Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag som beviljats C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) och Z.W. (Faculty Research Development Fund från University of Auckland). Författarna tackar Alhad Mahagaonkar för experthantering av zebrafish anläggningen, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland för hjälp med confocal imaging och Graham Lieschke för gifting Tg (mpeg1: EGFP) reporter linje.

1. Beredning av droglastade Marina Blue-märkta Liposomer
OBS: Liposomer bär den blå fluorescerande färgämne, Marina Blue och läkemedel är beredda med hjälp av en tunn film hydrering metod med post insättning av poloxamer 188. Alla procedurer utförs vid rumstemperatur om inte annat anges. Kontrollera liposomer bär bara Marina blå och PBS. Exemplet här beskriver lastning liposomer med en mitokondria-inriktning antioxidant läkemedel25 som används i representat...

<ol>
	<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Krenkel, O., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+macrophages+in+tissue+homeostasis+and+disease.">Liver macrophages in tissue homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).</li><li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+immunology:+turning+macrophages+on,+off+and+on+again.">Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).</li><li>Lawrence, T., Natoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+macrophage+polarization:+enabling+diversity+with+identity.">Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoresponsive+gene+1+augments+bactericidal+activity+of+macrophage-lineage+cells+by+regulating+beta-oxidation-dependent+mitochondrial+ROS+production.">Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production.</a> Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+fatty+acid-fueled+mROS+production+within+macrophages+alleviates+acute+gouty+inflammation.">Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).</li><li>Cambier, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+manipulate+macrophage+recruitment+through+coordinated+use+of+membrane+lipids.">Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids.</a> Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Madigan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrophage+Response+to+Mycobacterium+leprae+Phenolic+Glycolipid+Initiates+Nerve+Damage+in+Leprosy.">A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy.</a> Cell. 170 (5), 973-985 (2017).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lta4h+locus+modulates+susceptibility+to+mycobacterial+infection+in+zebrafish+and+humans.">The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans.</a> Cell. 140 (5), 717-730 (2010).</li><li>Volkman, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+granuloma+induction+via+interaction+of+a+bacterial+secreted+protein+with+host+epithelium.">Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium.</a> Science. 327 (5964), 466-469 (2010).</li><li>Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+the+future+of+drug+discovery:+in+vivo+chemical+screens+in+zebrafish.">Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish.</a> ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+nanoparticles:+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer.">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers.">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).</li><li>Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stealth+liposomes:+review+of+the+basic+science,+rationale,+and+clinical+applications,+existing+and+potential.">Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential.</a> International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+cells+and+bacterial+infection+in+zebrafish.">Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-insertion+of+poloxamer+188+strengthened+liposomal+membrane+and+reduced+drug+irritancy+and+in+vivo+precipitation,+superior+to+PEGylation.">Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation.</a> Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome-Mediated+Drug+Delivery+in+Larval+Zebrafish+to+Manipulate+Macrophage+Function.">Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function.</a> Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).</li><li>Cader, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C13orf31+(FAMIN)+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function.">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes.">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages:+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification.">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li><li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+zebrafish+leukocytes.">Live cell imaging of zebrafish leukocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rag-Ragulator+Complex+Regulates+Lysosome+Function+and+Phagocytic+Flux+in+Microglia.">The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia.</a> Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+to+macrophages:+role+of+physicochemical+properties+of+particulate+carriers--liposomes+and+microspheres--on+the+phagocytosis+by+macrophages.">Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).</li><li>Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+macrophages+initiating+and+driving+inflammation+in+a+monosodium+urate+monohydrate+crystal-induced+murine+peritoneal+model+of+acute+gout.">Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).</li><li>Faires, J. S., McCarty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+arthritis+in+man+and+dog+after+intrasynovial+injection+of+sodium+urate+crystals.">Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals.</a> Lancet. 280, 682-685 (1962).</li><li>Martin, W. J., Harper, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+inflammation+and+resolution+in+acute+gout.">Innate inflammation and resolution in acute gout.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).</li><li>Fenaroli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+drug+delivery+system+against+tuberculosis+in+zebrafish+embryos:+direct+visualization+and+treatment.">Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment.</a> ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).</li><li>Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Neutrophilic+Inflammation+Using+Polymersome-Mediated+Cellular+Delivery.">Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery.</a> Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li><li>Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+liposomal+drug+delivery+to+monocytes+and+macrophages.">Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).</li><li>Fidler, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+liposomes+to+improve+delivery+of+macrophage-augmenting+agents+to+alveolar+macrophages.">Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages.</a> Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).</li><li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish:+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis.">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li></ol>

Här har vi lämnat ett detaljerat protokoll för att formulera droglastade liposomer för att specifikt rikta makrofager i larv zebrafisk. Denna metod kan användas för att dissekera makrofagers roll i vissa sjukdomsmodeller genom att säkerställa direkt riktad leverans av läkemedel specifikt till makrofager. Dessutom kan det användas när den allmänna toxiciteten av läkemedel begränsar deras användning när de levereras av mer konventionella rutter, som nedsänkning. Protokollet som beskrivs här ger ett altern...

Det mononukleära fagocytsystemet ger en första försvarslinje mot invaderande patogener. Detta system består av monocyter, monocyt-härledda dendritiska celler och makrofager, som aktivt fagocytoze utländska patogener, vilket begränsar patogen spridning. Förutom dessa fagocytiska och mikrobiska effektorfunktioner kan dedritiska celler och makrofager också cytokinproduktion och antigenpresentation aktivera det adaptiva immunsystemet1. Av dessa celler har makrofager fått särskild uppmärksamhet på grund av deras olika funktionella heterogenitet och engagemang i flera inflammatoriska sjukdomar, från autoimmunitet och infektionssjukdomar till cancer2,3,4,5,6,7. Makrofagers plasticitet och deras förmåga att funktionellt anpassa sig till behoven till sin vävnadsmiljö kräver experimentella metoder för att direkt observera och förhöra dessa celler in vivo.
Larval zebrafisk är en idealisk modell organism för att studera funktion och plasticitet makrofager in vivo8. Den optiska genomskinligheten hos larv zebrafisk ger ett fönster för att direkt observera makrofagers beteende, särskilt i kombination med makrofagmärkning transgena reporterlinjer. Utnyttja levande bildbehandling potential och experimentell auttlighet larv zebrafisk har lett till många betydande insikter i makrofag funktion som har direkt relevans för människors sjukdom9,10,11,12,13, 14,15. Många av dessa studier har också dragit nytta av den höga bevarandet av läkemedelsaktivitet i zebrafisk (ett attribut som ligger till grund för deras användning som en hel djurläkemedelsupptäcktplattform16,17,18), genom att använda kemiska interventioner för att farmakologiskt manipulera makrofagfunktion. Hittills har dessa farmakologiska behandlingar mestadels levererats antingen genom nedsänkning, vilket kräver att läkemedlet är vattenlösligt, eller genom direkt mikroinjektion av fritt läkemedel(figur 1A). Begränsningar av dessa passiva leveransstrategier omfattar effekter utanför målet och allmän toxicitet som kan förhindra att man bedömer eventuella effekter på makrofagfunktionen. Dessutom, när man undersöker läkemedelseffekter på makrofager är det okänt om drogerna agerar på makrofager själva eller genom mer indirekta mekanismer. När du utför liknande kemiska interventionsstudier för att undersöka makrofagfunktion, insåg vi att det fanns ett otillfredsställt behov av att utveckla en billig och enkel leveransmetod för att rikta läkemedel specifikt till makrofager.
Liposomer är mikroskopiska, biokompatibla, lipid bilayered blåsor som kan kapsla proteiner, nukleotider och narkotika last19. Unilamellar eller multilamellar lipid bilayer struktur liposomer bildar en vattenlösliga läkemedel kan införlivas medan hydrofoba läkemedel kan integreras i lipidmembranen. Dessutom kan de fysicokemiska egenskaperna hos liposomer, inklusive storlek, laddning och ytmodifieringar manipuleras för att skräddarsy sin inriktning till specifika celler20,21. Dessa funktioner i liposomer har gjort dem till ett attraktivt fordon för att leverera droger och förbättra precisionen i nuvarande behandlingsregimer20. Som liposomer är naturligt fagocytozed av makrofager (en funktion som utnyttjas av deras rutinmässiga användning för att leverera clodronate specifikt till makrofager för ablation experiment22),de presenterar som ett attraktivt alternativ för makrofag-specifika läkemedelsleverans(figur 1B).
Detta protokoll beskriver formuleringen av läkemedel till blå fluorescerande liposomer belagda med hydrofilpolymer poloxamer 188, som bildar ett skyddande lager på liposome ytan och har visat sig förbättra läkemedelsretention och har överlägsen biokompatibilitet23. Poloxamer valdes för ytbeläggning av liposomer som vår tidigare forskning hade visat att, jämfört med polyetenglykol modifierade liposomer, poloxamer modifierade liposomer visade bättre biokompatibilitet efter subkutan injektion av råtttassar och liknande farmakokinetik hos kaniner efter intravenös infusion23. Protokoll beskrivs också för deras mikroinjektion i larv zebrafisk och levande bildbehandling för att bedöma deras makrofag-inriktning förmåga och lokalisering till intracellulära fack som krävs för liposome nedbrytning och cytoplasmatisk läkemedelsleverans. Som ett proof-of-concept har vi tidigare använt denna teknik för att rikta två läkemedel till makrofager för att undertrycka deras aktivering i en larv zebrafisk modell av akut gouty inflammation24. Denna drogleveransteknik utökar den kemiska "verktygslåda" som finns tillgänglig för zebrafiskar forskare som vill säkerställa makrofag-inriktning av sina läkemedel av intresse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Zebrafisk(Danio rerio)larver har utvecklats till en populär modell för att undersöka värdpatogeninteraktioner och bidraget från medfödda immunceller till inflammatorisk sjukdom på grund av deras funktionellt bevarade medfödda immunsystemet. De används också i stor utsträckning för att undersöka hur medfödda immunceller hjälper till att vägleda utvecklingsprocesser. Genom att dra nytta av den optiska transparensen och genetiska tarmkraften hos larv zebrafisk, fokuserar dessa studier ofta på levande bildmetoder för att funktionellt karakterisera fluorescerande märkta makrofager och neutrofiler inom intakta djur. På grund av deras olika funktionella heterogenitet och ständigt växande roller i sjukdomspatogenes, makrofager har fått stor uppmärksamhet. Förutom genetiska manipulationer används nu kemiska ingrepp rutinmässigt för att manipulera och undersöka makrofagbeteende i larvzebrafish. Leverans av dessa läkemedel är vanligtvis begränsad till passiv inriktning på fri drog genom direkt nedsänkning eller mikroinjektion. Dessa tillvägagångssätt bygger på antagandet att alla ändringar av makrofagbeteende är resultatet av en direkt effekt av läkemedlet på makrofager själva, och inte en nedströms konsekvens av en direkt effekt på en annan celltyp. Här presenterar vi våra protokoll för inriktning droger specifikt till larv zebrafisk makrofager genom microinjecting drog-loaded fluorescerande liposomer. Vi avslöjar att poloxamer 188-modifierade droglastade blå fluorescerande liposomer lätt tas upp av makrofager, och inte av neutrofiler. Vi ger också bevis för att läkemedel som levereras på detta sätt kan påverka makrofagaktivitet på ett sätt som är förenligt med mekanismen för läkemedlets verkan. Denna teknik kommer att vara av värde för forskare som vill säkerställa inriktning av läkemedel till makrofager och när läkemedel är för giftiga för att levereras med traditionella metoder som nedsänkning.

Den tunna filmen hydrering strategi som beskrivs här för framställning av fluorescerande liposomer omsluter droger är en enkel och kostnadseffektiv metod. Med det protokoll som används i denna studie, liposomerna förväntas vara unilamellar23,24. Storleken, zeta potential, drog lastning och entrapment effektivitet liposomer som produceras sammanfattas i tabell 1. Partikelstorleken på liposomerna (före och efter läkemedelsbelastning) är ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Här beskriver vi syntesen av narkotikabelastade liposomer och deras mikroinjektion i larv zebrafisk i syfte att rikta läkemedelsleverans till makrofag-härstamning celler.

Inriktning droger till Larval Zebrafish Makrofager genom att injicera narkotika-loaded liposomer

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Detta protokoll beskriver en teknik för inriktning droger av intresse för larval zebrafisk makrofager att manipulera och utvärdera makrofag funktion. Denna teknik har fördelar jämfört med traditionella strategier drug leverans såsom nedsänkning genom att säkerställa att läkemedlen är särskilt riktade till makrofager genom liposom inkapsling. När den appliceras på zebrafiskmodeller av sjukdom med en inflammatorisk komponent har denna teknik potential att lösa hur makrofager bidrar till patologiska processer.Här visar vi nyttan av denna teknik genom att rikta en mitokondriell-reaktiv syre art-hämmande läkemedel till makrofager att undertrycka aktivering. Mikroinjektionen av läkemedelsbelastade liposomer i larver kan vara utmanande, eftersom försiktighet bör vidtas för att inte orsaka överdriven epitelisk skada, potentiellt påverka immunologiska studier. Visuell demonstration av detta protokoll är viktigt eftersom det innebär farmakologiska och hela djur levande cell metoder som inte rutinmässigt utförs i ett enda laboratorium.För att förbereda 10 milligram liposomer i en 25-milliliter rund botten kolv, tillsätt 31 nanomolars av marinblå och 300 nanomolars av en mitokondriell-reaktiv syre art-hämmande läkemedel till kolven. Sonikera kort för att helt lösa upp, och ta bort lösningsmedlet långsamt på en roterande förångare som över en 45-graders Celsius vattenbad på 75 rotationer per minut under vakuumtryck. När en torr lipidtunn film har bildats innanför kolvens glasväggar, torkar du ytterligare filmen i 45 minuter under kväve för att underlätta fullständig borttagning av det organiska lösningsmedlet.Därefter hydrat filmen med en milliliter PBS, och försegla kolven med paraffin film innan agitera kolven för hand över en 60-graders Celsius vattenbad i 20 minuter. Efter sju cykler av frysning och upptining, använd en mini-extruder och en-mikrometer spår-etsade polykarbonat membran för att extrudera liposomer för två till sex cykler. När stora unilamellära vesiklar har erhållits, kondensera de färska liposomerna till en pellet genom ultracentrifugering.Inkubera pelleten med en milliliter på 1%poloxamer 188-lösning i 30 minuter vid 45 grader Celsius och 750 rotationer per minut i en ThermoMixer med en två-milliliter mikrocentrifugrörstillsats. Under inlägget insättning av poloxamer 188 i liposomer, rätt poloxamer koncentration, inkubationstid, och temperatur är viktiga för att uppnå den optimala fysikaliska kemiska egenskaper av den resulterande liposomer. I slutet av inkubationen, ultracentrifug blandningen igen under samma centrifug förhållanden, och ta bort supernatanten som innehåller någon obunden polymer eller läkemedel.Förvara sedan liposompelletsen i fyra grader Celsius, skyddade från ljus. För att bestämma storleken och zeta potentialen hos liposomerna, späd liposomen formuleringen med ultrapure vatten vid en-till-100 förhållande. Använd en dynamisk ljusspridningsanalysator för att mäta partikelstorleken, polydispersitetsindexet och zetapotentialen i tre exemplar vid 25 grader Celsius.För att beräkna entrapment effektivitet och läkemedelsbelastning av liposomer, upplösa liposomer i Triton X-100. Injicera 20 mikroliter av det upplösta liposomprovet i ett högtrycks vätskekromatografisystem med en kvartärpump, en diod array detektor inställd på 230 nanometer, och en tre-mikrometer, 250-gånger-4,6-millimeters kolumn. För att förbereda transgena zebrafisklarver för injektionen, använd finspetstimtips för att manuellt dekorretera 30 timmar efter befruktningsembryon, och låt embryona utvecklas vid 28,5 grader Celsius tills två dagar efter befruktningen.När embryona har nått lämpligt stadium, späd en nyberedda liposomformulering vid ett ett-till-ett-förhållande i steril PBS, och blanda lösningen i två till tre sekunder genom att virvel. Häll tillräckligt 3%metylcellulosa i E3 medium i locket på en liten, 35-millimeters kultur skålen lock för att bilda en tunn film som täcker hela ytan. Använd en plastöverföringspipett för att samla en pool med cirka 20 till 25 sövda larver.Låt embryona koncentrera sig på spetsen av pipetten genom gravitation, och överför noggrant larverna till mitten av 35-millimeters odlingsfatlocket med minimal lösning. Använd en mikrokapillärlastare för att ordna larverna med sina främre mot toppen av injektionsplattan med ryggytan vänd mot mikroinjektionsnålen för injektion i bakhjärnkammaren eller med deras främre mot vänster om injektionsplattan med de ventrala ytorna vända mot mikroinjektionsnålen för injektion i sinus venosus. Använd en mikrokapillärlastare för att backfylla en injektionsnål med cirka fem mikroliter av liposominjektionsmixen.Montera nålen i en mikromanipulator ansluten till ett magnetiskt stativ och en tryckinjektor, och placera uppställningen under ett stereomikroskop. Använd rena, finspets-forceps för att skära av spetsen på mikroinjektionsnålen för att generera en öppning på cirka fem mikrometer i diameter. Ställ in injektorn till en pulsvaraktighet på cirka 50 millisekunder och ett injektionstryck på cirka 40 pund per kvadrattum.Injicera en bolus i en droppe mineralolja placerad över gallerlinjerna i en hemocytometer för att kalibrera den volym som ska injiceras. Justera därefter pulsens längd och/eller insprutningstrycket tills bolusens diameter täcker 2 1/2 av de minsta gallerlinjerna. Injicera försiktigt en nanoliter av liposominjektionsblandningen i hindbrainkammaren hos varje larver.Omedelbart efter injektionerna, tillsätt E3 medium till injektionsplattan, och använd en plastöverföringspipett för att försiktigt agitera larverna ur metylcellulosan. För att avbilda ryggytan av hindbrain på ett konfokalmikroskop utrustat med en vattenimmersionslins fyller du först en 35-millimeters odlingsfat till ett djup av fem millimeter med monteringsmedium och låt mediet polymerisera. Gräv ut ett litet dike i agaros av tillräckligt område för att rymma gulesäcken av det experimentella embryot, och använd en plastöverföringspilett fylld med smält monteringsmedium för att samla en sövd larv.Omedelbart deponera larven i odlingsfatet, och använd en mikrokapillärlastare för att orientera äggsäckens ventrala sida ner i de utgrävda hålen. Underhåll embryot i detta läge tills agarospolymeriserar. Överlagra embryot med E3 medium kompletteras med 200 mikrogram per milliliter trikain.För att leva bild hindbrain ventrikeln, välj 20x objektiv, och ställa confocal mikroskop till 512 med 512 pixlar och en 2,5 x zoom. När mikroskop parametrar har ställts in, förvärva 40-by-tre-mikrometer Z-stackar sträcker sig från dorsala-mest yta av hindbrain med hjälp av två-kanals bildbehandling till bilden de blå fluorescerande liposomer och gröna fluorescerande makrofager. När alla bilder har erhållits, ladda filerna i en lämplig 3D-bild analys program.Under fliken Mått drar du protokollet Sök objekt i dra aktiviteterna här för att göra mått till mellanslag. Markera DAPI-kanalen för att markera liposomerna och dra verktyget Inspektera genom Z-sektionerna för att upptäcka de liposomlastade makrofagerna. Om du vill kvantifiera fluorescensintensiteten hos liposomer i de enskilda cellerna drar du protokollet Clip To Regions Of Interest i dra uppgifter här för att göra mått till mellanslag och använd rektangelverktyget för att rita en ruta runt den cell av intresse i X-, Y- och Z-dimensionerna.Välj sedan Gör mätobjekt på rullgardinsmenyn Mått för att generera en måttfil i biblioteksfönstret. I denna tabell, storlek, zeta potential, drog lastning, och entrapment effektivitet av de producerade liposomer sammanfattas. Som observerats, partikelstorleken på liposomer är liknande med och utan läkemedelsbelastning, även om ytan laddning av drog-laddade liposomer är något mer neutral än kontrollliposomer med marinblå bara.Microinjection av marina blå-märkta liposomer i hindbrain ventrikel, som visats, resulterar i ett snabbt upptag av bosatta makrofager som lätt kan kvantifieras genom confocal mikroskopi genom tre timmar efter injektion. Neutrophils, dock, sällan observeras för att innehålla intracellulära liposomer. Inom enskilda liposom-lastad makrofager, liposomer ackumuleras inom phagolysosomal fack, vilket är nödvändigt för liposom nedbrytning och efterföljande läkemedelsinnehåll release i cytoplasman.Leverans i sinus venosus kan leverera liposomer till caudal hematopoietic vävnad-resident makrofager via cirkulationen. Microinjection av liposomer laddas med mitokondriellt-reaktivt syre art-hämmande läkemedel i hindbrain ventrikel kan avsevärt undertrycka monosodium urate kristall-driven mitokondriellt-reaktivt syre arter produktion inom liposom-lastad hindbrain-resident makrofager. Ytterligare validering av de suppressiva effekterna av läkemedel av intresse på makrofag aktivering stater kan utföras genom att undersöka proinflammatory cytokine genuttryck av hela montera in situ hybridisering och den tidsmässiga rekrytering av neutrofiler.Med hjälp av denna teknik har vi kunnat rikta läkemedel till makrofager för att bekräfta att en immunmetabolisk mekanism driver deras aktivering i en larv zebrafish modell av akut gikty inflammation. Framtida adaptioner av detta protokoll kan inkludera utför ytmodifiering av liposomen för att förbättra makrofag inriktning eller att främja inriktning mot andra immunceller, såsom neutrofiler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humaniserad musmodell för att studera bakterieinfektioner Inriktning mikrovaskulaturen

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Användning av<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Att studera autophagy-Cytoskeleton interaktioner

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Mycket effektiv Transfektion av mänskliga THP-1 makrofager från Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modellering Mucosal candidiasis i larvZebraFish genom Swimbladder Injektion

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomik Profilering av makrofager från 2D elektrofores

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Icke-invasiv avbildning av det medfödda immun Response i en Zebrafish Larv Modell av<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifiering av cytosoliska vs. vakuolär<em&gt; Salmonella</em&gt; I primära makrofager genom Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk karakterisering av makrofager från råttnjure med flödescytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Använda Zebrafish Modeller av mänsklig influensa A-virus infektioner till skärm antivirala läkemedel och karakterisera värdens immuncellsvar

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...