Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios concedidos à C.J.H. (Conselho de Pesquisa em Saúde da Nova Zelândia e Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) e Z.W. (Fundo de Desenvolvimento de Pesquisa da Faculdade da Universidade de Auckland). Os autores agradecem a Alhad Mahagaonkar pela gestão especializada da instalação de zebrafish, a Unidade de Pesquisa em Imagens Biomédicas, a Escola de Ciências Médicas da Universidade de Auckland por assistência com imagens confocais e Graham Lieschke por presentear a linha de repórteres Tg(mpeg1:EGFP).

1. Preparação de Liposomes marina azul carregado de drogas
NOTA: Liposomes carregando o corante fluorescente azul, Marina Blue e droga são preparados usando um método de hidratação de filme fino com pós-inserção de poloxamer 188. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente, a menos que seja especificado de outra forma. Os liposós de controle só carregam Marina azul e PBS. O exemplo aqui descreve carregar liposomos com uma droga antioxidante25...

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Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para formular liposós carregados de drogas para atingir especificamente macrófagos em zebrafish larval. Este método pode ser usado para dissecar o papel dos macrófagos em certos modelos da doença, garantindo a entrega direta direcionada de medicamentos especificamente aos macrófagos. Além disso, pode ser usado quando a toxicidade geral das drogas limita seu uso quando entregue por rotas mais convencionais, como a imersão. O protocolo descrito aqui fornece uma alternativa a ...

O sistema de phagócito mononuclear fornece uma primeira linha de defesa contra patógenos invasores. Este sistema consiste em monócitos, células e macrófagos derivados de monocitos, que ativamente fagocytoze patógenos estrangeiros, limitando assim a propagação de patógenos. Além dessas funções de efeito phagofítico e microbicida, células dendríticas e macrófagos também são capazes de produção de citocinas e apresentação de antígenos para ativar o sistema imunológico adaptativo1. Dessas células, os macrófagos têm recebido atenção especial devido à sua diversa heterogeneidade funcional e envolvimento em múltiplas doenças inflamatórias, desde autoimunidade e doenças infecciosas até câncer2,3,4,5,6,7. A plasticidade dos macrófagos e sua capacidade de se adaptar funcionalmente às necessidades de seu ambiente tecidual exigem abordagens experimentais para observar e interrogar diretamente essas células in vivo.
Zebrafish larval são um organismo modelo ideal pelo qual estudar a função e plasticidade dos macrófagos no vivo8. A transparência óptica do zebrafish larval fornece uma janela para observar diretamente o comportamento dos macrófagos, especialmente quando acoplado com linhas de repórtertransgênicas com marcação de macrófagos. Explorar o potencial de imagem ao vivo e a tratabilidade experimental de zebrafish larval levou a muitas percepções significativas sobre a função macrófaga que têm relevância direta para a doença humana9,10,11,12,13,14,15. Muitos desses estudos também se aproveitaram da alta conservação da atividade medicamentosa em zebrafish (atributo que sustenta seu uso como uma plataforma inteira de descoberta de drogas animais16,17,18), utilizando intervenções químicas para manipular farmacologicamente a função macrófago. Até o momento, esses tratamentos farmacológicos têm sido entregues principalmente através da imersão, o que exige que a droga seja solúvel em água, ou por microinjeção direta de droga gratuita(Figura 1A). Limitações dessas estratégias de entrega passiva incluem efeitos fora do alvo e toxicidade geral que podem impedir a avaliação de qualquer impacto na função do macrófago. Além disso, ao investigar efeitos medicamentosos em macrófagos não se sabe se as drogas estão agindo sobre os próprios macrófagos ou através de mecanismos mais indiretos. Ao realizar estudos semelhantes de intervenção química para investigar a função do macrófago, reconhecemos que havia uma necessidade não atendida de desenvolver um método de entrega barato e direto para direcionar medicamentos especificamente para macrófagos.
Liposomos são corículas microscópicas, biocompatíveis e lipídicas que podem encapsular proteínas, nucleotídeos e carga de drogas19. A estrutura de bicamadas lipídicas unilamelares ou multilémelares de liposomos forma um lúmen interno aquoso onde drogas solúveis em água podem ser incorporadas enquanto drogas hidrofóbicas podem ser integradas às membranas lipídicas. Além disso, as propriedades físicoquímicas dos liposomos, incluindo tamanho, carga e modificações de superfície podem ser manipuladas para adaptar seu direcionamento a células específicas20,21. Essas características dos liposomos tornaram-nos um veículo atraente para entregar medicamentos e melhorar a precisão dos regimes de tratamento atuais20. Como os liposós são naturalmente fagocytozed por macrófagos (um recurso explorado por seu uso rotineiro na entrega de clodronato especificamente para macrófagos para experimentos de ablação22), eles apresentam como uma opção atraente para a entrega de drogas específicas do macrófago(Figura 1B).
Este protocolo descreve a formulação de medicamentos em liposomos fluorescentes azuis revestidos com o poloxamer de polímero hidrofílico 188, que forma uma camada protetora na superfície liposome e tem sido mostrado para melhorar a retenção de drogas e ter biocompatibilidade superior23. Poloxamer foi escolhido para revestimento superficial de liposomos como nossa pesquisa anterior mostrou que, quando comparado com liposós modificados de polietileno glicol, liposomos modificados de poloxamer mostraram melhor biocompatibilidade após injeção subcutânea de patas de rato e farmacocinética semelhante em coelhos após infusão intravenosa23. Protocolos também são descritos para sua microinjeção em zebrafish larval e imagens vivas para avaliar sua capacidade de segmentação de macrófagos e localização para compartimentos intracelulares necessários para degradação liposome e entrega de drogas citoplasmáticas. Como prova de conceito, já usamos essa técnica para direcionar duas drogas aos macrófagos para suprimir sua ativação em um modelo de zebrafish larval de inflamação gouty aguda24. Esta técnica de entrega de drogas expande o "kit de ferramentas" químico disponível para pesquisadores de zebrafish que desejam garantir o direcionamento de macrófagos de suas drogas de interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

As larvas de zebrafish (Danio rerio) desenvolveram-se em um modelo popular para investigar interações hospedeiras-patógenas e a contribuição de células imunes inatas para doenças inflamatórias devido ao seu sistema imunológico inato funcionalmente conservado. Eles também são amplamente utilizados para examinar como as células imunes inatas ajudam a orientar os processos de desenvolvimento. Aproveitando a transparência óptica e a tratabilidade genética dos zebrafish larvais, esses estudos muitas vezes se concentram em abordagens de imagem ao vivo para caracterizar funcionalmente macrófagos e neutrófilos fluorescentes dentro de animais intactos. Devido à sua diversa heterogeneidade funcional e papéis em constante expansão na patogênese da doença, os macrófagos receberam atenção significativa. Além das manipulações genéticas, as intervenções químicas são usadas rotineiramente para manipular e examinar o comportamento do macrófago em zebrafish larval. A entrega dessas drogas é tipicamente limitada ao direcionamento passivo de drogas gratuitas através de imersão direta ou microinjeção. Essas abordagens dependem da suposição de que quaisquer alterações no comportamento do macrófago são resultado de um efeito direto da droga nos próprios macrófagos, e não uma consequência a jusante de um efeito direto em outro tipo de célula. Aqui, apresentamos nossos protocolos para direcionar drogas especificamente para macrófagos de zebrafish larval, microinjetando liposós fluorescentes carregados de drogas. Revelamos que liposomos fluorescentes azuis carregados de drogas modificadas por poloxamer 188 são prontamente tomados por macrófagos, e não por neutrófilos. Também fornecemos evidências de que drogas entregues dessa forma podem impactar a atividade do macrófago de forma consistente com o mecanismo de ação da droga. Essa técnica será de valor para os pesquisadores que desejam garantir o direcionamento de medicamentos aos macrófagos e quando as drogas são tóxicas demais para serem entregues por métodos tradicionais como a imersão.

A abordagem de hidratação de filmes finos descrita aqui para a preparação de liposomos fluorescentes que abrigam medicamentos é um método simples e econômico. Com o protocolo utilizado neste estudo, espera-se que os liposósicos sejam unilamellar23,24. O tamanho, o potencial zeta, a eficiência de carga e armadilha dos liposomos produzidos são resumidos na Tabela 1. O tamanho da partícula dos liposomos (antes e depois do carregamento da ...

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Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Aqui, descrevemos a síntese de liposós carregados de drogas e sua microinjeção em zebrafish larval com o propósito de direcionar o fornecimento de drogas para células de linhagem de macrófagos.

Direcionando drogas para macrófagos de zebrafish larval injetando liposós carregados de drogas

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Este protocolo descreve uma técnica para direcionar drogas de interesse para macrófagos de zebrafish larval para manipular e avaliar a função macrófago. Esta técnica tem vantagens sobre as estratégias tradicionais de entrega de medicamentos, como a imersão, garantindo que os medicamentos sejam especificamente direcionados a macrófagos através do encapsulamento lipossomo. Quando aplicada a modelos de zebrafish da doença com componente inflamatório, essa técnica tem o potencial de resolver como macrófagos contribuem para processos patológicos.Aqui, demonstramos a utilidade desta técnica mirando uma droga inibidora de oxigênio mitocondrial-reativa aos macrófagos para suprimir a ativação. A microinjeção de lipossomos carregados de drogas em larvas pode ser desafiadora, pois deve-se tomar cuidado para não causar danos epiteliais excessivos, influenciando potencialmente estudos imunológicos. A demonstração visual deste protocolo é importante porque envolve metodologias farmacológicas e células vivas animais inteiras que podem não ser realizadas rotineiramente em um único laboratório.Para preparar 10 miligramas de lipossomos em um frasco de fundo redondo de 25 mililitros, adicione 31 nanomolars de azul marinho e 300 nanomolars de uma droga mitocondrial-reativa de oxigênio inibidor do frasco. Sonicar brevemente para dissolver completamente, e remover o solvente lentamente em um evaporador rotativo definido sobre um banho de água Celsius de 45 graus a 75 rotações por minuto sob pressão de vácuo. Quando um filme fino lipídio seco se formou dentro das paredes de vidro do frasco, seque ainda mais o filme por 45 minutos sob nitrogênio para facilitar a remoção completa do solvente orgânico.Em seguida, hidrate o filme com um mililitro de PBS, e sele o frasco com filme de parafina antes de agitar o frasco à mão sobre um banho de água de 60 graus Celsius por 20 minutos. Após sete ciclos de congelamento e descongelamento, use uma mini-extrusora e membranas de policarbonato gravadas de um micrômetro para extrusão dos lipossos por dois a seis ciclos. Quando grandes vesículas unilamellar foram obtidas, condensar os lipossomos frescos em uma pelota por ultracentrifugação.Incubar a pelota com um mililitro de solução 1%poloxamer 188 por 30 minutos a 45 graus Celsius e 750 rotações por minuto em um ThermoMixer com um acessório de tubo microcentrifuuge de dois mililitros. Durante a pós inserção do poloxamer 188 nos lipossomos, a concentração correta do poloxamer, o tempo de incubação e a temperatura são importantes para alcançar as características físico-químicas ideais dos lipossomos resultantes. No final da incubação, ultracentrize a mistura novamente sob as mesmas condições centrífugas, e remova o sobrenatante contendo qualquer polímero ou droga não ligada.Em seguida, armazene as pelotas lipossópicas a quatro graus Celsius, protegidas da luz. Para determinar o tamanho e o potencial zeta dos lipossomos, diluir a formulação lipossa com água ultrauso em uma proporção de 1 a 100. Use um analisador dinâmico de dispersão de luz para medir o tamanho das partículas, índice de polidispersidade e potencial de zeta em triplicado a 25 graus Celsius.Para calcular a eficiência da armadilha e o carregamento de drogas dos lipossomos, dissolva os lipossomos em Triton X-100. Injete 20 microliters da amostra de lipossomo dissolvido em um sistema de cromatografia líquida de alta pressão com uma bomba quaternária, um detector de matriz de diodo fixado em 230 nanômetros, e uma coluna de três micrômetros, 250 vezes 4,6 milímetros. Para preparar larvas transgênicas de zebrafish para a injeção, use fórceps de ponta fina para descorionato manualmente 30 horas pós-fertilização embriões, e permitir que os embriões se desenvolvam a 28,5 graus Celsius até dois dias após a fertilização.Quando os embriões chegarem ao estágio apropriado, diluir uma formulação liposa recém-preparada em uma proporção de um para um em PBS estéril, e misturar a solução por dois a três segundos por vórtice. Despeje celulose de 3%de metila suficiente no meio E3 na tampa de uma pequena tampa de prato de cultura de 35 milímetros para formar uma película fina cobrindo toda a superfície. Use uma pipeta de transferência de plástico para coletar uma piscina de aproximadamente 20 a 25 larvas anestesiadas.Deixe os embriões se concentrarem na ponta da pipeta por gravidade, e transfira cuidadosamente as larvas para o meio da tampa de prato de cultura de 35 milímetros com solução mínima. Use um carregador microcapilar para organizar as larvas com seus anteriores em direção ao topo da placa de injeção com a superfície dorsal voltada para a agulha de microinjeção para injeção no ventrículo do cérebro traseiro ou com seus anteriores em direção à esquerda da placa de injeção com as superfícies ventral voltadas para a agulha de microinjeção para injeção no venoso sinusal. Use um carregador microcapilário para encher uma agulha de injeção com aproximadamente cinco microliters da mistura de injeção liposesome.Monte a agulha em um micromanípulo conectado a um suporte magnético e um injetor de pressão, e posicione a configuração sob um microscópio estéreo. Use fórceps limpos e finos para cortar a ponta da agulha de microinjeção para gerar uma abertura de aproximadamente cinco micrômetros de diâmetro. Coloque o injetor em uma duração de pulso de aproximadamente 50 milissegundos e uma pressão de injeção de aproximadamente 40 libras por polegada quadrada.Injete um bolus em uma gota de óleo mineral posicionado sobre as linhas de rede de um hemótmetro para calibrar o volume a ser injetado. Em seguida, ajuste a duração do pulso e/ou a pressão de injeção até que o diâmetro do bolus cubra 2 1/2 das menores linhas de grade. Injete cuidadosamente um nanoliter da mistura de injeção de lipossomo no ventrículo de cérebro traseiro de cada larva.Imediatamente após as injeções, adicione e3 médio à placa de injeção e use uma pipeta de transferência de plástico para agitar suavemente as larvas da celulose de metila. Para visualizar a superfície dorsal do cérebro traseiro em um microscópio confocal equipado com uma lente de imersão de água, primeiro preencha um prato de cultura de 35 milímetros a uma profundidade de cinco milímetros com meio de montagem, e deixe o polimerizar médio. Escavar uma pequena trincheira na área de agarose de área suficiente para acomodar o saco de gema do embrião experimental, e use uma pipeta de transferência de plástico cheia de meio de montagem derretida para coletar uma larva anestesiada.Deposite imediatamente a larva no prato de cultura, e use um carregador microcapilário para orientar o lado ventral do saco de gema para baixo nos orifícios escavados. Mantenha o embrião nesta posição até que a agarose polimerize. Sobreponha o embrião com e3 médio suplementado com 200 microgramas por mililitro de tricaine.Para viver a imagem do ventrículo de cérebro traseiro, selecione o objetivo de 20x e defina o microscópio confocal para 512 por 512 pixels e um zoom de 2,5x. Quando os parâmetros do microscópio tiverem sido definidos, adquira pilhas Z de 40 por três micrômetros que se estendem da superfície dorsal-mais dorsal do cérebro traseiro usando imagens de dois canais para imagem dos lipossomos fluorescentes azuis e macrófagos fluorescentes verdes. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, carregue os arquivos em um programa de software de análise de imagem 3D apropriado.Na guia Medição, arraste o protocolo Encontrar objetos para o espaço Arrastar tarefas aqui para fazer medidas. Selecione o canal DAPI para destacar os lipossomos e arraste a ferramenta Inspecionar através das seções Z para detectar os macrófagos carregados de liposomino. Para quantificar a intensidade de fluorescência dos lipossomos dentro das células individuais, arraste o protocolo Clip To Regions Of Interest para o espaço Drag Tasks Here To Make Measurements, e use a ferramenta Retângulo para desenhar uma caixa em torno da célula de interesse nas dimensões X, Y e Z.Em seguida, selecione Fazer item de medição no menu suspenso de medidas para gerar um arquivo de medição na janela da biblioteca. Nesta tabela, o tamanho, o potencial zeta, o carregamento de drogas e a eficiência da armadilha dos lipossomos produzidos são resumidos. Como observado, o tamanho das partículas dos lipossomos é semelhante com e sem carregamento de drogas, embora a carga superficial de lipossomos carregados de drogas seja ligeiramente mais neutra do que os lipossomos de controle apenas com azul marinho.A microinjeção de lipossomos de rótulo azul marinho no ventrículo de cérebro traseiro, como demonstrado, resulta em uma rápida absorção por macrófagos residentes que podem ser facilmente quantificados por microscopia confocal por três horas após a injeção. Os neutrófilos, no entanto, raramente são observados para conter lipossomos intracelulares. Dentro de macrófagos carregados de liposomos individuais, os lipossomos se acumulam dentro dos compartimentos fagorólises, o que é necessário para a degradação lipossóica e posterior liberação do conteúdo de drogas no citoplasma.A entrega no sus venosus pode entregar os lipossomos para macrófagos hematopoiéticos caudais residentes em tecido através da circulação. A microinjeção de lipossomos carregados com a droga inibidora de oxigênio mitocondrial-reativa no ventrículo de cérebro traseiro pode suprimir significativamente a produção de espécies de oxigênio mitocondrial-reativas movidas a monossódico dentro de macrófagos residentes em cérebros traseiros carregados de liposomos. A validação adicional dos efeitos supressivos de drogas de interesse nos estados de ativação do macrófago pode ser realizada investigando a expressão genética de citocinas proinflammatórias por toda a montagem in situ hibridização e o recrutamento temporal de neutrófilos.Usando esta técnica, conseguimos direcionar drogas para macrófagos para confirmar que um mecanismo imunometabólico impulsiona sua ativação em um modelo de zebrafish larval de inflamação aguda de gouty. Adaptações futuras deste protocolo podem incluir a realização de modificações superficiais do lipossomo para melhorar a segmentação de macrófagos ou promover o direcionamento para outras células imunes, como neutrófilos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Imunologia e Infecção

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...