 하에서 45 분 동안 필름을 더 건조시키십시오.다음으로, PBS의 1 밀리리터로 필름을 수화하고, 플라스크를 파라핀 필름으로 밀봉한 후 플라스크를 60도 의 수유 욕조에 손으로 교반합니다. 7사이클의 동결 및 해동 후, 미니 압출기와 1마이크로미터 트랙 에칭 폴리카보네이트 멤브레인을 사용하여 2~6사이클 동안 리포좀을 돌출합니다. 큰 unilamellar 소포가 얻어졌을 때, 초원심 분리에 의해 펠릿에 신선한 리포솜을 응축합니다.펠릿에 1%폴로사머 188 용액1밀리리터로 1밀리리터188 용액을 섭씨 45도, 밀리터리 마이크로센시르후지 튜브 부착이 있는 ThermoMixer에서 분당 750회 회전하는 데 30분 동안 배양합니다. 폴로사머(188)를 리포솜에 삽입하는 동안, 정확한 폴로사머 농도, 인큐베이션 시간 및 온도는 결과 리포솜의 최적의 물리화학적 특성을 달성하는 데 중요하다. 인큐베이션의 끝에서, 초원심분리는 동일한 원심분리기 조건하에서 혼합물을 다시 분리하고, 임의의 언바운드 중합체 또는 약물을 포함하는 상퍼나탄을 제거한다.그런 다음 빛으로부터 보호되는 리포솜 펠릿을 섭씨 4도에 보관하십시오. 리포솜의 크기와 제타 전위를 결정하기 위해 리포솜 제형을 1 대 100 비율로 초순수물로 희석한다. 동적 광 산란 분석기를 사용하여 입자 크기, 다분산도 지수 및 제타 전위를 섭씨 25도에서 측정합니다.리포솜의 함정 효율과 약물 적재를 계산하려면 트리톤 X-100에서 리포솜을 용해하십시오. 용존 리포솜 샘플 20마이크로리터를 쿼터니펌프, 230나노미터로 설정된 다이오드 어레이 검출기, 3마이크로미터, 250배-4.6mm 컬럼을 갖춘 고압 액체 크로마토그래피 시스템에 주입한다. 주사를 위해 형질전환 제브라피시 유충을 준비하려면 미세 팁 집게를 사용하여 수정 후 30 시간 배아를 수동으로 데코리오네이트하고 배아가 2 일 후 수정까지 섭씨 28.5도에서 개발할 수 있도록하십시오.배아가 적절한 단계에 도달하면, 멸균 PBS에서 1 대 1 비율로 갓 준비 된 리포솜 제형을 희석하고, 소용돌이에 의해 2 ~ 3 초 동안 용액을 혼합한다. E3 배지에 충분한 3%의 메틸 셀룰로오스를 35mm 배양 접시 뚜껑의 뚜껑에 붓고 전체 표면을 덮는 얇은 필름을 형성합니다. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 약 20~25개의 마취유충 풀을 수집합니다.배아가 중력에 의해 파이펫의 끝에 집중하고, 조심스럽게 최소한의 용액으로 35 밀리미터 배양 접시 뚜껑의 중간에 유충을 전송 할 수 있습니다. 마이크로 모세관 로더를 사용하여 주사제판 의 상단쪽으로 애벌레를 배치하여 등쪽 표면이 미세 주입 바늘을 향하여 마이크로 주입 바늘을 향하게 하거나, 주위 베노에 주입하기 위해 미세 주입 바늘을 향하여 주입 판의 왼쪽쪽으로 전방을 배치하십시오. 마이크로 모세관 로더를 사용하여 리포솜 주입 믹스의 약 5 마이크로 리터로 주사 바늘을 다시 채웁니다.바늘을 자기 스탠드 및 압력 인젝터에 연결된 미세 조작기에 장착하고 스테레오 현미경 아래에 설치를 배치합니다. 깨끗하고 미세한 집게를 사용하여 미세 주입 바늘의 끝을 잘라 직경약 5 마이크로미터의 개구부를 생성합니다. 인젝터를 약 50밀리초의 펄스 지속 시간과 평방 인치당 약 40파운드의 주입 압력을 설정합니다.주입할 부피를 보정하기 위해 혈류계의 그리드 라인에 위치한 미네랄 오일 한 방울에 볼러스를 주입합니다. 그런 다음 볼루스의 직경이 가장 작은 그리드 라인의 2 1/2를 덮을 때까지 펄스 지속시간 및/또는 사출 압력을 조정합니다. 각 애벌레의 뒷뇌 심실에 리포솜 주입 믹스의 나노리터 1개를 조심스럽게 주입합니다.주사 직후, 주사판에 E3 배지를 추가하고 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 메틸 셀룰로오스에서 유충을 부드럽게 교반합니다. 물 침지 렌즈가 장착된 공초점 현미경으로 힌드뇌의 등쪽 표면을 이미지화하기 위해 먼저 35mm 배양 접시를 장착 매체로 5밀리미터 깊이로 채우고 중간 중합체를 허용한다. 실험배아의 노른자 낭을 수용할 수 있는 충분한 면적의 아가로오스에 작은 트렌치를 발굴하고, 마취된 유충을 수거하기 위해 용융 장착 매체로 채워진 플라스틱 이송 파이펫을 사용한다.즉시 유충을 문화 접시에 넣고 마이크로 모세관 로더를 사용하여 노른자 삭 복부 면을 발굴 된 구멍으로 방향을 지정합니다. 아가로즈가 중합될 때까지 이 위치에서 배아를 유지한다. 트리사인 밀리리터 당 200 마이크로그램으로 보충된 E3 배지로 배아를 덮어놓습니다.뒷뇌 심실을 이미지화하려면 20배 목표를 선택하고 공초점 현미경을 512x x 512 픽셀 및 2.5x 줌으로 설정합니다. 현미경 매개 변수가 설정되면, 블루 형광 리포솜과 녹색 형광 대식파지를 이미지하기 위해 2 채널 이미징을 사용하여 뒤뇌의 등쪽 가장 표면에서 확장 40 x 3 마이크로 미터 Z 스택을 습득. 모든 이미지를 얻은 경우 파일을 적절한 3D 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에 로드합니다.측정 탭에서 개체 찾기 프로토콜을 드래그 작업으로 드래그하여 측정 공간을 만듭니다. DAPI 채널을 선택하여 리포솜을 강조 표시하고 Z 단면을 통해 검사 도구를 드래그하여 리포솜이 함유된 대식세포를 감지합니다. 개별 셀 내에서 리포솜의 형광 강도를 정량화하려면 클립을 관심 영역 으로 드래그 태스크로 드래그 하여 측정 공간을 만들고 사각형 도구를 사용하여 X, Y 및 Z 치수에 관심 있는 셀 주위에 상자를 그립니다.그런 다음 측정 드롭다운 메뉴에서 측정 항목 만들기를 선택하여 라이브러리 창에 측정 파일을 생성합니다. 이 표에서, 생성된 리포솜의 크기, 제타 전위, 약물 적재 및 함정 효율이 요약된다. 관찰된 바와 같이, 리포솜의 입자 크기는 약물 적재와 유사하지만, 약물 적재 리포솜의 표면 전하는 해양 블루만으로 제어 리포솜보다 약간 더 중립적이다.해양 청색 라벨 리포솜을 뒷뇌 심실로 미세 주입하면, 입증된 바와 같이, 주체 대식세포에 의해 빠르게 섭취하여 3시간 후 주입에 의한 공초점 현미경 검사법에 의해 용이하게 정량화될 수 있습니다. 호중구는, 그러나, 거의 세포내 리포솜을 포함하는 관찰되지 않습니다. 개별 리포솜이 함유된 대식세포 내에서, 리포솜은 지방분해 및 후속 약물 함량이 세포질로 방출되는 데 필요한 phagolysosomal 구획 내에 축적됩니다.부비동 독소로의 전달은 순환을 통해 소달 조혈 조직 -상주 대식세포에 리포솜을 전달할 수 있습니다. 미토콘드리아 반응성 산소 종 억제 약물이 뇌 심실로 적재된 리포솜을 미세 주입하면 리포솜이 함유된 뒤뇌-상주 대식세포 내에서 단일나트륨 유레이트 결정 유도 미토콘드리아 반응성 산소 종 생산을 크게 억제할 수 있다. 대식세포 활성화 상태에 대한 관심있는 약물의 억제 효과의 추가 검증은 시상 혼성화 및 호중구의 측량 모집에 전체 마운트에 의해 염증성 사이토카인 유전자 발현을 조사함으로써 수행 될 수있다.이 기술을 사용하여, 우리는 면역 대사 기계장치가 급성 조티 염증의 애벌레 얼룩말 부피 모형에 있는 그들의 활성화를 유도한다는 것을 확인하기 위하여 대식세포에 약을 표적으로 할 수 있었습니다. 이 프로토콜의 미래 적응은 대식세포 표적화를 향상시키거나 호중구와 같은 다른 면역 세포에 표적화를 촉진하기 위해 리포솜의 표면 수정을 수행하는 것을 포함할 수 있었다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...