Name: obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للمخابرات الخاصة بالدعم المالي (ANR Sysa).

1. افتعال ميكروبييتس
ملاحظه: هنا ، الماصات الدقيقة ذات القطر الداخلي تتراوح بين 6 إلى 12 ميكرومتر وطول تفتق حول 3-4 مم ضرورية. ويرد وصف لطريقه مفصله لتصنيع الماصات المجهرية في ما يلي.
<ol><li>ضع الشعرية الزجاجية البورسيليكات في قضيب الساحب وأصلح أحد الطرفين بشد مقبض الباب.</li>
	<li>ال...

<ol>
	<li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids.">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li><li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+vesicles.">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li><li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+vesicles+from+block+copolymers.">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li><li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+polymer/lipid+vesicles:+state+of+the+art+and+future+perspectives.">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li><li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Hybrid+Lipid/Polymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform.">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li><li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles.">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li><li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes.">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li><li>Rodr&#237;guez-Garc&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability.">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods.">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li><li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes.">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li><li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes.">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer/lipid+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs).">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li><li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+lipid+bilayers:+theory+and+possible+experiments.">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs)+does+not+systematically+lead+to+&amp;#34;intermediate''+membrane+properties.">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &amp;#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li><li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L&#945;+and+L&#945;-Gel+Coexistence+Regimes.">Material Studies of Lipid Vesicles in the L&#945; and L&#945;-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li><li>Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).</li><li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles:+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae,+but+with+mechanical+stability+and+control.">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li><li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes.">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li><li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+behavior+of+membranes+with+sterols.">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li><li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity,+Stability,+and+Area/Molecule:&#8201;+A+Micropipet+Aspiration+Approach.">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:&#8201; A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li><li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity.">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li></ol>

ان طلاء الماصات المجهرية هو أحد النقاط الرئيسية للحصول علي قياسات موثوقه. يجب منع التصاق الحويصلة بالماصة ، ويشيع استخدام الطلاء في الأدب17،18،19،20،21، مع جيش صرب الجمهورية ، β-الكازين أو surfasil. ونادرا م?...

الحويصلات العملاقة التي تم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية (الدهنية) وقد استخدمت علي نطاق واسع منذ 1970s كنموذج غشاء الخلية الاساسيه1. في أواخر 1990s ، التي تم الحصول عليها من التجميع الذاتي من البوليمرات النحاسية ، اسمه بوليميرسوميس في اشاره إلى نظيره الدهون2،3، ظهرت بسرعة كبديل مثيره للاهتمام للدهنيات التي تمتلك الاستقرار الميكانيكية ضعيفه والفقراء وظائف الكيميائية وحدات. ومع ذلك ، فان الطابع الحيوي للخلية الخاصة بهم محدوده بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية لان الاخيره تتكون من الدهون الفوسفاتية ، المكون الرئيسي لغشاء الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان نفاذيه غشاء منخفضه يمكن ان يكون مشكله في بعض التطبيقات مثل تسليم المخدرات حيث الانتشار الخاضع للرقابة من الأنواع من خلال الغشاء مطلوب. في الاونه الاخيره ، كانت جمعيه الفوسفورية مع كتله البوليمرات لتصميم الهجينة البوليمر الدهون الحويصلات والاغشيه موضوعا لعدد متزايد من الدراسات4،5. الفكرة الرئيسية هي لتصميم الكيانات التي تازر الجمع بين فوائد كل مكون (الوظائف الحيوية ونفاذيه الطبقات الدهنية مع الاستقرار الميكانيكي وبراعة الكيميائية من اغشيه البوليمر) ، والتي يمكن استغلالها في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والتعرف علي الجزيئات الحيوية داخل الخلايا البيولوجية للتشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير المجهرية مستوحاه من بيو-/نانوسوتوريس.
في الأيام الحالية ، المجتمعات العلمية المختلفة (الكيمياء الحيوية ، الكيميائيين ، الصيدلة البيولوجية ، الفيزيائية الكيميائية ، علماء الاحياء) لديها اهتمام متزايد في تطوير نموذج غشاء الخلية أكثر تقدما. هنا ، هدفنا هو تقديم ، علي النحو المفصل بقدر الإمكان ، المنهجيات الموجودة (الكهرباء ، شفط الماصات الدقيقة) للحصول علي وتوصيف الخواص الميكانيكية للحويصلات العملاقة ونماذج غشاء الخلية "المتقدمة" الاخيره التي هي الهجين البوليمر الدهون العملاقة حويصلات4
والغرض من هذه الأساليب هو الحصول علي قياس موثوق بها للضغط المنطقة والانحناء بلتيير من الغشاء ، فضلا عن الإجهاد تحلل وسلاله. واحده من التقنيات الأكثر شيوعا الموجودة لقياس صلابة الانحناء من حويصلة عملاقه هو تذبذب تحليل6،7، استنادا إلى مراقبه المجهر الفيديو المباشر ؛ ولكن هذا يتطلب تذبذبا كبيرا في الغشاء المرئي ، ولا يتم الحصول عليه بشكل منتظم علي الاغشيه السميكة (مثل بوليميرسوميس). يمكن تحديد معامل الانضغاط المنطقة بالتجربة باستخدام تقنيه لانموير بلودغيت ولكن في معظم الأحيان علي أحادي الطبقة8. تسمح تقنيه شفط الماصات المجهرية بقياس كل من التحوير علي طبقه ثنائيه تشكل الحويصلة الاحاديه العملاقة (GUV) في تجربه واحده.
الطريقة التالية مناسبه لجميع الجزيئات البرمائية أو الجزيئات قادره علي تشكيل الطبقات الثنائية ، التالي ، حويصلات بالكهرباء. وهذا يتطلب طابعا سائلا من الطبقة الثنائية عند درجه حرارة الكهرباء.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required equipment and materials for micropipette design</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filament installed</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>NARISHGE Co.</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>fitted with two objectives (10x and 32x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for coating pipette tips with BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 10 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>626616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 5 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable acetate cellulose filter</td>
			<td>Cluzeau Info Labo</td>
			<td>L5003SPA</td>
			<td>Pore size: 0.22&#181;m, diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies.</td>
			<td>TSP530660</td>
			<td>Inner Diameter 536&#181;m, Outer Diameter 660&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 500 &#181;L luer Lock GASTIGHT</td>
			<td>Hamilton Syringe Company</td>
			<td>1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rotatory mixer</td>
			<td>Labinco</td>
			<td>28210109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulation Set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damped Optical Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>used as support of microscope to prevent external vibrations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP 2</td>
			<td>The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Mitutoyo Corporation</td>
			<td>350-354-10</td>
			<td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass water reservoir (100 ml)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for sucrose and amphiphile solution preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810146C</td>
			<td>Rhodamine tagged lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroformation set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L glass capillary ringcaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9600110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H Grease</td>
			<td>Apiezon</td>
			<td>Apiezon H Grease</td>
			<td>Silicon-free grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide coated glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>703184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN2138R1</td>
			<td>0.8 x 38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohmmeter (Multimeter)</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>VC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28676.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

ويمكن استغلال الحويصلات العملاقة التي يتم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية والبوليمرات في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والاعتراف بالجزيئات الحيوية في التشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير مفاعلات مجهريه/نانو. في جميع هذه التطبيقات ، وتوصيف خصائص غشاء لها اهميه أساسيه. ومن بين تقنيات التوصيف الحالية ، فان طموح الماصة المجهرية ، الذي كان رائدا من قبل e. ايفانز ، يسمح بقياس الخواص الميكانيكية لغشاء مثل معامل انضغاط المنطقة ، ومعامل الانحناء ، والإجهاد تحلل والسلالة. هنا ، نقدم جميع المنهجيات والإجراءات التفصيلية للحصول علي حويصلات عملاقه من الغشاء الرقيق للدهون أو البوليمرات (أو كليهما) ، والتصنيع والمعالجة السطحية من الماصات الدقيقة ، والاجراء الطموح الذي يؤدي إلى قياس جميع المعلمات المذكورة سابقا.

مع البروتوكول المذكور أعلاه ، وقد درسنا مختلفه الاصطناعية العملاقة اونياميلار الحويصلة (GUV) ، التي تم الحصول عليها من فوسفورية: 2-oleoyl-1-بالميتويل--سغليرو-3-فوسفونوكولين (popc) ، بوليمر ثلاثي الكتل: بولي (ايثيلالأكسيد)-ب-بولي (ديميثيلسيلاوكسان)-بي-بولي (ايثي...

Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

والهدف من البروتوكول هو قياس الخواص الميكانيكية الغشائية للحويصلات العملاقة بشكل موثوق من خلال شفط الماصة المجهرية.

امتصاص الحويصلات الهجينة العملاقة أحاديه الجانب بالكهرباء وقياس خواصها الميكانيكية من خلال شفط الماصات المجهرية

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

يسهل هذا البروتوكول قياس موثوق به للخصائص الميكانيكية للغشاء من الدهنية البوليمر الاصطناعية وحقيقية باستخدام تقنية التطلع ميكروريبيت. هذه هي التقنية الوحيدة التي تسمح لمرونة الغشاء وعدم الاستقرار أن تمتد لتقييمها في تجارب واحدة. يتضمن هذا البروتوكول سلسلة من الإجراءات من إعداد الـ"إنس" إلى التقييم الميكانيكي.من المهم جدا أن نكون صبورين وأن نحل أي قضايا تقنية عند ظهورها. التصور على هذه التقنيات أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية التعامل بشكل صحيح السطح الشعري وكيفية تنفيذ خطوة ما قبل الإجهاد الإلزامي. تظهر في الـ(فِيزل) بدون عيوبوسوف يكون الإجراء التظاهر مارتن Fauquignon، وهو طالب دكتوراه من المختبر تعمل على تطوير الدهون البوليمر الهجين vesicles. قبل البدء في الإجراء مكان الزجاج البارد micropipette الشعيرات الدموية عموديا في أصحاب. وخفض أصحاب حتى يتم غمر النصائح في الطازجة المعدة الجلوكوز بوفين مصل الألبومين حل بين عشية وضحاها.بحلول صباح اليوم التالي كان يجب أن يرتفع الحل حوالي سنتيمتر واحد في النصائح عن طريق عمل الشعيرات الدموية. باستخدام حقنة زجاجية 500 ميكرولترر، مجهزة الشعرية السيليكا تنصهر مرنة، ملء كل ماصة مع محلول الجلوكوز. ثم الطامح الحل من كل ماصة، قبل إعادة ملء الماصات مع محلول الجلوكوز الطازجة عدة مرات حتى كل من المصل كما تم إزالتها.لإعداد غرفة التشكيل الكهربائي، أولاً تنظيف الشرائح ITO مع المذيبات العضوية المناسبة، وتحديد السطح موصل مع Ohmeter. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية على الجانب موصل من كل شريحة مع شريط لاصق. تراجع واحد الشعيرات الدموية في حل ampivial حتى حوالي 5 microliters من الحل وقد تم جمعها من قبل عمل الشعرية.ضع الشعيرات الدموية المحملة في اتصال مع مركز لوحة ITO زجاجية واحدة والانتشار بلطف الحل عبر الشريحة. عندما تبخر المذيب تماما، وتطبيق الحل مرتين أكثر كما أظهرت للتو. قبل إضافة طبقة من الشحوم خالية من السيليكون على جانبي فتح س حلقة الفضاء حول منطقة الترسيب.المقبل، وضع الوجه موصل من لوحة زجاجية الثاني ITO على الجزء العلوي من الفضاء، ووضع غرفة الكهربائية تحت فراغ لمدة 3 ساعات لإزالة أي آثار من المذيبات العضوية. بالنسبة للتشهّد الكهربائي للـ "فيسيكلات يونيميللار العملاقة"، قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية بالمولد. تعيين تردد مولد إلى 10 هيرتز، والسعة إلى 2 فولت، الذروة إلى الذروة.عندما تم تعيين الجهد، واستخدام حقنة مجهزة بإبرة قطر داخلي 0.8 ملليمتر لحقن ملليلتر واحد من محلول السكروز الضرس 0.1 في الغرفة، وترك الغرفة تحت الجهد المطبق والتردد لمدة 75 دقيقة. في نهاية التشكيل الكهربائي، قم بإيقاف تشغيل المولد. واستخدام حقنة ملليلتر واحد لpirate حجم صغير من الحل حتى يتم إنتاج فقاعة الهواء داخل الغرفة.إمالة الغرفة قليلا لنقل الفقاعة إلى الغرفة، ومساعدة الفُيْيْسَر على الانفصال عن سطح الشريحة. و استلهم حجم المحلّل بالكامل في المحاقن ثم، نقل حل الفينة إلى أنبوب بلاستيكي ملليلتر واحد.لإعداد المواد لmicromanipulation، الطامح لخلق تدفق المياه، وخزان من المياه النقية، إلى حامل واحد. والاستفادة بخفة في حين رفع خزان للقضاء على أي فقاعات الهواء، وخلق ضغط إيجابي. املأ الشعيرات الدموية المغلفة بالمصل بمحلول الجلوكوز الطازج حتى تتشكل قطرة عند الطرف.إزالة أنابيب حقنة من حامل معدني لخلق تدفق المياه طفيفة في نهاية الحامل، وتحويل شعري رأسا على عقب لتوصيل انخفاض الجلوكوز إلى تدفق المياه. ثم، المسمار الشعرية وحامل معا. لوضع ماصة، الغراء اثنين من الشرائح الزجاجية من مرحلة الألومنيوم حسب الطلب جنبا إلى جنب مع الشحوم فراغ.وتثبيت الشرائح على مرحلة المجهر. باستخدام ماصة ملليلتر واحد، تشكل الغضروف المفصلي بين الشرائح اثنين مع 0.1 جلوكوز الضرس. ضع الماصة وحاملها على وحدة المحرك في المايكرومانبولاتور.تشديد مقبض الباب، واستخدام عصا التحكم في وضع خشنة. خفض micropipette بالقرب من الغضروف المفصلي الجلوكوز. استخدم وضع الغرامة لضبط موضع الطرف إلى مركز الغضروف المفصلي.غمر التلميح في الجلوكوز لتنظيف أسطحه الخارجية والداخلية. بعد بضع دقائق، سحب الشعيرات الدموية من الغضروف المفصلي واستبدال الجلوكوز مع الغضروف المفصلي الطازج. التعرق اثنين من microliters من Vesicles Unilamellar العملاقة في 0.1 السكروز الضرس, في 20 ملليلتر تلميح micropipette.أدخل الـ(فِيَسِكِس) في الغضروف المفصلي استخدام المجهر لمراقبة الحويصلات في الجزء السفلي من غرفة الشريحة. عندما يتم انكماش الفُرَض قليلاً، يُعاد إدخال ماصة الشفط، والتركيز على طرف الماصات.ثم تعيين ارتفاع خط الأساس من خزان المياه إلى الضغط الذي يتم إيقاف حركة الجسيمات. تحيط الغضروف المفصلي مع الزيوت المعدنية لمنع التبخر. لتنفيذ تجربة طموح ميكروبيبيت، قم بخفض طرف الماصات في الغضروف المفصلي.إنشاء كمية صغيرة من ضغط الشفط لpirspirate في إنحدار. وينبغي أن غشاء من vesicle مختارة تتذبذب قليلا وينبغي أن لا تقدم أي عيوب مرئية. استخدام micromanipulator لرفع الماصات إلى مستوى أعلى لعزل vesicle يستنشق من الاحياء الأخرى.خفض خزان المياه إلى ما يقرب من 10 سنتيمترات لprestress في vesicle قبل رفع الخزان للعودة الضغط إلى القيمة الأولية. من ارتفاع 0.5 سم ، تقلل ببطء ضغط الشفط حتى يتم الوصول إلى الضغط الذي يتقلب الغشاء. ثم زيادة الضغط لتصور واضح لسان في الطرف، وطول الإسقاط من ميكرون قليلة.لتحديد معامل الانحناء، وزيادة ضغط الشفط، ميكرومتر واحد في وقت واحد بطريقة تدريجية. حتى يتم الوصول إلى 0.5 إلى 0.8 milliNewtons لكل متر. الانتظار خمس ثوان، وأخذ لقطة من اللسان بعد كل خطوة.لتحديد المنطقة معامل الضغط، والتوتر والإجهاد المستمر لزيادة ضغط الشفط من 0.5 milliNewtons لكل متر حتى يتم التوصل إلى التوتر تمزق. في هذه التجربة التمثيلية كانت معامل الضغط في المنطقة وسلالة التحلل لـ POPC متفقة تمامًا مع ما هو متوقع من المؤلفات. في هذا الجدول يمكن ملاحظة القيم النموذجية للبوليمرات التي تم الحصول عليها.لاحظ أن صلابة الغشاء التي تم الحصول عليها من ثنائي لوك copolymers هو أكبر بكثير من تلك التي تم الحصول عليها من copolymer تريبلوك. ومن المثير للاهتمام, باستخدام كوبوليمر diblock, فمن الممكن الحصول على العملاق الهجين Unilamilar الدهون البوليمر Vesicles التي تثبت صلابة أكثر قوة من تلك التي تقاس للليبوسومات. يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدًا لقياس الفُنية مع ماصة، على سبيل المثال، لقياس نفاذية الغشاء من خلال الصدمة الجسدية.تأكد من إكمال كل خطوة بدقة ودقة، خاصة عند إعداد اتصال تريبيون. وقد تم استغلال هذه التقنية لفهم الأصل المادي للغشاء الانشطار، من خلال قياس التوتر الخطي على الحدود الرئيسية في حويصلات معدلة.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Fabricating Nanogaps by Nanoskiving

افتعال Nanogaps بواسطة Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

تشكيل الهياكل الجزيئية البيولوجية أمرت قبل التجميع الذاتي من الببتيدات قصير

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

توليف غير موحد العلاقات العامة مخدر SrTiO<sub&gt; 3</sub&gt; سيراميك وخصائص الحرارية منها

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

توليف وتوصيف مخدر الحديد ألومينوسيليكات الأنابيب النانوية مع خصائص موصل الكترون المحسن

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

قياس توزيع حجم الجسيمات في عكر حلول كتبها الإنارة الديناميكي التشتت المجهر

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

تيو<sub&gt; 2</sub&gt; المغلفة زجاج مجوف الجزئي مع خصائص Superhydrophobic العالية والأشعة تحت الحمراء للانعكاس تجميعي بطريقة لينة الكيمياء

This manuscript proposes a soft-chemistry method to develop superhydrophobic and highly IR-reflective hollow glass microspheres (HGM). The anatase TiO2 ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

تصنيع واختبار الحرارة الضوئية

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

إعداد وتوصيف ج60/Graphene الهجين النانو

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

غشاء يعيد البناء من حويصلات العملاقة في استجابة للتدرجات أيون الكالسيوم مترجمة

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

مقدر ألياف الاراميد كوبوليمر قوة عالية لتمكين تحديد خواصها الميكانيكية

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...