Name: obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Forfatterne anerkender taknemmeligt ANR for finansiel støtte (ANR sysa).

1. fabrikbearbejdning af Mikropipetter
Bemærk: her er der behov for Mikropipetter med en indvendig diameter på mellem 6 og 12 μm og en tilspidsning på omkring 3-4 mm. En detaljeret metode til fremstilling af mikropipette er beskrevet i det følgende.
<ol><li>Placer borosilikat glasset kapillar i trækstangen af pulleren og fastgør en af enderne ved at stramme knappen.</li>
	<li>Skub forsigtigt glasset gennem hullerne ved siden af varmekammeret.</li>
	<li>Stram spændegrebet i den anden ...

<ol>
	<li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids.">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li><li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+vesicles.">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li><li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+vesicles+from+block+copolymers.">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li><li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+polymer/lipid+vesicles:+state+of+the+art+and+future+perspectives.">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li><li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Hybrid+Lipid/Polymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform.">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li><li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles.">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li><li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes.">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li><li>Rodr&#237;guez-Garc&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability.">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods.">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li><li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes.">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li><li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes.">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer/lipid+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs).">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li><li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+lipid+bilayers:+theory+and+possible+experiments.">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs)+does+not+systematically+lead+to+&amp;#34;intermediate''+membrane+properties.">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &amp;#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li><li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L&#945;+and+L&#945;-Gel+Coexistence+Regimes.">Material Studies of Lipid Vesicles in the L&#945; and L&#945;-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li><li>Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).</li><li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles:+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae,+but+with+mechanical+stability+and+control.">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li><li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes.">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li><li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+behavior+of+membranes+with+sterols.">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li><li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity,+Stability,+and+Area/Molecule:&#8201;+A+Micropipet+Aspiration+Approach.">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:&#8201; A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li><li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity.">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li></ol>

Belægningen af mikropipetten er et af de vigtigste punkter for at opnå pålidelige målinger. Adhæsion af vesikel til mikropipetten skal forhindres, og en belægning er almindeligt anvendt i litteratur17,18,19,20,21, med BSA, β-Casein eller surfasil. Detaljer om belægningen procedure er sjældent nævnt.
Opløsningen af BSA ska...

Gigantiske vesikler opnået fra phospholipider (Liposomer) har været meget anvendt siden 1970 ' erne som den grundlæggende celle membran model1. I slutningen af 1990 'erne,vesikulære morfologier opnået fra den selv-samling af Copolymerer, kaldes polymersomer med henvisning til deres lipid analoger2,3, hurtigtdukkede op som et interessant alternativ til Liposomer, der besidder svag mekanisk stabilitet og dårlig modulære kemiske funktionalitet. Men, deres celle biomimetic karakter er temmelig begrænset i forhold til Liposomer da sidstnævnte er sammensat af phospholipider, den vigtigste komponent i cellemembranen. Desuden kan deres lave membran permeabilitet være et problem i nogle applikationer som lægemiddel levering, hvor kontrolleret diffusion af arter gennem membranen er påkrævet. For nylig har sammenslutningen af phospholipid'er med blok copolymere til at designe hybrid polymer-lipid vesikler og membraner været genstand for et stigende antal undersøgelser4,5. Hovedidéen er at designe enheder, der synergistisk kombinerer fordelene ved hver komponent (Bio-funktionalitet og permeabilitet af lipid-dobbeltlag med mekanisk stabilitet og kemisk alsidighed af polymer membraner), som kan udnyttes i forskellige anvendelser: kontrolleret og målrettet lægemiddel levering, biomolekulær genkendelse inden for biosensorer til diagnosticering, funktionelle membraner til kunstige celler, udvikling af bio-inspirerede mikro-/nano-Reactors.
I dag, forskellige videnskabelige samfund (biokemikere, kemikere, biophysicister, fysisk-kemikere, biologer) har stigende interesse i udvikling af en mere avanceret celle membran model. Her er vores mål at præsentere, så detaljeret som muligt, eksisterende metoder (elektro dannelse, mikropipette aspiration) for at opnå og karakterisere de mekaniske egenskaber af gigantiske vesikler og de seneste "avancerede" celle membran modeller, der er hybrid polymer lipid gigantiske vesikler4,5.
Formålet med disse metoder er at opnå pålidelig måling af områdets kompressionsevne og bøjning moduli af membranen samt deres lysis stress og stamme. En af de mest almindelige teknikker, der findes til at måle bøjning stivhed af en kæmpe vesikelprotein er udsvings analyse6,7, baseret på direkte video mikroskop observation; men dette kræver store synlige membran udsving, og er ikke systematisk opnået på tykke membraner (f. eks. polymersomer). Område Komprimerbar modulus kan eksperimentelt bestemmes ved hjælp af Langmuir Blodgett teknik, men oftest på en enkeltlags8. Den mikropipette aspiration teknik gør det muligt at måle begge moduli på en tolags danner Giant af vesikelprotein (GUV) i et eksperiment.
Følgende metode er hensigtsmæssig for alle amfifilic molekyler eller makromolekyle, der kan danne dobbeltlag og dermed vesikler ved elektro dannelse. Dette kræver en flydende karakter af den tolags ved temperaturen af elektro dannelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required equipment and materials for micropipette design</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filament installed</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>NARISHGE Co.</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>fitted with two objectives (10x and 32x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for coating pipette tips with BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 10 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>626616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 5 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable acetate cellulose filter</td>
			<td>Cluzeau Info Labo</td>
			<td>L5003SPA</td>
			<td>Pore size: 0.22&#181;m, diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies.</td>
			<td>TSP530660</td>
			<td>Inner Diameter 536&#181;m, Outer Diameter 660&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 500 &#181;L luer Lock GASTIGHT</td>
			<td>Hamilton Syringe Company</td>
			<td>1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rotatory mixer</td>
			<td>Labinco</td>
			<td>28210109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulation Set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damped Optical Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>used as support of microscope to prevent external vibrations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP 2</td>
			<td>The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Mitutoyo Corporation</td>
			<td>350-354-10</td>
			<td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass water reservoir (100 ml)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for sucrose and amphiphile solution preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810146C</td>
			<td>Rhodamine tagged lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroformation set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L glass capillary ringcaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9600110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H Grease</td>
			<td>Apiezon</td>
			<td>Apiezon H Grease</td>
			<td>Silicon-free grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide coated glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>703184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN2138R1</td>
			<td>0.8 x 38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohmmeter (Multimeter)</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>VC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28676.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

Gigantiske vesikler fra phospholipider og copolymere kan udnyttes i forskellige anvendelser: kontrolleret og målrettet lægemiddel levering, biomolekulær genkendelse inden for biosensorer til diagnosticering, funktionelle membraner til kunstige celler og udvikling af bioinspirerede mikro/nano-reaktorer. I alle disse applikationer er karakteriseringen af deres membran egenskaber af fundamental betydning. Blandt eksisterende karakterisering teknikker, mikropipette aspiration, pioneret af E. Evans, gør det muligt at måle mekaniske egenskaber af membranen såsom område komprimerbarhed modulus, bøjning modulus og lysis stress og stamme. Her præsenterer vi alle de metoder og detaljerede procedurer for at opnå gigantiske vesikler fra den tynde film af en lipid eller copolymer (eller begge), fremstilling og overfladebehandling af Mikropipetter, og aspiration procedure, der fører til måling af alle de parametre, der tidligere er nævnt.

Med protokollen førnævnte, har vi studeret forskellige syntetiske gigant af vesikelprotein (GUV), opnået fra en phospholipid: 2-oleoyl-1-Palmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholin (popc), en triblokcopolymer copolymer: poly (ethyleneoxid)-b-poly (dimethylsiloxan)-b-poly (ethyleneoxid) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) syntetiseret i et tidligere studie13, og en diblok copolymer poly (dimethylsiloxan)...

Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Målet med protokollen er at pålideligt måle membran mekaniske egenskaber af gigantiske vesikler ved mikropipette aspiration.

Obtention af gigantiske Unilamellar hybrid vesikler ved elektro dannelse og måling af deres mekaniske egenskaber ved mikropipette aspiration

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Denne protokol letter en pålidelig måling af membranen mekaniske egenskaber af syntetiske og reelle polymer lipid vesicle ved hjælp af en mikropipette aspiration teknik. Dette er den eneste teknik, der gør det muligt at vurdere membranfleksibilitet og ustabilitet i enkelte eksperimenter. Denne protokol omfatter en række procedurer fra vesicle forberedelse til den mekaniske vurdering.Det er meget vigtigt at være tålmodig og at løse eventuelle tekniske problemer, efterhånden som de opstår. Visualisering på disse teknikker er afgørende for at forstå, hvordan man korrekt behandle kapillær overflade og hvordan man udfører den obligatoriske prestress trin. Viser op vesicle uden fejl.Demonstrere procedure vil være Martin Fauquignon, en ph.d.-studerende fra laboratoriet arbejder på udvikling af hybrid polymer lipid vesicles. Før proceduren påbegyndes, skal der sættes koldt glas mikropipettekapillærer lodret ind i holdere. Og sænk indehaverne, indtil spidserne er nedsænket i frisklavet glukose kvæg serum albumin opløsning natten over.Næste morgen skulle opløsningen være steget cirka en centimeter ned i spidserne ved hjælp af kapillær handling. Ved hjælp af en 500 mikroliterglassprøjte, der er udstyret med en fleksibel sammensmeltet silicakapillær, fyldes hver pipette med glukoseopløsningen. Derefter aspirere opløsningen fra hver pipette, før pipetter med frisk glukoseopløsning genopfyldes flere gange, indtil alt serum er fjernet.For at forberede et elektroformationskammer skal du først rengøre ITO-objektglas med et passende organisk opløsningsmiddel og identificere den ledende overflade med et Ohmeter. Fastgør elektriske ledninger på den ledende side af hvert dias med tape. Dyp en kapillær i ampivial opløsning, indtil omkring 5 mikroliter af opløsningen er blevet indsamlet ved kapillær handling.Sæt den indlæste kapillær i kontakt med midten af en ITO-glasplade, og fordel forsigtigt opløsningen over rutsjebanen. Når opløsningsmidlet er helt fordampet, påføres opløsningen to gange mere som blot påvist. før der tilsættes et lag siliciumfrit fedt på begge sider af den åbnede O-ring afstandsuder omkring det område af aflejring.Dernæst placere ledende ansigt af en anden ITO glasplade på toppen af afstandsuddeleren, og placere elektroformationskammeret under vakuum i 3 timer for at fjerne eventuelle spor af organisk opløsningsmiddel. Til elektroformation af Giant Unilamellar Vesicles skal du sætte de elektriske ledninger i generatoren. Indstil generatorfrekvensen til 10 Hertz, og amplituden til 2 Volts, peak to peak.Når spændingen er indstillet, skal du bruge en sprøjte udstyret med en 0,8 millimeter indre diameter nål til at injicere en milliliter 0,1 molar saccharose opløsning i kammeret, og lad kammeret under den anvendte spænding og frekvens i 75 minutter. Sluk for generatoren, når elektroformationen er. Og brug den ene milliliter sprøjte til at aspirere en lille mængde opløsning, indtil en luftboble er produceret inde i kammeret.Vip kammeret en smule for at flytte boblen ind i kammeret og for at hjælpe vesiklerne med at løsne sig fra glidefladen. Og aspirere hele opløsningsmængden ind i sprøjten. Derefter overføres vesicle opløsningen til en milliliter plastrør.For at opsætte materialer til mikromanipulation, aspirere for at skabe en vandgennemstrømning, en tank af rent vand, til en holder. Og tryk let, mens du hæver tanken for at eliminere eventuelle luftbobler og for at skabe positivt tryk. Fyld en serumbelagt kapillær med frisk glukoseopløsning, indtil der dannes en dråbe på spidsen.Fjern sprøjteslangen fra metalholderen for at skabe en let vandgennemstrømning for enden af holderen, og vend kapillæren på hovedet for at forbinde glukosefaldet til vandstrømmen. Skru derefter kapillæren og holderen sammen. For at placere pipetten skal du lime to glasdias fra en skræddersyet aluminiumsfase sammen med vakuumfedt.Og installere dias på et mikroskop fase. Ved hjælp af en en milliliter pipette, danne en menisk mellem de to dias med 0,1 kindtand glukose. Anbring pipetten og dens holder på mikromanipulatorens motorenhed.Stram fastspændingsknappen, og brug betjeningspanelets joystick i grov tilstand. Sænk mikropipetten nær glukose menisken. Brug den fine tilstand til at justere spidsens position til midten af menisken.Nedsænk spidsen i glukose for at rense dens ydre og indre overflader. Efter et par minutter, trække kapillær fra menisken og erstatte glukose med en frisk menisk. Aspirere to mikroliter af Giant Unilamellar Vesicles i 0,1 molar saccharose, i en 20 milliliter mikropipette spids.Indfør vesiklerne i menisken. Brug mikroskopet til at observere vesicles i bunden af diaskammeret. Når vesiklerne er lidt deflateret, skal du sætte sugepipetten i igen og fokusere på spidsen af pipetten.Indstil derefter vandbeholderens basishøjde til det tryk, hvor partiklernes bevægelse stoppes. Omgræns menisken med mineralsk olie for at forhindre fordampning. For at udføre en mikropipette aspiration eksperiment, sænke pipette spidsen ind i menisken.Opret en lille mængde sugetryk for at aspirere en vesicle. Membranen i den valgte vesikel skal svinge en smule og bør ikke fremstøde nogen synlige defekter. Brug mikromanipulatoren til at hæve pipetten til et højere niveau for at isolere den indsugnings vesicle fra andre vesikler.Sænk vandtanken til ca. 10 centimeter for at forstresse vesiclen, før du hæver tanken for at returnere trykket til den oprindelige værdi. Fra en højde på 0,5 centimeter, langsomt mindske sugetrykket, indtil et tryk, hvor membranen svinger er nået. Derefter øge trykket for klart at visualisere en tunge i spidsen, projektionen længden af et par mikron.For at bestemme bøjning modulus, øge sugetrykket, en mikrometer ad gangen i en trinvis måde. Indtil 0,5 til 0,8 milliNewtons per meter er nået. Venter fem sekunder, og tage et øjebliksbillede af tungen efter hvert trin.For at bestemme området kompressibilitet modulus, og lysis spænding og stamme fortsætte med at øge sugetrykket fra 0,5 milliNewtons per meter, indtil brudspændingen er nået. I dette repræsentative eksperiment var området kompressibilitetsmodulus og lysisstamme for POPC i perfekt overensstemmelse med det, der forventes af litteraturen. I denne tabel kan typiske værdier for de opnåede polymerer overholdes.Bemærk, at sejheden af membranen fra diblock copolymers er langt større end dem, der opnås fra triblock copolymer. Interessant, ved hjælp af diblock copolymer, er det muligt at opnå en Giant Hybrid Unilamilar Lipid Polymer Vesicles, der viser en mere robust sejhed end den målte for liposomer. Denne protokol kan være nyttig til måling af vesicle med en pipette, for eksempel, at måle permeabilitet af membranen gennem asmatisk chok.Sørg for at fuldføre hvert trin med stringens og præcision, især når du konfigurerer tribuneforbindelsen. Denne teknik er blevet udnyttet til at forstå den fysiske oprindelse af membrans fission, gennem måling af linjespænding ved de vigtigste grænser i modificerede vesikler.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Fabricating Nanogaps by Nanoskiving

Bearbejdning Nanogaps ved Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse af Bestilte Biomolekylær Strukturer af Self-samling af korte peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Syntese af uensartet Pr-doteret SrTiO<sub&gt; 3</sub&gt; Keramik og deres Termoelektrisk Properties

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Syntese og karakterisering af Fe-doteret aluminiumsilicat nanorør med Enhanced Electron ledende egenskaber

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Måling af Particle Size Distribution i uklare Solutions af Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -overtrukne Hollow glasmikrokugler med superhydrofobe og høj IR-reflekterende egenskaber syntetiseres ved en Soft-kemi Metode

This manuscript proposes a soft-chemistry method to develop superhydrophobic and highly IR-reflective hollow glass microspheres (HGM). The anatase TiO2 ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Fabrikation og afprøvning af fotoniske termometre

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Forberedelse og karakterisering af C60/Graphene Hybrid nanostrukturer

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membran remodellering af gigantiske vesikler i svar til lokaliserede Calcium Ion forløb

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Udrede højstyrke Copolymer Aramid fibre til bestemmelse af mekaniske egenskaber

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...