Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones otorgadas a C.J.H. (Consejo de Investigación de la Salud de Nueva Zelanda y Fondo Marsden, Royal Society of New Zealand) y Z.W. (Faculty Research Development Fund de la Universidad de Auckland). Los autores agradecen a Alhad Mahagaonkar por la gestión experta de las instalaciones de pez cebra, la Unidad de Investigación de Imágenes Biomédicas, la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Auckland por su ayuda con las imágenes confocales y Graham Lieschke por regalar la línea de reporteros Tg(mpeg1:EGFP).

1. Preparación de liposomas con etiqueta azul Marina con carga farmacológica
NOTA: Los liposomas que llevan el tinte fluorescente azul, Marina Blue y el medicamento se preparan utilizando un método de hidratación de película delgada con la inserción posterior del poloxámero 188. Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Los liposomas de control solo llevan marina azul y PBS. El ejemplo aquí describe la carga de liposomas con un f...

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Aquí, hemos proporcionado un protocolo detallado para formular liposomas cargados con fármacos para apuntar específicamente a los macrófagos en peces cebra larvales. Este método se puede utilizar para diseccionar el papel de los macrófagos en ciertos modelos de enfermedades garantizando la administración directa dirigida de medicamentos específicamente a los macrófagos. Además, se puede utilizar cuando la toxicidad general de los medicamentos limita su uso cuando se administra por rutas más convencionales, com...

El sistema de fagocitos mononucleares proporciona una primera línea de defensa contra los patógenos invasores. Este sistema consiste en monocitos, células dendríticas derivadas de monocitos y macrófagos, que profanan activamente patógenos extraños, limitando así la propagación de patógenos. Además de estas funciones de efector fagocítico y microbicida, las células dendríticas y los macrófagos también son capaces de producir citoquinas y antígeno-presentación para activar el sistema inmune adaptativo1. De estas células, los macrófagos han recibido especial atención debido a su diversa heterogeneidad funcional y su implicación en múltiples enfermedades inflamatorias, desde la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas hasta el cáncer2,3,4,5,6,7. La plasticidad de los macrófagos y su capacidad para adaptarse funcionalmente a las necesidades de su entorno tisular requieren enfoques experimentales para observar e interrogar directamente estas células in vivo.
Los peces cebra larvaria son un organismo modelo ideal para estudiar la función y plasticidad de los macrófagos in vivo8. La transparencia óptica del pez cebra larval proporciona una ventana para observar directamente el comportamiento de los macrófagos, especialmente cuando se combina con líneas de reporterotransgénicos que marcan los macrófagos. La explotación del potencial de imagen en vivo y la tractabilidad experimental del pez cebra larval ha dado lugar a muchos conocimientos significativos sobre la función de los macrófagos que tienen relevancia directa para la enfermedad humana9,10,11,12,13,14,15. Muchos de estos estudios también han aprovechado la alta conservación de la actividad farmacológica en el pez cebra (un atributo que sustenta su uso como plataforma entera de descubrimiento de fármacos animales16,17,18), mediante la utilización de intervenciones químicas para manipular farmacológicamente la función de los macrófagos. Hasta la fecha, estos tratamientos farmacológicos se han suministrado en su mayoría ya sea a través de la inmersión, que requiere que el fármaco sea soluble en agua, o mediante la microinyección directa de fármaco libre(Figura 1A). Las limitaciones de estas estrategias de entrega pasiva incluyen efectos fuera del objetivo y toxicidad general que pueden impedir evaluar cualquier impacto en la función de los macrófagos. Además, al investigar los efectos farmacológicos en los macrófagos se desconoce si los fármacos están actuando sobre los propios macrófagos o a través de mecanismos más indirectos. Al realizar estudios de intervención química similares para investigar la función de los macrófagos, reconocimos que había una necesidad insatisfecha de desarrollar un método de administración económico y sencillo para dirigir fármacos específicamente a los macrófagos.
Los liposomas son vesículas bicapas microscópicas, biocompatibles y lipídicas que pueden encapsular proteínas, nucleótidos y carga de fármacos19. La estructura bicapa de lípidos unilamellar o multilamellar de liposomas forma un lumen interno acuoso donde se pueden incorporar fármacos solubles en agua, mientras que los fármacos hidrófobos se pueden integrar en las membranas lipídicas. Además, las propiedades fisicoquímicas de los liposomas, incluyendo el tamaño, la carga y las modificaciones de la superficie se pueden manipular para adaptar su orientación a células específicas20,21. Estas características de los liposomas los han convertido en un vehículo atractivo para suministrar drogas y mejorar la precisión de los regímenes de tratamiento actuales20. Como los liposomas son naturalmente fagocitos por macrófagos (una característica explotada por su uso rutinario en la entrega de clodronato específicamente a macrófagos para experimentos de ablación22), se presentan como una opción atractiva para la administración de fármacos específicos de macrófagos(Figura 1B).
Este protocolo describe la formulación de fármacos en liposomas fluorescentes azules recubiertos con el poloxámero de polímero hidrófilo 188, que forma una capa protectora en la superficie del liposomas y se ha demostrado que mejora la retención de fármacos y tiene una biocompatibilidad superior23. Poloxámero fue elegido para el recubrimiento superficial de liposomas como nuestra investigación anterior había demostrado que, en comparación con los liposomas modificados de polietilenglicol, liposomas modificados de poloxámero mostraron una mejor biocompatibilidad después de la inyección subcutánea de patas de rata y farmacocinética similar en conejos después de la perfusión intravenosa23. También se describen protocolos para su microinyección en peces cebra larvales e imágenes en vivo para evaluar su capacidad de selección de macrófagos y su localización en compartimentos intracelulares necesarios para la degradación de los liposomas y la administración de fármacos citoplasmáticos. Como prueba de concepto hemos utilizado previamente esta técnica para apuntar dos fármacos a los macrófagos para suprimir su activación en un modelo larvario de pez cebra de inflamación aguda de gota24. Esta técnica de administración de fármacos amplía el "kit de herramientas" químico disponible para los investigadores de peces cebra que desean garantizar la meta de los macrófagos de sus fármacos de interés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
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		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Las larvas de pez cebra (Danio rerio) se han convertido en un modelo popular para investigar las interacciones huésped-patógeno y la contribución de las células inmunitarias innatas a la enfermedad inflamatoria debido a su sistema inmunitario innato funcionalmente conservado. También se utilizan ampliamente para examinar cómo las células inmunitarias innatas ayudan a guiar los procesos de desarrollo. Al aprovechar la transparencia óptica y la tractabilidad genética del pez cebra larvaria, estos estudios a menudo se centran en enfoques de imágenes en vivo para caracterizar funcionalmente a los macrófagos y neutrófilos marcados fluorescentemente dentro de los animales intactos. Debido a su diversa heterogeneidad funcional y a su papel en constante expansión en la patogénesis de la enfermedad, los macrófagos han recibido una atención significativa. Además de las manipulaciones genéticas, las intervenciones químicas se utilizan ahora de forma rutinaria para manipular y examinar el comportamiento de los macrófagos en el pez cebra larvario. La administración de estos medicamentos se limita típicamente a la orientación pasiva de drogas libres a través de la inmersión directa o microinyección. Estos enfoques se basan en la suposición de que cualquier cambio en el comportamiento de los macrófagos es el resultado de un efecto directo de la droga en los propios macrófagos, y no una consecuencia posterior de un efecto directo sobre otro tipo de célula. Aquí, presentamos nuestros protocolos para apuntar a medicamentos específicamente a los macrófagos de peces cebra larvarios mediante liposomas fluorescentes cargados de drogas por microinyección. Revelamos que los liposomas fluorescentes azules cargados con drogas modificados por poloxámero s 188 son fácilmente tomados por los macrófagos, y no por los neutrófilos. También proporcionamos evidencia de que los medicamentos entregados de esta manera pueden afectar la actividad de los macrófagos de una manera consistente con el mecanismo de acción de la droga. Esta técnica será de valor para los investigadores que deseen garantizar la orientación de fármacos a los macrófagos y cuando los fármacos son demasiado tóxicos para ser suministrados por métodos tradicionales como la inmersión.

El enfoque de hidratación de película delgada descrito aquí para la preparación de liposomas fluorescentes que encierran fármacos es un método simple y rentable. Con el protocolo utilizado en este estudio, se espera que los liposomas sean unilamellar23,24. El tamaño, el potencial zeta, la carga de fármacos y la eficiencia de atrapamiento de los liposomas producidos se resumen en la Tabla 1. El tamaño de partícula de los liposomas (antes...

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Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Aquí, describimos la síntesis de liposomas cargados de drogas y su microinyección en peces cebra larvales con el propósito de dirigir la administración de fármacos a células de linaje de macrófagos.

Dirigirse a los medicamentos a los macrófagos de peces cebra sellos larvarios mediante la inyección de liposomas con drogas

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Este protocolo describe una técnica para apuntar a fármacos de interés para los macrófagos de peces cebra larvales para manipular y evaluar la función de los macrófagos. Esta técnica tiene ventajas sobre las estrategias tradicionales de administración de fármacos, como la inmersión, asegurando que los fármacos estén dirigidos específicamente a los macrófagos a través de la encapsulación de liposomas. Cuando se aplica a modelos de peces cebra de la enfermedad con un componente inflamatorio, esta técnica tiene el potencial de resolver cómo los macrófagos contribuyen a los procesos patológicos.Aquí, demostramos la utilidad de esta técnica apuntando a un fármaco inhibidor de especies de oxígeno mitocondrial-reactivo a los macrófagos para suprimir la activación. La microinyección de liposomas cargados con drogas en larvas puede ser difícil, ya que se debe tener cuidado de no causar daño epitelial excesivo, lo que puede influir en los estudios inmunológicos. La demostración visual de este protocolo es importante porque implica metodologías farmacológicas y de células vivas de animales enteros que pueden no realizarse rutinariamente en un solo laboratorio.Para preparar 10 miligramos de liposomas en un matraz de fondo redondo de 25 mililitros, agregue 31 nanomolares de azul marino y 300 nanomolares de un fármaco inhibidor de especies de oxígeno mitocondrial-reactivo al matraz. Sonicar brevemente para disolver completamente, y retirar el disolvente lentamente en un evaporador rotatorio sobre un baño de agua Celsius de 45 grados a 75 rotaciones por minuto bajo presión de vacío. Cuando se haya formado una película delgada de lípidos secos dentro de las paredes de vidrio del matraz, seque aún más la película durante 45 minutos bajo nitrógeno para facilitar la eliminación completa del disolvente orgánico.A continuación, hidratar la película con un mililitro de PBS, y sellar el matraz con película de parafina antes de agitar el matraz a mano sobre un baño de agua Celsius de 60 grados durante 20 minutos. Después de siete ciclos de congelación y descongelación, utilice un mini-extrusor y membranas de policarbonato grabado por orugas de un micrómetro para extruir los liposomas durante dos a seis ciclos. Cuando se hayan obtenido grandes vesículas unilamelares, condense los liposomas frescos en un pellet por ultracentrifugación.Incubar el pellet con un mililitro de 1%poloxamer 188 solución durante 30 minutos a 45 grados Celsius y 750 rotaciones por minuto en un ThermoMixer con un accesorio de tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Durante la inserción posterior del poloxámero 188 en los liposomas, la concentración correcta de poloxómeros, el tiempo de incubación y la temperatura son importantes para lograr las características fisicoquímicas óptimas de los liposomas resultantes. Al final de la incubación, ultracentrifríe la mezcla de nuevo en las mismas condiciones de centrífuga, y retire el sobrenadante que contiene cualquier polímero o medicamento sin límites.A continuación, almacene los gránulos liposomas en cuatro grados centígrados, protegidos de la luz. Para determinar el tamaño y el potencial zeta de los liposomas, diluir la formulación de liposomas con agua ultrapura en una proporción de uno a 100. Utilice un analizador de dispersión de luz dinámica para medir el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad y el potencial zeta en triplicado a 25 grados centígrados.Para calcular la eficiencia de atrapamiento y la carga de fármacos de los liposomas, disolver los liposomas en Triton X-100. Inyecte 20 microlitros de la muestra de liposoma disuelto en un sistema de cromatografía líquida de alta presión con una bomba cuaternaria, un detector de matriz de diodos establecido en 230 nanómetros y una columna de tres micrómetros de 250 veces-4,6 milímetros. Para preparar larvas de pez cebra transgénicas para la inyección, utilice fórceps de punta fina para descorionar manualmente 30 horas después de la fertilización, y permitir que los embriones se desarrollen a 28,5 grados centígrados hasta dos días después de la fertilización.Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa adecuada, diluir una formulación de liposoma recién preparada en una proporción de uno a uno en PBS estéril, y mezclar la solución durante dos a tres segundos por vórtice. Vierta suficiente 3%celulosa de metilo en E3 medio en la tapa de una pequeña tapa de 35 milímetros para formar una película delgada que cubra toda la superficie. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para recoger un grupo de aproximadamente 20 a 25 larvas anestesiadas.Permita que los embriones se concentren en la punta de la pipeta por gravedad, y transfiera cuidadosamente las larvas a la mitad de la tapa del plato de cultivo de 35 milímetros con una solución mínima. Utilice un cargador microcapilar para colocar las larvas con sus anteriores hacia la parte superior de la placa de inyección con la superficie dorsal orientada hacia la aguja de microinyección para inyección en el ventrículo del cerebro posterior o con sus anteriores hacia la izquierda de la placa de inyección con las superficies ventrales orientadas hacia la aguja de microinyección para inyección en el venoso sinusal. Utilice un cargador microcapilar para rellenar una aguja de inyección con aproximadamente cinco microlitros de la mezcla de inyección de liposomas.Monte la aguja en un micromaniprulador conectado a un soporte magnético y un inyector de presión, y coloque la configuración bajo un microscopio estéreo. Utilice fórceps limpios y de punta fina para cortar la punta de la aguja de microinyección para generar una abertura de aproximadamente cinco micrómetros de diámetro. Ajuste el inyector a una duración de pulso de aproximadamente 50 milisegundos y una presión de inyección de aproximadamente 40 libras por pulgada cuadrada.Inyecte un bolo en una gota de aceite mineral colocada sobre las líneas de rejilla de un hemocitoómetro para calibrar el volumen que se va a inyectar. A continuación, ajuste la duración del pulso y/o la presión de inyección hasta que el diámetro del bolo cubra 2 1/2 de las líneas de rejilla más pequeñas. Inyecte cuidadosamente un nanolitros de la mezcla de inyección de liposomas en el ventrículo de la hindbra de cada larva.Inmediatamente después de las inyecciones, agregue el medio E3 a la placa de inyección y utilice una pipeta de transferencia de plástico para agitar suavemente las larvas fuera de la celulosa metilo. Para imaginar la superficie dorsal del cerebro trasero en un microscopio confocal equipado con una lente de inmersión en agua, primero llene un plato de cultivo de 35 milímetros a una profundidad de cinco milímetros con medio de montaje, y deje que el medio se polimerice. Excavar una pequeña zanja en la agarosa de área suficiente para acomodar el saco de yema del embrión experimental, y utilizar una pipeta de transferencia de plástico llena de medio de montaje fundido para recoger una larva anestesiada.Deposite inmediatamente la larva en el plato de cultivo, y utilice un cargador microcapilar para orientar el lado ventral del saco de yema hacia abajo en los agujeros excavados. Mantener el embrión en esta posición hasta que la agarosa se polimerice. Superponer el embrión con un medio E3 complementado con 200 microgramos por mililitro de tricaína.Para obtener una imagen en vivo del ventrículo de la hindbra, seleccione el objetivo 20x y establezca el microscopio confocal en 512 por 512 píxeles y un zoom de 2,5x. Cuando se hayan establecido los parámetros del microscopio, adquiera pilas Z de 40 por tres micrómetros que se extienden desde la superficie dorsal del cerebro trasero utilizando imágenes de dos canales para crear imágenes de los liposomas fluorescentes azules y los macrófagos fluorescentes verdes. Una vez obtenidas todas las imágenes, cargue los archivos en un programa de software de análisis de imágenes 3D adecuado.En la pestaña Medición, arrastre el protocolo Buscar objetos al espacio Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones. Seleccione el canal DAPI para resaltar los liposomas y arrastre la herramienta Inspeccionar a través de las secciones Z para detectar los macrófagos cargados de liposomas. Para cuantificar la intensidad de fluorescencia de los liposomas dentro de las celdas individuales, arrastre el protocolo Recortar a regiones de interés al espacio Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones y utilice la herramienta Rectángulo para dibujar un cuadro alrededor de la celda de interés en las dimensiones X, Y y Z.A continuación, seleccione Crear elemento de medición en el menú desplegable Dimensiones para generar un archivo de medición en la ventana de la biblioteca. En esta tabla, se resume el tamaño, el potencial de zeta, la carga de fármacos y la eficiencia de atrapamiento de los liposomas producidos. Como se observó, el tamaño de partícula de los liposomas es similar con y sin carga de drogas, aunque la carga superficial de liposomas cargados con drogas es ligeramente más neutral que los liposomas de control con azul marino solamente.La microinyección de liposomas marinos de etiqueta azul en el ventrículo de la hindbrain, como se ha demostrado, da como resultado una rápida absorción por parte de los macrófagos residentes que se pueden cuantificar fácilmente mediante microscopía confocal por tres horas después de la inyección. Sin embargo, rara vez se observa que los neutrófilos contienen liposomas intracelulares. Dentro de los macrófagos individuales cargados de liposomas, los liposomas se acumulan dentro de los compartimentos fagososomales, que es necesario para la degradación del liposoma y la posterior liberación de contenido farmacológico en el citoplasma.La entrega en el sinusal venoso puede entregar los liposomas a los macrófagos caudales residentes en el tejido hematopoyético a través de la circulación. La microinyección de liposomas cargados con el fármaco inhibidor de las especies de oxígeno mitocondrial-reactivo en el ventrículo de la hindbraína puede suprimir significativamente la producción de especies de oxígeno mitocondrial-reactivas impulsadas por cristal de urato monosódico dentro de los macrófagos residentes en el cerebro trasero liposomas. La validación adicional de los efectos supresores de los fármacos de interés en los estados de activación de macrófagos se puede realizar investigando la expresión génica proinflamatoria de citoquinas mediante la hibridación in situ de todo el monte y el reclutamiento temporal de neutrófilos.Usando esta técnica, hemos sido capaces de dirigir fármacos a los macrófagos para confirmar que un mecanismo inmunometabólico impulsa su activación en un modelo larval de pez cebra de inflamación aguda de gota. Las adaptaciones futuras de este protocolo podrían incluir la modificación de la superficie del liposoma para mejorar la focalización de los macrófagos o para promover la orientación a otras células inmunitarias, como los neutrófilos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Investigación

Inmunología e Infección

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El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

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La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

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Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

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Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

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Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

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Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

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Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...