Name: obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

De auteurs erkennen de ANR voor financiële steun (ANR Sysa) dankbaar.

1. fabricating micropipetten
Let op: hier zijn micropipetten met een inwendige diameter variërend van 6 tot 12 μm en een conus lengte rond 3-4 mm noodzakelijk. Een gedetailleerde methode voor het vervaardigen van micropipetten wordt hieronder beschreven.
<ol><li>Plaats het boor silicaatglas capillair in de dissel van de trekker en bevestig een van de uiteinden door de knop aan te spannen.</li>
	<li>Schuif het glas voorzichtig door de openingen aan de zijkant van de verwarmingskamer.</li>
	...

<ol>
	<li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids.">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li><li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+vesicles.">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li><li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+vesicles+from+block+copolymers.">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li><li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+polymer/lipid+vesicles:+state+of+the+art+and+future+perspectives.">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li><li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Hybrid+Lipid/Polymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform.">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li><li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles.">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li><li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes.">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li><li>Rodr&#237;guez-Garc&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability.">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods.">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li><li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes.">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li><li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes.">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer/lipid+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs).">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li><li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+lipid+bilayers:+theory+and+possible+experiments.">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs)+does+not+systematically+lead+to+&amp;#34;intermediate''+membrane+properties.">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &amp;#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li><li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L&#945;+and+L&#945;-Gel+Coexistence+Regimes.">Material Studies of Lipid Vesicles in the L&#945; and L&#945;-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li><li>Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).</li><li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles:+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae,+but+with+mechanical+stability+and+control.">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li><li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes.">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li><li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+behavior+of+membranes+with+sterols.">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li><li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity,+Stability,+and+Area/Molecule:&#8201;+A+Micropipet+Aspiration+Approach.">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:&#8201; A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li><li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity.">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li></ol>

De coating van de micro Pipet is een van de belangrijkste punten voor het verkrijgen van betrouwbare metingen. Hechting van het blaasje aan de micro pipet moet worden voorkomen, en een coating wordt vaak gebruikt in de literatuur17,18,19,20,21, met BSA, β-caseïne of surfasil. Details van de coating procedure worden zelden genoemd.
<p class="jove_content"...

Reuzen blaasjes verkregen uit fosfolipiden (liposomen) zijn op grote schaal gebruikt sinds de jaren 1970 als basis celmembraan model1. In de late jaren negentig, vesiculaire morfologieën verkregen uit de zelf-assemblage van copolymeren, genaamd polymersomes in verwijzing naar hun lipide analogen2,3, snel verscheen als een interessant alternatief voor liposomen die zwakke mechanische stabiliteit en slechte modulaire chemische functionaliteit bezitten. Echter, hun cel biomimetische karakter is vrij beperkt in vergelijking met liposomen, omdat de laatste zijn samengesteld uit fosfolipiden, de belangrijkste component van de celmembraan. Bovendien, hun lage membraan permeabiliteit kan een probleem in sommige toepassingen zoals drug delivery waar gecontroleerde verspreiding van soorten door het membraan is vereist. Onlangs, de vereniging van fosfolipiden met blok copolymeren voor het ontwerpen van hybride polymeer-lipide blaasjes en membranen is het onderwerp geweest van een toenemend aantal studies4,5. Het belangrijkste idee is om entiteiten te ontwerpen die synergetisch de voordelen van elk onderdeel combineren (bio-functionaliteit en permeabiliteit van lipide-bilayers met de mechanische stabiliteit en chemische veelzijdigheid van polymeer membranen), die kunnen worden uitgebuit in verschillende toepassingen: gecontroleerde en gerichte drug delivery, biomoleculaire erkenning binnen biosensoren voor diagnose, functionele membranen voor kunstmatige cellen, ontwikkeling van bio-geïnspireerde micro-/nano-reactors.
Tegenwoordig hebben verschillende wetenschappelijke gemeenschappen (biochemici, chemici, biophysicisten, fysico-chemici, biologen) steeds meer belangstelling voor de ontwikkeling van een geavanceerder celmembraan model. Hier, ons doel is om te presenteren, zo gedetailleerd mogelijk, bestaande methodologieën (elektro vorming, micropipet aspiratie) om te verkrijgen en karakteriseren van de mechanische eigenschappen van gigantische blaasjes en de recente "geavanceerde" celmembraan modellen die hybride polymeer lipide reus blaasjes4,5.
Het doel van deze methoden is om betrouwbare meting van het gebied Comprimeer baarheid en buig moduli van het membraan, evenals hun lysis stress en spanning te verkrijgen. Een van de meest gebruikte technieken voor het meten van buigstijfheid van een reusachtig blaasje is fluctuatie analyse6,7, gebaseerd op directe video-Microscoop observatie; maar dit vereist een grote zichtbare membraan fluctuatie, en wordt niet systematisch verkregen op dikke membranen (bv. polymersomes). Area samendrukbaarheids modulus kan experimenteel worden bepaald met behulp van de Langmuir Blodgett techniek, maar meestal op een monolaag8. De micropipet aspiratie techniek maakt de meting van beide moduli op een dubbellaagvormende reus unilamellaire blaasje (guv) in één experiment mogelijk.
De volgende methode is geschikt voor alle amfifiele moleculen of macromoleculen die bilayers kunnen vormen en, bijgevolg, blaasjes door elektro vorming. Dit vereist een vloeiend karakter van de dubbellaagte bij de temperatuur van elektro vorming.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required equipment and materials for micropipette design</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filament installed</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>NARISHGE Co.</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>fitted with two objectives (10x and 32x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for coating pipette tips with BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 10 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>626616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 5 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable acetate cellulose filter</td>
			<td>Cluzeau Info Labo</td>
			<td>L5003SPA</td>
			<td>Pore size: 0.22&#181;m, diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies.</td>
			<td>TSP530660</td>
			<td>Inner Diameter 536&#181;m, Outer Diameter 660&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 500 &#181;L luer Lock GASTIGHT</td>
			<td>Hamilton Syringe Company</td>
			<td>1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rotatory mixer</td>
			<td>Labinco</td>
			<td>28210109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulation Set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damped Optical Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>used as support of microscope to prevent external vibrations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP 2</td>
			<td>The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Mitutoyo Corporation</td>
			<td>350-354-10</td>
			<td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass water reservoir (100 ml)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for sucrose and amphiphile solution preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810146C</td>
			<td>Rhodamine tagged lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroformation set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L glass capillary ringcaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9600110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H Grease</td>
			<td>Apiezon</td>
			<td>Apiezon H Grease</td>
			<td>Silicon-free grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide coated glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>703184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN2138R1</td>
			<td>0.8 x 38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohmmeter (Multimeter)</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>VC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28676.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

Reuzen blaasjes verkregen uit fosfolipiden en copolymeren kunnen worden uitgebuit in verschillende toepassingen: gecontroleerde en gerichte levering van geneesmiddelen, biomoleculaire herkenning binnen biosensoren voor diagnose, functionele membranen voor kunstmatige cellen, en ontwikkeling van biogeïnspireerde micro/nano-reactoren. In al deze toepassingen is de karakterisering van hun membraan eigenschappen van fundamenteel belang. Onder bestaande karakterisatie technieken, micropipet aspiratie, gepionierd door E. Evans, maakt het mogelijk om mechanische eigenschappen van het membraan te meten, zoals het gebied comprimeerbare modulus, buig modulus en Lysis stress en stam. Hier presenteren we alle methodologieën en gedetailleerde procedures om gigantische blaasjes te verkrijgen van de dunne film van een lipide of copolymeer (of beide), de fabricage-en oppervlaktebehandeling van micropipetten, en de aspiratie procedure die leidt tot de meting van alle eerder genoemde parameters.

Met het bovengenoemde protocol hebben we verschillende synthetische reus unilamellaire blaasje (guv) bestudeerd, verkregen uit een fosfolipide: 2-oleoyl-1-Palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (popc), een triblock copolymeer: poly (ethyleeneoxide)-b-poly (dimethylsiloxaan)-b-poly (ethyleeneoxide) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) gesynthetiseerd in een eerdere studie13, en een diblock copolymeer pol...

Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Het doel van het protocol is om de mechanische eigenschappen van de membraan van gigantische blaasjes betrouwbaar te meten met micro pipet aspiratie.

Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Dit protocol vergemakkelijkt een betrouwbare meting van de mechanische mechanische eigenschappen van synthetische en echte polymeerlipvezel met behulp van een micropipet aspiratietechniek. Dit is de enige techniek die het mogelijk maakt membraanflexibiliteit en instabiliteit te worden uitgerekt om te worden beoordeeld in enkele experimenten. Dit protocol omvat een reeks procedures, van vesicle voorbereiding tot de mechanische beoordeling.Het is erg belangrijk om geduldig te zijn en technische problemen op te lossen wanneer ze zich voordoen. Visualisatie op deze technieken is van cruciaal belang om te begrijpen hoe het capillaire oppervlak goed te behandelen en hoe de verplichte prestress stap uit te voeren. Het tonen van de blaas zonder gebreken.Demonstrerende procedure is Martin Fauquignon, een promovendus uit het laboratorium die werkt aan de ontwikkeling van hybride polymeerlipide vesicles. Voordat u met de procedure begint, plaatst u koudglas micropipet haarvaten verticaal in houders. En verlaag de houders tot de tips worden ondergedompeld in vers bereide glucose runder serum albumin oplossing 's nachts.Tegen de volgende ochtend zou de oplossing ongeveer één centimeter in de uiteinden door capillaire actie moeten gestegen zijn. Vul elke pipet met een 500 microliter glasspuit, uitgerust met een flexibele gesmolten silicacapillary, elke pipet met de glucoseoplossing. Vervolgens de oplossing van elke pipet aanzuigen, voordat u de pipetten meerdere keren bijvult met verse glucoseoplossing totdat al het serum is verwijderd.Om een elektrovormingskamer voor te bereiden, reinigt u eerst ITO-dia's met een geschikt organisch oplosmiddel en identificeert u het geleidende oppervlak met een Ohmeter. Bevestig elektrische draden op de geleidende kant van elke glijbaan met plakband. Dip een capillaire in amiviviale oplossing tot ongeveer 5 microliter van de oplossing is verzameld door capillaire actie.Plaats de geladen capillaire in contact met het midden van één glazen ITO-plaat en verdeel de oplossing voorzichtig over de glijbaan. Wanneer het oplosmiddel volledig is verdampt, breng de oplossing nog twee keer aan, zoals zojuist is aangetoond. voordat u aan beide zijden van de geopende O-ring spacer een laag siliciumvrij vet toevoegt rond het afzettingsgebied.Plaats vervolgens het geleidende gezicht van een tweede ITO-glasplaat op de bovenkant van de afstandsruimte en plaats de elektrovormingskamer gedurende 3 uur onder vacuüm om eventuele sporen van organisch oplosmiddel te verwijderen. Voor de elektroformatie van Giant Unilamellar Vesicles, Sluit de elektrische draden in de generator. Stel de generatorfrequentie in op 10 Hertz, en de amplitude op 2 Volt, piek op piek.Wanneer de spanning is ingesteld, gebruik dan een spuit uitgerust met een 0,8 millimeter binnendiameter naald om een milliliter van 0,1 molaire sacharose oplossing injecteren in de kamer, en laat de kamer onder de toegepaste spanning en frequentie gedurende 75 minuten. Zet aan het einde van de elektroformatie de generator uit. En gebruik de een milliliter spuit om een klein volume van de oplossing aan te lokken totdat een luchtbel wordt geproduceerd in de kamer.Kantel de kamer iets om de bel in de kamer te bewegen en om de agelsjes los te maken van het schuifoppervlak. En het hele volume van de oplossing in de spuit aanzuigen. Breng vervolgens de blaasoplossing over in een plastic buis van één milliliter.Om de materialen voor de micromanipulatie op te zetten, aanzuigen om een waterstroom, een tank van zuiver water, aan één houder tot stand te brengen. En licht tikken tijdens het verhogen van de tank om eventuele luchtbellen te elimineren, en om positieve druk te creëren. Vul een serum gecoate capillaire met verse glucose oplossing tot een druppel vormen aan de punt.Verwijder de spuitbuizen van de metalen houder om een lichte waterstroom aan het einde van de houder te creëren en draai de capillaire ondersteboven om de glucosedruppel aan te sluiten op de waterstroom. Schroef vervolgens de capillaire en de houder aan elkaar. Om de pipet te positioneren, lijm je twee glazen platen van een op maat gemaakt aluminium podium samen met vacuümvet.En installeer de dia's op een microscooppodium. Met behulp van een een milliliter pipet, vormen een meniscus tussen de twee dia's met 0,1 molaire glucose. Plaats de pipet en de houder ervan op de motorunit van de micromanipulator.Draai de klemknop vast en gebruik de joystick van het bedieningspaneel in grove modus. Laat de micropipet in de buurt van de glucose-meniscus zakken. Gebruik de fijne modus om de positie van de tip aan te passen aan het midden van de meniscus.Dompel de punt onder in de glucose om de buiten- en binnenoppervlakken schoon te maken. Na een paar minuten, trek de capillaire van de meniscus en vervang de glucose door een verse meniscus. Aspirate twee microliters van Giant Unilamellar Vesicles in 0.1 molaire sacharose, in een 20 milliliter micropipet tip.Introduceer de akeltjes in de meniscus. Gebruik de microscoop om de akeltjes aan de onderkant van de diakamer te observeren. Wanneer de akeltjes enigszins leeggelopen zijn, de zuigpijpe opnieuw integeren en de focus op de punt van de pipet.Stel vervolgens de basishoogte van de watertank in op de druk waarbij de beweging van de deeltjes wordt gestopt. Omring de meniscus met minerale olie om verdamping te voorkomen. Om een micropipette aspiratie experiment uit te voeren, laat de pipet tip in de meniscus.Maak een kleine hoeveelheid zuigdruk om een blaasmiddel aan te zuigen. Het membraan van de geselecteerde blaasje moet enigszins fluctueren en mag geen zichtbare gebreken vertonen. Gebruik de micromanipulator om de pipet naar een hoger niveau te tillen om de aangezogen blaasje van andere blaasjes te isoleren.Laat de watertank zakken tot ongeveer 10 centimeter om de blaasje voor te zetten voordat u de tank verhoogt om de druk terug te brengen naar de oorspronkelijke waarde. Vanaf een hoogte van 0,5 centimeter neemt u de zuigdruk langzaam af tot een druk waarbij het membraan fluctueert. Verhoog vervolgens de druk om een tong duidelijk te visualiseren in de punt, de projectielengte van een paar micron.Om de buigmodulus te bepalen, verhoogt u de zuigdruk, één micrometer tegelijk op een stapsgewijze manier. Tot 0,5 tot 0,8 milliNewtons per meter wordt bereikt. Wachten vijf seconden, en het nemen van een momentopname van de tong na elke stap.Om de compressibiliteitsmodulus van het gebied te bepalen, blijven lysespanning en spanning de zuigdruk verhogen van 0,5 milliNewtons per meter totdat de breukspanning is bereikt. In dit representatieve experiment waren de compressibility modulus en lysisstam voor POPC in perfecte overeenstemming met die verwacht van de literatuur. In deze tabel kunnen typische waarden voor de verkregen polymeren worden waargenomen.Merk op dat de taaiheid van het membraan verkregen uit diblock copolymeren is veel groter dan die verkregen uit triblock copolymeer. Interessant, met behulp van de diblock copolymeer, is het mogelijk om een Giant Hybrid Unilamilar Lipid Polymer Vesicles die een meer robuuste taaiheid dan die gemeten voor liposomen aan te tonen. Dit protocol kan nuttig zijn voor het meten van blaasjes met een pipet, bijvoorbeeld om de doorlaatbaarheid van het membraan te meten door middel van asmatische schok.Zorg ervoor dat u elke stap met strengheid en precisie voltooit, vooral bij het opzetten van de tribuneverbinding. Deze techniek is gebruikt om de fysieke oorsprong van membraansplitsing te begrijpen, door het meten van lijnspanning aan de hoofdgrenzen in gemodificeerde vesikles.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Fabricating Nanogaps by Nanoskiving

Fabriceren Nanogaps door Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthese van niet-uniforme Pr gedoteerde SrTiO<sub&gt; 3</sub&gt; Keramiek en hun Thermo Properties

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Synthese en karakterisering van Fe gedoteerde aluminosilicaten nanobuisjes met Enhanced Electron geleidende eigenschappen

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Meting van de deeltjesgrootteverdeling in Troebele Solutions van Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -gecoate holle glazen microbolletjes met superhydrofobe en High IR-reflecterende eigenschappen gesynthetiseerd door een Soft-chemie Methode

This manuscript proposes a soft-chemistry method to develop superhydrophobic and highly IR-reflective hollow glass microspheres (HGM). The anatase TiO2 ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Fabricage en beproeving van fotonische Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Bereiding en karakterisatie van C60/Graphene hybride nanostructuren

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Ontwarren hoge sterkte copolymeer aramidevezels om de bepaling van hun mechanische eigenschappen

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...