Name: targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Bu çalışma, C.J.H. (Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi ve Marsden Fonu, Yeni Zelanda Kraliyet Cemiyeti) ve Z.W.'ye (Auckland Üniversitesi'nden Fakülte Araştırma Geliştirme Fonu) verilen hibeler ile desteklenmiştir. Yazarlar zebra balığı tesisi uzman yönetimi için Alhad Mahagaonkar teşekkür, Biyomedikal Görüntüleme Araştırma Birimi, Tıp Bilimleri Fakültesi, Auckland Üniversitesi konfokal görüntüleme ve Graham Lieschke ile yardım için Tg hediye için (mpeg1:EGFP) muhabir hattı.

1. İlaç yüklü Marina Mavi etiketli Lipozomların hazırlanması
NOT: Mavi floresan boya, Marina Blue ve ilaç taşıyan lipozomlar poloxamer 188 post ekleme ile ince bir film hidrasyon yöntemi kullanılarak hazırlanır. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Kontrol lipozomları sadece Marina mavisi ve PBS taşır. Buradaki örnekte, lipozomların mitokondri hedefleyen antioksidan ilaç25 ile yüklenmesi, temsili sonuçlarda ku...

<ol>
	<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Krenkel, O., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+macrophages+in+tissue+homeostasis+and+disease.">Liver macrophages in tissue homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).</li><li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+immunology:+turning+macrophages+on,+off+and+on+again.">Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).</li><li>Lawrence, T., Natoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+macrophage+polarization:+enabling+diversity+with+identity.">Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoresponsive+gene+1+augments+bactericidal+activity+of+macrophage-lineage+cells+by+regulating+beta-oxidation-dependent+mitochondrial+ROS+production.">Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production.</a> Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).</li><li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+fatty+acid-fueled+mROS+production+within+macrophages+alleviates+acute+gouty+inflammation.">Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).</li><li>Cambier, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+manipulate+macrophage+recruitment+through+coordinated+use+of+membrane+lipids.">Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids.</a> Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Madigan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrophage+Response+to+Mycobacterium+leprae+Phenolic+Glycolipid+Initiates+Nerve+Damage+in+Leprosy.">A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy.</a> Cell. 170 (5), 973-985 (2017).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lta4h+locus+modulates+susceptibility+to+mycobacterial+infection+in+zebrafish+and+humans.">The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans.</a> Cell. 140 (5), 717-730 (2010).</li><li>Volkman, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+granuloma+induction+via+interaction+of+a+bacterial+secreted+protein+with+host+epithelium.">Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium.</a> Science. 327 (5964), 466-469 (2010).</li><li>Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+the+future+of+drug+discovery:+in+vivo+chemical+screens+in+zebrafish.">Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish.</a> ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+nanoparticles:+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer.">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers.">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).</li><li>Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stealth+liposomes:+review+of+the+basic+science,+rationale,+and+clinical+applications,+existing+and+potential.">Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential.</a> International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+cells+and+bacterial+infection+in+zebrafish.">Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-insertion+of+poloxamer+188+strengthened+liposomal+membrane+and+reduced+drug+irritancy+and+in+vivo+precipitation,+superior+to+PEGylation.">Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation.</a> Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome-Mediated+Drug+Delivery+in+Larval+Zebrafish+to+Manipulate+Macrophage+Function.">Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function.</a> Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).</li><li>Cader, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C13orf31+(FAMIN)+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function.">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes.">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li><li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages:+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification.">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li><li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+zebrafish+leukocytes.">Live cell imaging of zebrafish leukocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rag-Ragulator+Complex+Regulates+Lysosome+Function+and+Phagocytic+Flux+in+Microglia.">The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia.</a> Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+to+macrophages:+role+of+physicochemical+properties+of+particulate+carriers--liposomes+and+microspheres--on+the+phagocytosis+by+macrophages.">Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).</li><li>Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+macrophages+initiating+and+driving+inflammation+in+a+monosodium+urate+monohydrate+crystal-induced+murine+peritoneal+model+of+acute+gout.">Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).</li><li>Faires, J. S., McCarty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+arthritis+in+man+and+dog+after+intrasynovial+injection+of+sodium+urate+crystals.">Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals.</a> Lancet. 280, 682-685 (1962).</li><li>Martin, W. J., Harper, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+inflammation+and+resolution+in+acute+gout.">Innate inflammation and resolution in acute gout.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).</li><li>Fenaroli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+drug+delivery+system+against+tuberculosis+in+zebrafish+embryos:+direct+visualization+and+treatment.">Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment.</a> ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).</li><li>Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Neutrophilic+Inflammation+Using+Polymersome-Mediated+Cellular+Delivery.">Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery.</a> Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li><li>Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+liposomal+drug+delivery+to+monocytes+and+macrophages.">Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).</li><li>Fidler, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+liposomes+to+improve+delivery+of+macrophage-augmenting+agents+to+alveolar+macrophages.">Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages.</a> Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).</li><li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish:+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis.">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li></ol>

Burada, larva zebra balıklarında özellikle makrofajları hedef almak için ilaç yüklü lipozomlar formüle etmek için ayrıntılı bir protokol sağladık. Bu yöntem, özellikle makrofajlara doğrudan hedeflenen ilaç teslimini sağlayarak bazı hastalık modellerinde makrofajların rolünü incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, ilaçların genel toksisitesi daldırma gibi daha geleneksel yollar tarafından teslim edildiğinde kullanımını sınırlar zaman kullanılabilir. Burada açıklanan protokol larva z...

Mononükleer fagosit sistemi işgalci patojenlere karşı ilk savunma hattını sağlar. Bu sistem monositler, monosit türetilmiş dendritik hücreler ve makrofajlardan oluşur, bu da aktif olarak yabancı patojenleri fagositata, böylece patojen yayılımını sınırlandırır. Bu fagositik ve mikrobisidal efektör fonksiyonlarına ek olarak, dendritik hücreler ve makrofajlar da adaptif bağışıklıksisteminietkinleştirmek için sitokin üretimi ve antijen sunumu yeteneğine sahiptir1. Bu hücrelerin, makrofajlar çeşitli fonksiyonel heterojenlik ve birden fazla inflamatuar hastalıklara tutulum nedeniyle özellikle dikkat almış, otoimmünite ve bulaşıcı hastalıklarkanser2,3,4,5,6,7. Makrofajların plastisite ve işlevsel doku ortamına ihtiyaçlarına uyum yeteneği doğrudan gözlemlemek ve vivo bu hücreleri sorgulamak için deneysel yaklaşımlar gerektirir.
Larva zebra balığı, in vivo8'dekimakrofajların işlevini ve plastisitesini incelemek için ideal bir model organizmadır. Larva zebra balığının optik saydamlığı, özellikle makrofaj işaretleme transgenik muhabir çizgileri ile birleştiğinde makrofajların davranışını doğrudan gözlemlemek için bir pencere sağlar. Larva zebra balığının canlı görüntülemepotansiyelinden ve deneysel traktörden yararlanılabilmek, insan hastalığı9,10 ,11,12,13,14,15ile doğrudan ilgisi olan makrofaj fonksiyonuna dair birçok önemli içgörüye yol açmıştır. Bu çalışmaların çoğu da zebra balığı uyuşturucu aktivitesinin yüksek koruma yararlanmış (bir bütün hayvan ilacı keşif platformu olarak kullanımını destekleyen bir özellik16,17,18), farmakolojik makrofaj fonksiyonu işlemek için kimyasal müdahaleler kullanarak. Bugüne kadar, bu farmakolojik tedaviler çoğunlukla daldırma yoluyla teslim edilmiştir, hangi ilacın suda çözünür olmasını gerektirir, ya da serbest ilaç doğrudan mikroenjeksiyon(Şekil 1A). Bu pasif teslimat stratejilerinin sınırlamaları, makrofaj fonksiyonu üzerindeki herhangi bir etkinin değerlendirilmesini engelleyebilecek hedef dışı etkileri ve genel toksisiteyi içerir. Ayrıca, makrofajlar üzerindeki ilaç etkilerini araştırırken ilaçların makrofajlar üzerinde mi yoksa daha dolaylı mekanizmalar aracılığıyla mı hareket ettiğini niçin etkilediği bilinmemektedir. Makrofaj fonksiyonunu araştırmak için benzer kimyasal müdahale çalışmaları yaparken, özellikle makrofajlara yönelik ilaçları hedeflemek için ucuz ve basit bir teslimat yöntemi geliştirme ihtiyacı olduğunu fark ettik.
Lipozomlar mikroskobik, biyouyumlu, proteinleri, nükleotitleri ve ilaç kargosulate olabilir lipid çift katmanlı veziküllervardır 19. Lipozomların unilamellar veya multilamellar lipid çift katmanlı yapısı suda çözünen ilaçların dahil edilebildiği sulu bir iç lümen oluştururken, hidrofobik ilaçlar lipid membranlarına entegre edilebilir. Buna ek olarak, lipozomların fizikokimyasal özellikleri, boyut, yük ve yüzey modifikasyonları da dahil olmak üzere belirli hücrelere kendi hedefleme terzi için manipüle edilebilir20,21. Lipozomların bu özellikleri onları ilaç teslim etmek ve mevcut tedavi rejimleri20hassasiyetini artırmak için cazip bir araç yaptık. Lipozomlar doğal olarak makrofajlar tarafından fagositozlu olduğundan (özellikle ablasyon deneyleri için makrofajlara clodronat tesliminde rutin kullanımları tarafından kullanılan bir özellik22), makrofajlara özgü ilaç dağıtımı için cazip bir seçenek olarak sunarlar (Şekil 1B).
Bu protokol, hidrofilik polimer poloxamer 188 ile kaplanmış mavi floresan lipozomlar içine ilaçların formülasyonu açıklar, bu lipozom yüzeyinde koruyucu bir tabaka oluşturur ve ilaç tutma geliştirmek için gösterilmiştir ve üstün biyouyumlulukvar 23. Poloxamer, önceki araştırmalarımızda polietilen glikol modifiye lipozomlarla karşılaştırıldığında, poloksamer modifiye lipozomların, intravenöz infüzyonu takiben tavşanlarda sıçan pençelerinin ve benzeri farmakokinetiklerin deri altı enjeksiyonu sonrasında daha iyi biyouyumluluk gösterdiğini gösterdiği gibi lipozomların yüzey kaplaması için seçilmiştir23. Protokoller ayrıca larva zebra balığına mikroenjeksiyon ve canlı görüntüleme ile makrofaj hedefleme yeteneklerini ve lipozom yıkımı ve sitoplazmik ilaç teslimatı için gerekli hücre içi kompartmanlara lokalizasyonlarını değerlendirmek için tanımlanmıştır. Bir kanıtı-of-kavram olarak daha önce akut gut iltihabı bir larva zebrabalığı modelinde aktivasyon bastırmak için makrofajlar için iki ilaç hedef için bu tekniği kullandık24. Bu ilaç dağıtım tekniği, ilgi çekici ilaçların makrofaj hedefleme sağlamak isteyen zebra balığı araştırmacıları için mevcut kimyasal "araç" genişletir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850355P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850367P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;m Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1311B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate microinjection needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>203-776-0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4053-6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eyelash manipulator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>BS.748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>441474J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 series HPLC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L12492</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M12652</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0387-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTEMPO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0737</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Take care when handling, toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipette</td>
			<td>Medi&#39;Ray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poloxamer 188</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instruments</td>
			<td>MPPI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi, Flawil, Switzerland</td>
			<td>B&#252;chi R-215 Rotavapor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus FV1000 FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FB-11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting drugs to larval zebrafish macrophages by injecting drug-loaded liposomes

Zebra balığı(Danio rerio)larvaları, konak-patojen etkileşimlerini ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel olarak korunmuş doğuştan gelen bağışıklık sistemi nedeniyle inflamatuar hastalıklara olan katkısını araştırmak için popüler bir model haline gelmiştir. Onlar da yaygın olarak nasıl doğuştan bağışıklık hücreleri gelişimsel süreçleri rehberlik yardımcı incelemek için kullanılır. Larva zebra balıklarının optik saydamlığı ndan ve genetik yollabilirliğinden yararlanarak, bu çalışmalar genellikle bozulmamış hayvanlarda floresan olarak işaretlenmiş makrofajları ve nötrofilleri işlevsel olarak karakterize etmek için canlı görüntüleme yaklaşımlarına odaklanmıştır. Çeşitli fonksiyonel heterojenlikleri ve hastalık patogenezinde sürekli genişleyen rolleri nedeniyle makrofajlar büyük ilgi gördü. Genetik manipülasyonlara ek olarak, larva zebra balıklarında makrofaj davranışını manipüle etmek ve incelemek için kimyasal müdahaleler de rutin olarak kullanılmaktadır. Bu ilaçların teslimi genellikle doğrudan daldırma veya mikroenjeksiyon yoluyla serbest ilaç pasif hedefleme ile sınırlıdır. Bu yaklaşımlar makrofaj davranışıherhangi bir değişiklik makrofajlar kendileri üzerinde ilacın doğrudan bir etkisi sonucu olduğu varsayımına dayanır, ve başka bir hücre tipi üzerinde doğrudan bir etkisi bir downstream sonucu değil. Burada, ilaç yüklü floresan lipozomları mikroenjekte ederek özellikle larva zebra balığı makrofajlarına yönelik ilaç hedefleme protokollerimizi sıyoruz. Poloxamer 188 modifiye edilmiş uyuşturucu yüklü mavi floresan lipozomların nötrofiller tarafından değil, makrofajlar tarafından kolayca ele alındığını ortaya koyuyoruz. Ayrıca, bu şekilde teslim edilen ilaçların makrofaj aktivitesini ilacın etki mekanizmasına uygun bir şekilde etkilayabileceğine dair kanıtlar salıyoruz. Bu teknik, ilaçların makrofajlara hedef olmasını sağlamak isteyen ve ilaçların daldırma gibi geleneksel yöntemlerle teslim edilemeyecek kadar toksik olduğu araştırmacılar için değerli olacaktır.

Floresan lipozomların hazırlanmasında açıklanan ince film hidrasyon yaklaşımı basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu çalışmada kullanılan protokol ile lipozomların unilamellar23,24olması beklenmektedir. Üretilen lipozomların büyüklüğü, zeta potansiyeli, ilaç yüklemesi ve tuzak etkinliği Tablo 1'deözetlenmiştir. Lipozomların partikül boyutu (ilaç yüklemesinden önce ve sonra) benzerdir(Tablo 1). ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes at JoVE.com

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Burada, makrofaj-soy hücrelerine ilaç dağıtımını hedeflemek amacıyla ilaç yüklü lipozomların ve bunların mikroenjeksiyonunun larva zebra balığına sentezini anlatıyoruz.

Uyuşturucu Yüklü Lipozomenjekte ederek Larva Zebra balığı Makrofajlarına Yönelik İlaçların Hedeflenmesi

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Bu protokol, makrofaj fonksiyonunu manipüle etmek ve değerlendirmek için larva zebra balığı makrofajlarını ilgilendiren ilaçları hedefleyen bir tekniği açıklamaktadır. Bu teknik, ilaçların özellikle lipozom kapsülleme yoluyla makrofajlara yönelik olmasını sağlayarak geleneksel ilaç dağıtım stratejilerine göre avantajlıdır. İnflamatuar bir bileşene sahip zebra balığı modellerine uygulandığında, bu teknik makrofajların patolojik süreçlere nasıl katkıda bulunduğunu çözme potansiyeline sahiptir.Burada, aktivasyonu bastırmak için makrofajlara mitokondriyal-reaktif oksijen türlerini inhibe eden bir ilacı hedef leyerek bu tekniğin yararını gösteriyoruz. Larvaiçine ilaç yüklü lipozomların mikroenjeksiyonu zor olabilir, çünkü aşırı epitel hasarına yol açmamaya özen gösterilmiştir, bu da immünolojik çalışmaları etkileme potansiyeline neden olabilir. Bu protokolün görsel gösterimi önemlidir, çünkü tek bir laboratuvarda rutin olarak yapılmayan farmakolojik ve tüm hayvan canlı hücre metodolojilerini içerir.25 mililitrelik yuvarlak alt şişede 10 miligram lipozom hazırlamak için, 31 deniz mavisi nanomolar ve şişeye 300 nanomolar bir mitokondriyal-reaktif oksijen türü inhibe edici ilaç ekleyin. Tam olarak çözünmek için kısa bir süre sonicate ve vakum basıncı altında dakikada 75 rotasyonlar 45 derece santigrat su banyosu üzerinde ayarlanmış bir döner buharlaştırıcı yavaş yavaş çözücü kaldırın. Şişenin cam duvarları içinde kuru bir lipid ince film oluştuğunda, organik çözücünün tamamen çıkarılmasını kolaylaştırmak için filmi azot altında 45 dakika daha fazla kurutun.Daha sonra, filmi bir mililitre PBS ile nemlendirin ve şişeyi 60 derecelik santigrat su banyosunda 20 dakika boyunca elle çalkalamadan önce şişeyi parafin filmle kapatın. Donma ve erime yedi döngüsonra, iki ila altı döngü için lipozomlar ekstrüzyon için bir mini ekstrüzyon ve bir mikrometre parça kazınmış polikarbonat membranlar kullanın. Büyük unilamellar veziküller elde edildiğinde, ultracentrifugation tarafından bir pelet içine taze lipozomlar yoğunlaştırmak.Peleti bir mililitre 1%poloxamer 188 çözeltisi ile 45 santigrat derecede 30 dakika ve iki mililitrelik mikrosentrifüj tüp ekine sahip bir ThermoMixer'da dakikada 750 dönüşle inkübedin. Lipozomlar içine poloxamer 188 post ekleme sırasında, doğru poloxamer konsantrasyonu, kuluçka süresi, ve sıcaklık ortaya çıkan lipozomların optimal fizikokimyasal özellikleri elde etmek için önemlidir. Kuluçka sonunda, ultracentrifuge karışımı tekrar aynı santrifüj koşulları altında, ve herhangi bir sınırsız polimer veya ilaç içeren supernatant kaldırın.Sonra ışıktan korunan, dört santigrat derece lipozom pelet saklayın. Lipozomların boyutunu ve zeta potansiyelini belirlemek için lipozom formülasyonuna ultra saf su ile bir-100 oranında seyreltin. Parçacık boyutunu, çok dağılım indeksini ve 25 santigrat derecede triplicate'deki zeta potansiyelini ölçmek için dinamik bir ışık saçılımı çözümleyicisi kullanın.Tuzak verimliliğini ve lipozomların ilaç yüklemesini hesaplamak için Triton X-100'deki lipozomları çözün. Çözünmüş lipozom numunesinin 20 mikrolitresini, kuaterner pompa, 230 nanometre de ayarlanmış bir diyot dizi dedektörü ve üç mikrometre, 250-4,6 milimetrelik bir kolon ile yüksek basınçlı sıvı kromatografi sistemine enjekte edin. Enjeksiyon için transgenik zebra balığı larvaları hazırlamak için, döllenme sonrası 30 saat embriyoları elle dechorionate ve embriyoların iki gün sonra döllenme sonrası kadar 28,5 santigrat derecede gelişmesini sağlamak için ince uçlu forsepskullanın.Embriyolar uygun aşamaya ulaştığında, steril PBS'de bire bir oranında yeni hazırlanmış lipozom formülasyonu seyreltin ve girdap yaparak çözeltiyi 2-3 saniye karıştırın. Tüm yüzeyi kaplayan ince bir film oluşturmak için küçük, 35 milimetrelik kültür çanak kapağının kapağına E3 ortamında yeterli %3 metil selüloz dökün. Yaklaşık 20-25 anestezi larvaları bir havuz toplamak için plastik transfer pipet kullanın.Embriyoların ağırlık olarak pipetin ucunda konsantre olmasını bekleyin ve larvaları en az çözeltiyle 35 milimetrelik kültür kapağının ortasına dikkatlice aktarın. Arka beyin ventriküliçine enjeksiyon için mikroenjeksiyon iğnesi doğru bakan dorsal yüzeyi ile enjeksiyon plakasının üst doğru onların ön leri ile larvadüzenlemek için bir mikrokapiller yükleyici kullanın veya sinüs venöz içine enjeksiyon için mikroenjeksiyon iğne doğru bakan vevant yüzeyleri ile enjeksiyon plakasının soluna doğru ön leri ile. Lipozom enjeksiyon karışımı yaklaşık beş mikrolitre ile geri bir enjeksiyon iğnedoldurmak için bir mikrocapiller yükleyici kullanın.İğneyi manyetik bir standa ve basınç enjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin ve kurulumu stereo mikroskop altında yerleştirin. Çapı yaklaşık beş mikrometrelik bir açıklık oluşturmak için mikroenjeksiyon iğneucu kesmek için temiz, ince uçlu forceps kullanın. Enjektörü yaklaşık 50 milisaniyelik bir darbe süresine ve inç kare başına yaklaşık 40 pound'luk bir enjeksiyon basıncına ayarlayın.Enjekte edilecek hacmi kalibre etmek için bir hemositometrenin ızgara hatları üzerinde konumlandırılmış mineral yağ bir damla içine bir bolus enjekte. Daha sonra nabız süresini ve/veya enjeksiyon basıncını bolus çapı en küçük ızgara hatlarının 2 1/2'sini kaplayana kadar ayarlayın. Lipozom enjeksiyon karışımından bir nanolitresini her larvanın arka beyin ventrikülüne dikkatlice enjekte edin.Enjeksiyonları hemen takiben, enjeksiyon plakasına E3 orta ekleyin ve larvaları metil selülozdan hafifçe çıkarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın. Bir su daldırma lens ile donatılmış bir konfokal mikroskop üzerinde arka beynin sırt yüzeyini görüntülemek için, ilk montaj ortamı ile beş milimetre lik bir derinliğe kadar 35 milimetrelik bir kültür çanak doldurun ve orta polimerize sağlar. Deneysel embriyonun yumurta kesesini yerleştirmek için yeterli alanın agarose küçük bir siper kazmak ve bir anestezi larva toplamak için erimiş montaj ortamı ile dolu plastik bir transfer pipet kullanın.Hemen kültür çanak içine larva mevduat ve kazılmış delikler içine yolk kese ventral tarafı yönlendirmek için bir mikrokapiller yükleyici kullanın. Agarose polimerize olana kadar embriyoyu bu pozisyonda koruyun. E3 orta ile embriyo bindirme triain mililitre başına 200 mikrogram ile takviye.Görüntüyü canlı olarak arka beyin ventrikülünü canlı olarak seçin ve konfokal mikroskobu 512 piksel ve 2,5 x yakınlaştırmaya ayarlayın. Mikroskop parametreleri ayarlandığında, mavi floresan lipozomları ve yeşil floresan makrofajları görüntülemek için iki kanallı görüntüleme kullanarak arka beynin en fazla yüzeyinden uzanan 40'a üç mikrometrelik Z-yığınları edinin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, dosyaları uygun bir 3D görüntü analizi yazılımı programına yükleyin.Ölçüm sekmesialtında, Ölçümler alanını açmak için Nesneleri Bul protokolünü Burada Sürükle Görevleri'ne sürükleyin. Lipozomları vurgulamak için DAPI kanalını seçin ve lipozom yüklü makrofajları algılamak için Inspect aracını Z bölümleri ne kadar sürükleyin. Tek tek hücrelerdeki lipozomların floresan yoğunluğunu ölçmek için, Ölçüleri Ölçme Alanı'na Çekmek Için İlgi Alanları protokolüne Klibi sürükleyin ve X, Y ve Z boyutlarındaki ilgi hücresinin etrafına bir kutu çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın.Ardından, kitaplık penceresinde bir ölçüm dosyası oluşturmak için Ölçümler açılır menüsünden Ölçüm Öğesi Oluştur'u seçin. Bu tabloda üretilen lipozomların büyüklüğü, zeta potansiyeli, ilaç yüklemesi ve tuzak etkinliği özetlenmiştir. Görüldüğü gibi, lipozomların partikül boyutu ilaç yüklemesi ile benzer ve ilaç yüklemeolmadan, ilaç yüklü lipozomların yüzey yükü sadece deniz mavisi kontrol lipozomlarından biraz daha nötr olmasına rağmen.Arka beyin ventrikül içine deniz mavi etiketli lipozomların mikroenjeksiyon, gösterildiği gibi, kolayca konfokal mikroskopi ile üç saat sonra enjeksiyon sonrası ölçülebilir yerleşik makrofajlar tarafından hızlı bir alım ile sonuçlanır. Nötrofiller, ancak, nadiren hücre içi lipozomlar içeren gözlenmiştir. Bireysel lipozom yüklü makrofajlar içinde, lipozomlar fagolysomal kompartmanlar içinde birikir, hangi lipozom bozulması ve sitoplazma içine sonraki ilaç içeriği serbest bırakılması için gereklidir.Sinüs venöz içine teslim dolaşım yoluyla kaudal hematopoetik doku yerleşik makrofajlar için lipozomlar teslim edebilirsiniz. Mitokondriyal-reaktif oksijen türlerini inhibe eden ilaçla arka beyin ventriküle yüklenen lipozomların mikroenjeksiyonu, lipozom yüklü hindbrain-resident makrofajlar içinde monosodyum ürat kristal güdümlü mitokondriyal-reaktif oksijen türlerinin üretimini önemli ölçüde baskılayabilir. Makrofaj aktivasyon durumları üzerinde ilgi ilaçların bastırıcı etkileri nin daha fazla doğrulama yerinde hibridizasyon ve nötrofillerin zamansal işe bütün montaj tarafından proinflamatuar sitokin gen ekspresyonu araştırArak yapılabilir.Bu tekniği kullanarak, bir immünometabolik mekanizmanın akut gut iltihabı larva zebrabalığı modelinde aktivasyonlarını yönlendirdiğini doğrulamak için ilaçları makrofajlara yöneltebildik. Bu protokolün gelecekteki uyarlamaları, makrofaj hedeflemesini geliştirmek veya nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücrelerine hedeflemeyi teşvik etmek için lipozomun yüzey modifikasyonunun yapılmasını içerebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...