Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd tildelt C.J.H. (Health research Council of New Zealand og Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) og Z.W. (Faculty Research Development Fund fra University of Auckland). Forfatterne takker Alhad Mahagaonkar for ekspertstyring av sebrafiskanlegget, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland for hjelp med confocal imaging og Graham Lieschke for å gi tg (mpeg1:EGFP) reporterlinje.

1. Utarbeidelse av narkotika-lastet Marina Blå-merket Liposomer
MERK: Liposomer som bærer det blå fluorescerende farge, Marina Blue og stoffet er utarbeidet ved hjelp av en tynn film hydreringsmetode med postinnsetting av poloxamer 188. Alle prosedyrer utføres ved romtemperatur med mindre annet er spesifisert. Kontroller liposomer bare bære Marina blå og PBS. Eksemplet her beskriver lasting liposomer med en mitokondrier-målretting antioksidant narkotika25 som bruke...

<ol>
	<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Krenkel, O., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+macrophages+in+tissue+homeostasis+and+disease.">Liver macrophages in tissue homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).</li><li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+immunology:+turning+macrophages+on,+off+and+on+again.">Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).</li><li>Lawrence, T., Natoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+macrophage+polarization:+enabling+diversity+with+identity.">Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoresponsive+gene+1+augments+bactericidal+activity+of+macrophage-lineage+cells+by+regulating+beta-oxidation-dependent+mitochondrial+ROS+production.">Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production.</a> Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+fatty+acid-fueled+mROS+production+within+macrophages+alleviates+acute+gouty+inflammation.">Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).</li><li>Cambier, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+manipulate+macrophage+recruitment+through+coordinated+use+of+membrane+lipids.">Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids.</a> Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Madigan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrophage+Response+to+Mycobacterium+leprae+Phenolic+Glycolipid+Initiates+Nerve+Damage+in+Leprosy.">A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy.</a> Cell. 170 (5), 973-985 (2017).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lta4h+locus+modulates+susceptibility+to+mycobacterial+infection+in+zebrafish+and+humans.">The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans.</a> Cell. 140 (5), 717-730 (2010).</li><li>Volkman, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+granuloma+induction+via+interaction+of+a+bacterial+secreted+protein+with+host+epithelium.">Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium.</a> Science. 327 (5964), 466-469 (2010).</li><li>Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+the+future+of+drug+discovery:+in+vivo+chemical+screens+in+zebrafish.">Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish.</a> ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+nanoparticles:+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer.">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers.">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).</li><li>Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stealth+liposomes:+review+of+the+basic+science,+rationale,+and+clinical+applications,+existing+and+potential.">Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential.</a> International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+cells+and+bacterial+infection+in+zebrafish.">Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-insertion+of+poloxamer+188+strengthened+liposomal+membrane+and+reduced+drug+irritancy+and+in+vivo+precipitation,+superior+to+PEGylation.">Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation.</a> Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome-Mediated+Drug+Delivery+in+Larval+Zebrafish+to+Manipulate+Macrophage+Function.">Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function.</a> Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).</li><li>Cader, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C13orf31+(FAMIN)+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function.">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes.">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages:+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification.">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li><li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+zebrafish+leukocytes.">Live cell imaging of zebrafish leukocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rag-Ragulator+Complex+Regulates+Lysosome+Function+and+Phagocytic+Flux+in+Microglia.">The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia.</a> Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+to+macrophages:+role+of+physicochemical+properties+of+particulate+carriers--liposomes+and+microspheres--on+the+phagocytosis+by+macrophages.">Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).</li><li>Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+macrophages+initiating+and+driving+inflammation+in+a+monosodium+urate+monohydrate+crystal-induced+murine+peritoneal+model+of+acute+gout.">Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).</li><li>Faires, J. S., McCarty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+arthritis+in+man+and+dog+after+intrasynovial+injection+of+sodium+urate+crystals.">Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals.</a> Lancet. 280, 682-685 (1962).</li><li>Martin, W. J., Harper, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+inflammation+and+resolution+in+acute+gout.">Innate inflammation and resolution in acute gout.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).</li><li>Fenaroli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+drug+delivery+system+against+tuberculosis+in+zebrafish+embryos:+direct+visualization+and+treatment.">Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment.</a> ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).</li><li>Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Neutrophilic+Inflammation+Using+Polymersome-Mediated+Cellular+Delivery.">Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery.</a> Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li><li>Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+liposomal+drug+delivery+to+monocytes+and+macrophages.">Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).</li><li>Fidler, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+liposomes+to+improve+delivery+of+macrophage-augmenting+agents+to+alveolar+macrophages.">Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages.</a> Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).</li><li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish:+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis.">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li></ol>

Her har vi gitt en detaljert protokoll for å formulere legemiddelbelastede liposomer for å spesifikt målrette makrofager i larvalsebrafisk. Denne metoden kan brukes til å dissekere makrofagenes rolle i visse sykdomsmodeller ved å sikre direkte målrettet levering av legemidler spesielt til makrofager. Videre kan det brukes når generell toksisitet av narkotika begrenser bruken når de leveres av mer konvensjonelle ruter, som nedsenking. Protokollen som er beskrevet her, gir et alternativ til andre nanopartikler som ...

Det enukleære phagocyte-systemet gir en første forsvarslinje mot invaderende patogener. Dette systemet består av monocytter, monocytt-avledede dendrittiske celler og makrofager, som aktivt fagocytoze utenlandske patogener, og dermed begrense patogenspredning. I tillegg til disse fagocytiske og mikrobicidale effektorfunksjonene er dendrittiske celler og makrofager også i stand til cytokinproduksjon og antigenpresentasjon for å aktivere det adaptive immunsystemet1. Av disse cellene har makrofager fått spesiell oppmerksomhet på grunn av deres mangfoldige funksjonelle heterogenitet og involvering i flere inflammatoriske sykdommer, fra autoimmunitet og smittsomme sykdommer til kreft2,3,4,5,6,7. Plastisiteten til makrofager og deres evne til å funksjonelt tilpasse seg behovene til vevsmiljøet, krever eksperimentelle tilnærminger for å direkte observere og avhøre disse cellene i vivo.
Larval sebrafisk er en ideell modell organisme for å studere funksjonen og plastisiteten til makrofager in vivo8. Den optiske gjennomsiktigheten til larvalsebrafisk gir et vindu for å direkte observere oppførselen til makrofager, spesielt når de er kombinert med makrofag-merking transgene reporterlinjer. Utnytte live imaging potensial og eksperimentell elimive tractability av larval sebrafisk har ført til mange betydelig innsikt i makrofag funksjon som har direkte relevans for menneskelig sykdom9,10,11,12,13,14,15. Mange av disse studiene har også benyttet seg av høy bevaring av narkotikaaktivitet i sebrafisk (et attributt som underbygger deres bruk som en hel dyrenarkotikaoppdagelsesplattform16,17,18), ved å utnytte kjemiske intervensjoner til farmakologisk manipulere makrofagfunksjon. Til dags dato har disse farmakologiske behandlingene for det meste blitt levert enten gjennom nedsenking, noe som krever at stoffet er vannløselig, eller ved direkte mikroinjeksjon av fritt legemiddel (figur 1A). Begrensninger i disse passive leveringsstrategiene inkluderer off-target effekter og generell toksisitet som kan utelukke å vurdere eventuelle innvirkning på makrofagfunksjon. I tillegg, når du undersøker narkotikaeffekter på makrofager, er det ukjent om stoffene handler på makrofagene selv eller gjennom mer indirekte mekanismer. Når vi utfører lignende kjemiske intervensjonsstudier for å undersøke makrofagfunksjon, innså vi at det var et udekket behov for å utvikle en billig og grei leveringsmetode for å målrette narkotika spesielt mot makrofager.
Liposomer er mikroskopiske, biokompatible, lipid tolagsvesikler som kan innkapsle proteiner, nukleotider og legemiddellast19. Unilamellar eller multilamellær lipid bilayer struktur av liposomer danner en vandig indre lumen der vannløselige legemidler kan innlemmes mens hydrofobe legemidler kan integreres i lipidmembraner. I tillegg kan de fysikokjemiske egenskapene til liposomer, inkludert størrelse, ladning og overflatemodifikasjoner manipuleres for å skreddersy målrettingen til bestemte celler20,21. Disse funksjonene av liposomer har gjort dem til et attraktivt kjøretøy for å levere narkotika og forbedre presisjonen av dagens behandlingsregimer20. Som liposomer er naturlig phagocytozed av makrofager (en funksjon utnyttet av deres rutinemessigbruk i å levere clodronate spesielt til makrofager for ablasjon eksperimenter22), de presenterer som et attraktivt alternativ for makrofag-spesifikk narkotikalevering (Figur 1B).
Denne protokollen beskriver formuleringen av legemidler i blå fluorescerende liposomer belagt med hydrofile polymer poloxamer 188, som danner et beskyttende lag på liposom overflaten og har vist seg å forbedre stoffet oppbevaring og har overlegen biokompatibilitet23. Poloxamer ble valgt for overflatebelegg av liposomer som vår tidligere forskning hadde vist at sammenlignet med polyetylenglykol modifisertliposomer, poloxamer modifisertliposomer viste bedre biokompatibilitet etter subkutan injeksjon av rottepoter og lignende farmakokinetikk hos kaniner etter intravenøs infusjon23. Protokoller er også beskrevet for deres mikroinjeksjon i larval sebrafisk og levende bildebehandling for å vurdere deres makrofag-målretting evne og lokalisering til intracellulære rom som er nødvendige for liposom nedbrytning og cytoplasmatisk narkotikalevering. Som et konseptbevis har vi tidligere brukt denne teknikken til å målrette to legemidler til makrofager for å undertrykke aktiveringen i en larvesebrafiskmodell av akutt giktisk betennelse24. Denne legemiddelleveringsteknikken utvider den kjemiske "verktøykassen" som er tilgjengelig for sebrafiskforskere som ønsker å sikre makrofag-målretting av sine legemidler av interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Sebrafisk (Danio rerio) larver har utviklet seg til en populær modell for å undersøke host-patogeninteraksjoner og bidrag et medfødt immunceller til inflammatorisk sykdom på grunn av deres funksjonelt bevarte medfødte immunsystem. De er også mye brukt til å undersøke hvordan medfødte immunceller bidrar til å veilede utviklingsprosesser. Ved å dra nytte av den optiske gjennomsiktigheten og genetiske tractability av larval sebrafisk, fokuserer disse studiene ofte på levende bildetilnærminger for å funksjonelt karakterisere fluorescerende merkede makrofager og nøytrofiler i intakte dyr. På grunn av deres mangfoldige funksjonelle heterogenitet og stadig voksende roller i sykdomspatogenese, har makrofager fått betydelig oppmerksomhet. I tillegg til genetiske manipulasjoner brukes kjemiske intervensjoner nå rutinemessig til å manipulere og undersøke makrofagatferd i larvalsebrafisk. Levering av disse stoffene er vanligvis begrenset til passiv målretting av gratis stoff gjennom direkte nedsenking eller mikroinjeksjon. Disse tilnærmingene er avhengige av antagelsen om at eventuelle endringer i makrofagatferd er et resultat av en direkte effekt av stoffet på makrofagene selv, og ikke en nedstrøms konsekvens av en direkte effekt på en annen celletype. Her presenterer vi våre protokoller for målretting av legemidler spesielt til larvesebrafisk makrofager ved mikrosprøytende legemiddelbelastede fluorescerende liposomer. Vi avslører at poloxamer 188-modifiserte narkotika-lastet blå fluorescerende liposomer er lett tatt opp av makrofager, og ikke av nøytrofiler. Vi gir også bevis for at legemidler levert på denne måten kan påvirke makrofagaktivitet på en måte som er i samsvar med virkningsmekanismen til stoffet. Denne teknikken vil være av verdi for forskere som ønsker å sikre målretting av legemidler til makrofager og når narkotika er for giftige til å bli levert av tradisjonelle metoder som nedsenking.

Den tynne filmen hydrering tilnærming beskrevet her for fremstilling av fluorescerende liposomer omslutter narkotika er en enkel og kostnadseffektiv metode. Med protokollen som brukes i denne studien, liposomer forventes å være unilamellar23,24. Størrelsen, zeta potensial, narkotika lasting og entrapment effektivitet av liposomer produsert er oppsummert i tabell 1. Partikkelstørrelsen på liposomene (før og etter lasting av legemidler) er l...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Her beskriver vi syntesen av legemiddelbelastede liposomer og deres mikroinjeksjon i larvesebrafisk med det formål å målrette narkotikalevering til makrofag-avstamningceller.

Målretting narkotika til Larval Zebrafish Macrophages ved å injisere narkotika-lastet liposomer

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Denne protokollen beskriver en teknikk for å målrette mot legemidler av interesse for larval sebrafisk makrofager for å manipulere og evaluere makrofag funksjon. Denne teknikken har fordeler over tradisjonelle narkotika levering strategier som nedsenking ved å sikre at narkotika er spesielt rettet mot makrofager gjennom liposom innkapsling. Når den brukes på sebrafiskmodeller av sykdom med en inflammatorisk komponent, har denne teknikken potensial til å løse hvordan makrofager bidrar til patologiske prosesser.Her demonstrerer vi nytten av denne teknikken ved å målrette mot et mitokondriereaktivt oksygenarthemmende stoff til makrofager for å undertrykke aktivering. Mikroinjeksjonen av stofflastede liposomer i larver kan være utfordrende, da det bør tas hensyn til ikke å forårsake overdreven epitelskade, noe som potensielt påvirker immunologiske studier. Visuell demonstrasjon av denne protokollen er viktig fordi det innebærer farmakologiske og hele dyr levende celle metoder som ikke kan rutinemessig utføres i et enkelt laboratorium.For å forberede 10 milligram liposomer i en 25-milliliter rundbunnkolbe, tilsett 31 nanomolars marineblå og 300 nanomolarer av et mitokondriereaktivt oksygenarthemmende stoff til kolben. Sonicate kort for å fullstendig oppløse, og fjerne løsemiddelet sakte på en roterende fordamper satt over en 45-graders Celsius vannbad på 75 rotasjoner per minutt under vakuumtrykk. Når en tørr lipid tynn film har dannet seg innenfor glassveggene i kolben, tørk filmen ytterligere i 45 minutter under nitrogen for å lette fullstendig fjerning av det organiske løsningsmidlet.Deretter hydrerer filmen med en milliliter PBS, og forsegle kolben med parafinfilm før du agitating kolben for hånd over et 60-graders Celsius vannbad i 20 minutter. Etter syv sykluser med frysing og tining, bruk en mini-ekstruder og en-mikrometer spor-etset polykarbonat membraner for å ekstrudere liposomer i to til seks sykluser. Når store unilamellar vesikler er oppnådd, kondensere de friske liposomer i en pellet ved ultracentrifugation.Inkuber pelleten med en milliliter 1% poloxamer 188-løsning i 30 minutter ved 45 grader Celsius og 750 rotasjoner per minutt i en ThermoMixer med et to milliliter mikrocentrifuge rørtilbehør. Under innsetting av poloksamer 188 i liposomer, er riktig poloksamerkonsentrasjon, inkubasjonstid og temperatur viktig for å oppnå de optimale fysikalske egenskapene til de resulterende liposomer. På slutten av inkubasjonen, ultracentrifuge blandingen igjen under samme sentrifuge forhold, og fjerne supernatant som inneholder ubundet polymer eller narkotika.Oppbevar deretter liposometpellets ved fire grader Celsius, beskyttet mot lys. For å bestemme størrelsen og zetapotensialet til liposomer, fortynne liposomet formulering med ultrapure vann på en en-til-100 ratio. Bruk en dynamisk lyssplittanalysator for å måle partikkelstørrelsen, polydisperitetsindeksen og zetapotensialet i triplicate ved 25 grader Celsius.For å beregne entrapmenteffektivitet og legemiddellasting av liposomer, oppløs liposomer i Triton X-100. Injiser 20 mikroliter av den oppløste liposometprøven i et høytrykks flytende kromatografisystem med en kvartær pumpe, en diodearraydetektor satt til 230 nanometer, og et tre-mikrometer, 250 ganger-4,6-millimeterkolonne. For å forberede transgene sebrafisk larver for injeksjon, bruk fin-tip tang å manuelt deforere 30 timer etter befruktning embryoer, og la embryoene utvikle seg ved 28,5 grader Celsius til to dager etter befruktning.Når embryoene har nådd riktig stadium, fortynne en nylaget liposom formulering på en en-til-en ratio i steril PBS, og bland løsningen i to til tre sekunder ved vortexing. Hell nok 3% metylcellulose i E3 medium i lokket på et lite, 35 millimeter kulturfatlokk for å danne en tynn film som dekker hele overflaten. Bruk en plastoverføringpipette til å samle et basseng på ca. 20 til 25 bedøvede larver.La embryoene konsentrere seg på tuppen av pipetten ved tyngdekraften, og overfør forsiktig larver inn i midten av 35-millimeters kulturopplokket med minimal løsning. Bruk en mikrokapillær laster til å ordne larver med sine fremre mot toppen av injeksjonsplaten med den dorsale overflaten vendt mot mikroinjeksjonsnålen til injeksjon i bakbrainventrikkelen eller med fremre mot venstre på injeksjonsplaten med ventrale overflater vendt mot mikroinjeksjonsnålen for injeksjon i sinus venosus. Bruk en mikrokapillær laster til å fylle en injeksjonsnål med omtrent fem mikroliter av liposometinjeksjonsblandingen.Monter nålen i en mikromanipulator som er koblet til et magnetisk stativ og en trykkinjektor, og plasser oppsettet under et stereomikroskop. Bruk rene, finspisstang til å kutte spissen av mikroinjeksjonsnålen for å generere en åpning på omtrent fem mikrometer i diameter. Sett injektoren til en pulsvarighet på ca. 50 millisekunder og et injeksjonstrykk på ca. 40 pund per kvadrattomme.Injiser en bolus i en dråpe mineralolje plassert over rutenettlinjene på et hemocytometer for å kalibrere volumet som skal injiseres. Juster deretter pulsvarigheten og/eller injeksjonstrykket til bolusens diameter dekker 2 1/2 av de minste gitterledningene. Injiser forsiktig en nanoliter av liposometinjeksjonsblandingen i bakbrainventrikkelen til hver larver.Umiddelbart etter injeksjonene, tilsett E3 medium til injeksjonsplaten, og bruk en plastoverføringspipett for å forsiktig røre larver ut av metylcellulosen. For å se for deg den dorsale overflaten av bakbrainen på et konfokalt mikroskop utstyrt med en vannsenkingslinse, fyll først en 35-millimeter kulturrett til en dybde på fem millimeter med monteringsmedium, og la mediet polymerisere. Grav ut en liten grøft i agarose av tilstrekkelig område for å imøtekomme eggeplommesekreken til det eksperimentelle embryoet, og bruk en plastoverføringspipett fylt med smeltet monteringsmedium for å samle en bedøvet larve.Deponer umiddelbart larven i kulturfatet, og bruk en mikrokapillær laster til å orientere eggeplommesek ventralsiden ned i de utgravde hullene. Opprettholde embryoet i denne posisjonen til agarose polymeriserer. Overlegg embryoet med E3 medium supplert med 200 mikrogram per milliliter trikain.Hvis du vil aktivere bildet bakbrain ventrikkel, velg 20x målet, og sett konfokal mikroskop til 512 x 512 piksler og en 2,5 x zoom. Når mikroskopparametrene er satt, kan du anskaffe 40-by-tre-mikrometer Z-stabler som strekker seg fra dorsal-mest overflaten av bakbrain ved hjelp av to-kanals bildebehandling for å bilde de blå fluorescerende liposomer og grønne fluorescerende makrofager. Når alle bildene er innhentet, laster du filene inn i et passende 3D-bildeanalyseprogram.Dra Søk etter objekter-protokollen under Mål-fanen til Dra oppgaver her for å gjøre målinger mellomrom. Velg DAPI-kanalen for å utheve liposomer, og dra inspiser verktøyet gjennom Z-seksjonene for å oppdage liposomet-laden makrofager. Hvis du vil kvantifisere fluorescensintensiteten til liposomer i de enkelte cellene, drar du protokollen Klipp til interesseområder til dra oppgaver her for å gjøre målinger plass, og bruker rektangelverktøyet til å tegne en boks rundt cellen av interesse i dimensjonene X, Y og Z.Velg deretter Lag målingselement fra rullegardinmenyen Målinger for å generere en målefil i bibliotekvinduet. I denne tabellen oppsummeres størrelsen, zetapotensialet, legemiddelbelastningen og entrapmenteffektiviteten til de produserte liposomer. Som observert er partikkelstørrelsen på liposomer lik og uten legemiddelbelastning, selv om overflateladningen av stoffbelastede liposomer er litt mer nøytral enn kontrollliposomer med marineblå bare.Mikroinjeksjon av marine blåmerkede liposomer i bakhjernens ventrikkel, som vist, resulterer i et raskt opptak av bosatte makrofager som lett kan kvantifiseres ved konokal mikroskopi med tre timer etter injeksjon. Nøytrofiler observeres imidlertid sjelden å inneholde intracellulære liposomer. Innenfor individuelle liposom-laden makrofager akkumuleres liposomer i de fagoclysosomale rommene, noe som er nødvendig for liposomforringelse og påfølgende legemiddelinnhold som slippes ut i cytoplasma.Levering i sinus venosus kan levere liposomer til kaudale hematopoetiske vev-resident makrofager via sirkulasjonen. Mikroinjeksjon av liposomer lastet med mitokondrie-reaktive oksygen arter-hemmende stoffet i bakbrain ventrikkelen kan betydelig undertrykke monosodium urat krystall-drevet mitokondrie-reaktive oksygen arter produksjon innenfor liposom-laden hindbrain-resident makrofager. Ytterligere validering av de undertrykkende effektene av interessemedisiner på makrofagaktiveringsstater kan utføres ved å undersøke proinflammatoriske cytokingenuttrykk av hele mount in situ hybridisering og timelig rekruttering av nøytrofiler.Ved hjelp av denne teknikken, Vi har vært i stand til å målrette narkotika til makrofager for å bekrefte at en immunometabolic mekanisme driver deres aktivering i en larval sebrafisk modell av akutt gouty betennelse. Fremtidige tilpasninger av denne protokollen kan omfatte å utføre overflatemodifisering av liposomet for å forbedre makrofagmålretting eller for å fremme målretting mot andre immunceller, for eksempel nøytrofiler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanisert mus modell for å studere bakterieinfeksjoner Targeting microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Ved å bruke<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Å studere autofagi-Cytoskjelettet Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere Anti-sopp aktivitet av isolerte alveolære makrofager ved konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Svært effektiv Transfeksjon menneskerettighets THP-1 Makrofager av nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modellering candidiasis i slimhinner i Larvesebrafisk av Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomikk Profilering av Makrofager av 2D elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasiv Imaging av det medfødte immunrespons i en Sebrafisk Larve Modell av<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infeksjon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifisering av cytosolisk vs. vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primær Makrofager av Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk Karakterisering av makrofager fra Rat Nyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Ved hjelp av sebrafisk modeller av menneskelig influensa A virus infeksjoner til skjerm antivirale medikamenter og karakter vertens immuncellere

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...