Name: obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00
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Gli autori riconoscono con gratitudine l'ANR per il sostegno finanziario (ANR Sysa).

1. Fabbricazione di micropipette
NOTA: Qui sono necessarie micropipette con un diametro interno compreso tra 6 e 12 m e una lunghezza di conia intorno ai 3-4 mm. Un metodo dettagliato di produzione micropipetta è descritto di seguito.
<ol><li>Posizionare il vetro borosilicate capillare nella barra di traino dell'estraente e fissare una delle estremità stringendo la manopola.</li>
	<li>Far scorrere con attenzione il vetro attraverso i fori sul lato della camera riscaldatrice.</li>
	<li>Stri...

<ol>
	<li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids.">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li><li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+vesicles.">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li><li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+vesicles+from+block+copolymers.">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li><li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+polymer/lipid+vesicles:+state+of+the+art+and+future+perspectives.">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li><li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Hybrid+Lipid/Polymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform.">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li><li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles.">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li><li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes.">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li><li>Rodr&#237;guez-Garc&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability.">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods.">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li><li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes.">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li><li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes.">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer/lipid+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs).">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li><li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+lipid+bilayers:+theory+and+possible+experiments.">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs)+does+not+systematically+lead+to+&amp;#34;intermediate''+membrane+properties.">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &amp;#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li><li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L&#945;+and+L&#945;-Gel+Coexistence+Regimes.">Material Studies of Lipid Vesicles in the L&#945; and L&#945;-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li><li>Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).</li><li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles:+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae,+but+with+mechanical+stability+and+control.">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li><li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes.">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li><li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+behavior+of+membranes+with+sterols.">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li><li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity,+Stability,+and+Area/Molecule:&#8201;+A+Micropipet+Aspiration+Approach.">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:&#8201; A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li><li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity.">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li></ol>

Il rivestimento della micropipetta è uno dei punti chiave per ottenere misurazioni affidabili. L'adesione della vescica alla micropipetta deve essere prevenuta, e un rivestimento è comunemente usato nella letteratura17,18,19,20,21, con BSA, zo-casein o surfasil. I dettagli della procedura di rivestimento sono raramente menzionati.
<p class="jove_content"...

Le vesciche giganti ottenute dai fosfolipidi (liposomi) sono state ampiamente utilizzate fin dagli anni '70 come modello di membrana cellulare di base1. Alla fine degli anni '90, le morfologie vescicolari ottenute dall'auto-assemblaggio dei polimeri, chiamati polimeriini in riferimento ai loro analoghi lipidi2,3, sono apparse rapidamente come un'interessante alternativa ai liposomi che possiedono una debole stabilità meccanica e scarsa funzionalità chimica modulare. Tuttavia, il loro carattere biomimetico cellulare è piuttosto limitato rispetto ai liposomi poiché questi ultimi sono composti da fosfolipidi, il componente principale della membrana cellulare. Inoltre, la loro bassa permeabilità della membrana può essere un problema in alcune applicazioni come la somministrazione di farmaci in cui è necessaria la diffusione controllata delle specie attraverso la membrana. Recentemente, l'associazione dei fosfolipidi con i copomeri a blocchi per progettare vescicoli polimerici e membrane ibride è stata oggetto di un numero crescente di studi4,5. L'idea principale è quella di progettare entità che combininino in modo sinergico i benefici di ogni componente (bio-funzionalità e permeabilità dei bistrati lipidi con la stabilità meccanica e la versatilità chimica delle membrane polimeriche), che possono essere sfruttate in diverse applicazioni: somministrazione controllata e mirata di farmaci, riconoscimento biomolecolare all'interno di biosensori per la diagnosi, membrane funzionali per le cellule artificiali, sviluppo di microreattori bio-ispirati.
Al giorno d'oggi, diverse comunità scientifiche (biochimici, chimici, biofisici, fisici chimici, biologi) hanno crescente interesse per lo sviluppo di un modello di membrana cellulare più avanzato. Qui, il nostro obiettivo è quello di presentare, nel modo più dettagliato possibile, metodologie esistenti (elettroformazione, aspirazione micropipette) per ottenere e caratterizzare le proprietà meccaniche delle vescicoli giganti e i recenti modelli a membrana cellulare "avanzati" che sono vescicoli giganti lipidi polimeriici ibridi4,5.
Lo scopo di questi metodi è quello di ottenere una misurazione affidabile della comprimibilità dell'area e della moduli di flessione della membrana, nonché il loro stress e tensione di lisi. Una delle tecniche più comuni esistenti per misurare la rigidità di piegatura di una vescica gigante è l'analisi della fluttuazione6,7, basata sull'osservazione diretta del microscopio video; ma questo richiede una grande fluttuazione visibile della membrana, e non è sistematicamente ottenuto su membrane spesse (ad esempio polimero). Il modulo di comprimibilità dell'area può essere determinato sperimentalmente utilizzando la tecnica Langmuir Blodgett, ma il più delle volte su un monostrato8. La tecnica di aspirazione delle micropipette consente la misurazione di entrambi i moduli su un bistrato che formano la vescicle unilamellar gigante (GUV) in un esperimento.
Il seguente metodo è appropriato per tutte le molecole di anfifianco o macromolecole in grado di formare bistrati e, di conseguenza, vescicoli per elettroformazione. Ciò richiede un carattere fluido del biostrato alla temperatura dell'elettroformazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required equipment and materials for micropipette design</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filament installed</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>NARISHGE Co.</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>fitted with two objectives (10x and 32x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for coating pipette tips with BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 10 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>626616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 5 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable acetate cellulose filter</td>
			<td>Cluzeau Info Labo</td>
			<td>L5003SPA</td>
			<td>Pore size: 0.22&#181;m, diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies.</td>
			<td>TSP530660</td>
			<td>Inner Diameter 536&#181;m, Outer Diameter 660&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 500 &#181;L luer Lock GASTIGHT</td>
			<td>Hamilton Syringe Company</td>
			<td>1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rotatory mixer</td>
			<td>Labinco</td>
			<td>28210109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulation Set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damped Optical Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>used as support of microscope to prevent external vibrations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP 2</td>
			<td>The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Mitutoyo Corporation</td>
			<td>350-354-10</td>
			<td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass water reservoir (100 ml)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for sucrose and amphiphile solution preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810146C</td>
			<td>Rhodamine tagged lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroformation set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L glass capillary ringcaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9600110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H Grease</td>
			<td>Apiezon</td>
			<td>Apiezon H Grease</td>
			<td>Silicon-free grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide coated glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>703184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN2138R1</td>
			<td>0.8 x 38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohmmeter (Multimeter)</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>VC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28676.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

Le vesciche giganti ottenute da fosfolipidi e copolimeri possono essere sfruttate in diverse applicazioni: somministrazione controllata e mirata di farmaci, riconoscimento biomolecolare all'interno di biosensori per la diagnosi, membrane funzionali per cellule artificiali e sviluppo di micro/nanoreattori bioispirati. In tutte queste applicazioni, la caratterizzazione delle loro proprietà della membrana è di fondamentale importanza. Tra le tecniche di caratterizzazione esistenti, l'aspirazione di micropipette, introdotta da E. Evans, consente la misurazione delle proprietà meccaniche della membrana come il modulo di comprimibilità dell'area, la piegatura del modulo e lo stress e la deformazione della lisi. Qui, presentiamo tutte le metodologie e le procedure dettagliate per ottenere vesciche giganti dalla pellicola sottile di un lipidico o un polimero (o entrambi), la produzione e il trattamento superficiale delle micropipette, e la procedura di aspirazione che porta alla misurazione di tutti i parametri sopra menzionati.

Con il protocollo di cui sopra, abbiamo studiato diversi vescicoli di unilamellar sintetico sintetico (GUV), ottenuti da un fosfolipidide: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), un copolimero di triblocco: Poly(ethyleneoxide)-b-Poly(dimetilsiloxane) -b-Poly(etileneossido) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12)sintetizzato in uno studio precedente13, e un copolimero disblocco Poly(dime...

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Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

L'obiettivo del protocollo è quello di misurare in modo affidabile le proprietà meccaniche della membrana delle vesciche giganti mediante aspirazione alla micropipetta.

Obsistenza di Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Questo protocollo facilita una misurazione affidabile delle proprietà meccaniche della membrana della vescicola lipidica polimerica sintetica e reale utilizzando una tecnica di aspirazione di micropipette. Questa è l'unica tecnica che consente di allungare la flessibilità e l'instabilità della membrana in singoli esperimenti. Questo protocollo prevede una serie di procedure, dalla preparazione della vescicola alla valutazione meccanica.È molto importante essere pazienti e risolvere eventuali problemi tecnici man mano che si presentano. La visualizzazione su queste tecniche è fondamentale per capire come trattare correttamente la superficie capillare e come eseguire la fase di precompresso obbligatoria. Mostrando la vescicola senza difetti.A dimostrare la procedura sarà Martin Fauquignon, dottorando del laboratorio che lavora allo sviluppo di vescicole lipidiche polimeriche ibride. Prima di iniziare la procedura posizionare i capillari di micropipette di vetro freddo verticalmente nei supporti. E abbassare i supporti fino a quando le punte sono immerse nella soluzione di albumina di siero bovino di glucosio appena preparata durante la notte.Entro la mattina successiva la soluzione dovrebbe essere salita di circa un centimetro nelle punte per azione capillare. Utilizzando una siringa in vetro da 500 microliter, dotata di un capillare flessibile di silice fusa, riempire ogni pipetta con la soluzione di glucosio. Quindi aspirare la soluzione da ogni pipetta, prima di riempire le pipette con soluzione di glucosio fresco più volte fino a quando tutto il siero non è stato rimosso.Per preparare una camera di elettroformazione, pulire prima le diapositive ITO con un solvente organico appropriato e identificare la superficie conduttiva con un Ohmeter. Attaccare fili elettrici sul lato conduttivo di ogni diapositiva con nastro adesivo. Immergere un capillare in soluzione ampiviale fino a quando circa 5 microlitri della soluzione sono stati raccolti per azione capillare.Posizionare il capillare caricato a contatto con il centro di una piastra ITO in vetro e stendere delicatamente la soluzione attraverso lo scivolo. Quando il solvente è completamente evaporato, applicare la soluzione altre due volte come appena dimostrato. prima di aggiungere uno strato di grasso privo di silicio su entrambi i lati del distanziale O-ring aperto intorno all'area di deposizione.Quindi, posizionare la faccia conduttiva di una seconda lastra di vetro ITO sulla parte superiore del distanziale e posizionare la camera di elettroformazione sotto vuoto per 3 ore per rimuovere eventuali tracce di solvente organico. Per l'elettroformazione delle vescicole unilamellari giganti, collegare i fili elettrici al generatore. Impostare la frequenza del generatore su 10 Hertz, e l'ampiezza su 2 Volt, picco al picco.Una volta impostata la tensione, utilizzare una siringa dotata di un ago di diametro interno di 0,8 millimetri per iniettare un millilitro di soluzione di saccarosio molare 0,1 nella camera e lasciare la camera sotto la tensione e la frequenza applicate per 75 minuti. Al termine dell'elettroformazione, spegnere il generatore. E utilizzare la siringa da un millilitro per aspirare un piccolo volume di soluzione fino a quando non viene prodotta una bolla d'aria all'interno della camera.Inclinare leggermente la camera per spostare la bolla nella camera e per aiutare le vescicole a staccarsi dalla superficie di scorrimento. E aspirare l'intero volume di soluzione nella siringa. Quindi, trasferire la soluzione di vescicola in un tubo di plastica da un millilitro.Per impostare i materiali per la micromanipolazione, aspirare a creare un flusso d'acqua, un serbatoio di acqua pura, a un supporto. E toccare leggermente mentre si solleva il serbatoio per eliminare eventuali bolle d'aria e creare pressione positiva. Riempire un capillare rivestito di siero con soluzione di glucosio fresco fino a quando non si forma una goccia sulla punta.Rimuovere i tubi della siringa dal supporto metallico per creare un leggero flusso d'acqua all'estremità del supporto e capovolgere il capillare per collegare la goccia di glucosio al flusso d'acqua. Quindi, avvitare il capillare e il supporto insieme. Per posizionare la pipetta, incollare due vetrini da uno stadio di alluminio su misura insieme al grasso sottovuoto.E installare le diapositive su una fase di microscopio. Usando una pipetta millilitro, formare un menisco tra le due diapositive con 0,1 glucosio molare. Posizionare la pipetta e il suo supporto sull'unità motore del micromanipolatore.Stringere la manopola di bloccaggio e utilizzare il joystick del pannello di controllo in modalità grossolana. Abbassare la micropipetta vicino al menisco di glucosio. Utilizzare la modalità fine per regolare la posizione della punta al centro del menisco.Immergere la punta nel glucosio per pulirne le superfici esterne ed interne. Dopo alcuni minuti, ritirare il capillare dal menisco e sostituire il glucosio con un menisco fresco. Aspirare due microlitri di vescicole unilamellari giganti in saccarosio molare 0,1, in una punta di micropipetta da 20 millilitri.Introdurre le vescicole nel menisco. Utilizzare il microscopio per osservare le vescicole nella parte inferiore della camera scorrevole. Quando le vescicole sono leggermente sgonfie, reinserire la pipetta di aspirazione e concentrarsi sulla punta della pipetta.Quindi impostare l'altezza di base del serbatoio dell'acqua sulla pressione alla quale viene fermato il movimento delle particelle. Circondare il menisco con olio minerale per evitare l'evaporazione. Per eseguire un esperimento di aspirazione della micropipetta, abbassare la punta della pipetta nel menisco.Creare una piccola quantità di pressione di aspirazione per aspirare una vescicola. La membrana della vescicola selezionata dovrebbe fluttuare leggermente e non presentare difetti visibili. Utilizzare il micromanipolatore per alzare la pipetta a un livello superiore per isolare la vescicola aspirata da altre vescicole.Abbassare il serbatoio dell'acqua a circa 10 centimetri per precompressire la vescicola prima di sollevare il serbatoio per riportare la pressione al valore iniziale. Da un'altezza di 0,5 centimetri, diminuire lentamente la pressione di aspirazione fino a raggiungere una pressione alla quale la membrana fluttua. Quindi aumentare la pressione per visualizzare chiaramente una lingua nella punta, la lunghezza di proiezione di alcuni micron.Per determinare il modulo di piegatura, aumentare la pressione di aspirazione, un micrometro alla volta in modo graduale. Fino a quando non viene raggiunto da 0,5 a 0,8 milliNewton per metro. Attendere cinque secondi e scattare un'istantanea della lingua dopo ogni passaggio.Per determinare il modulo di comprimibilità dell'area e la tensione e la tensione dellalisi continuano ad aumentare la pressione di aspirazione da 0,5 milliNewton per metro fino a raggiungere la tensione di rottura. In questo esperimento rappresentativo il modulo di comprimibilità dell'area e il ceppo di lysis per POPC erano in perfetto accordo con quello previsto dalla letteratura. In questa tabella si possono osservare valori tipici per i polimeri ottenuti.Si noti che la tenacità della membrana ottenuta dai copolimeri di blocco è di gran lunga maggiore di quelle ottenute dal copolimero triblocco. È interessante notare che, utilizzando il copolimero di blocco, è possibile ottenere vescicole polimeriche lipidiche unilamilari ibride giganti che dimostrano una tenacità più robusta di quella misurata per i liposomi. Questo protocollo può essere utile per misurare la vescicola con una pipetta, ad esempio, per misurare la permeabilità della membrana attraverso uno shock asmatico.Assicurati di completare ogni passaggio con rigore e precisione, specialmente quando si imposta la connessione della tribuna. Questa tecnica è stata sfruttata per comprendere l'origine fisica della fissione a membrana, attraverso la misurazione della tensione della linea ai confini principali nelle vescicole modificate.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Realizzazione nanogap da Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Ricerca

Chimica

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Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

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Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

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