Name: obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Forfatterne takknemlig erkjenner ANR for økonomisk støtte (ANR sysa).

1. fabrikere Mikropipetter
Merk: her Mikropipetter med en indre diameter som spenner fra 6 til 12 μm og en taper lengde rundt 3-4 mm er nødvendig. En detaljert metode for produksjon micropipette er beskrevet i følgende.
<ol><li>Plasser den Borosilikatglass glass-kapillær i draget av avtrekker og fest en av endene ved å stramme knotten.</li>
	<li>Skyv forsiktig glasset gjennom hullene på siden av ovnen kammeret.</li>
	<li>Stram spenn knotten i den andre enden.</li>
	<li>Kontroll større...

<ol>
	<li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids.">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li><li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+vesicles.">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li><li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+vesicles+from+block+copolymers.">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li><li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+polymer/lipid+vesicles:+state+of+the+art+and+future+perspectives.">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li><li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Hybrid+Lipid/Polymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform.">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li><li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles.">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li><li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes.">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li><li>Rodr&#237;guez-Garc&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability.">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods.">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li><li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes.">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li><li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes.">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer/lipid+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs).">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li><li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+lipid+bilayers:+theory+and+possible+experiments.">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs)+does+not+systematically+lead+to+&amp;#34;intermediate''+membrane+properties.">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &amp;#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li><li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L&#945;+and+L&#945;-Gel+Coexistence+Regimes.">Material Studies of Lipid Vesicles in the L&#945; and L&#945;-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li><li>Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).</li><li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles:+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae,+but+with+mechanical+stability+and+control.">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li><li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes.">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li><li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+behavior+of+membranes+with+sterols.">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li><li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity,+Stability,+and+Area/Molecule:&#8201;+A+Micropipet+Aspiration+Approach.">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:&#8201; A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li><li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity.">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li></ol>

Belegget på micropipette er en av hovedpunktene for å oppnå pålitelige målinger. Vedheft av vesicle til micropipette må forebygges, og et belegg er vanligvis brukt i litteraturen17,18,19,20,21, med BSA, β-kasein eller surfasil. Detaljer om belegget prosedyren er sjelden nevnt.
Oppløsningen av BSA skal utføres i minst 4 time...

Gigantiske blemmer innhentet fra fosfolipider (liposomer) har vært mye brukt siden 1970-tallet som den grunnleggende celle membran modell1. På slutten av 1990-tallet, flytande morfologier innhentet fra selv-montering av kopolymerer, oppkalt polymersomes i referanse til sine lipid analogs2,3, raskt dukket opp som et interessant alternativ til liposomer som har svak mekanisk stabilitet og dårlig modulær kjemisk funksjonalitet. Imidlertid er deres celle BioMimetic karakter ganske begrenset i forhold til liposomer siden sistnevnte er sammensatt av fosfolipider, den viktigste komponenten i cellemembranen. Videre kan deres lave membran permeabilitet være et problem i enkelte programmer som legemiddellevering der kontrollert diffusjon av arter gjennom membranen er nødvendig. Nylig har foreningen av fosfolipider med blokk kopolymerer til design hybrid polymer-lipid blemmer og membraner vært gjenstand for et økende antall studier4,5. Den viktigste ideen er å designe enheter som synergi kombinere fordelene med hver komponent (bio-funksjonalitet og permeabilitet av lipid bilayers med mekanisk stabilitet og kjemisk allsidighet av polymer membraner), som kan utnyttes i ulike programmer: kontrollert og målrettet narkotika levering, Biomolecular anerkjennelse innen biosensors for diagnose, funksjonelle membraner for kunstige celler, utvikling av bio-inspirerte mikro-/nano-Reactors.
I dag har ulike vitenskapelige miljøer (Biokjemikere, kjemikere, biophysicists, fysikalsk-kjemikere, biologer) økende interesse for utvikling av en mer avansert celle membran modell. Her er vårt mål å presentere, så detaljert som mulig, eksisterende metoder (electroformation, micropipette aspirasjon) for å få og karakterisere de mekaniske egenskapene til gigantiske blemmer og de siste "avanserte" celle membran modeller som er hybrid polymer lipid gigantiske blemmer4,5.
Hensikten med disse metodene er å oppnå pålitelig måling av området Komprimerbar og bøying moduli av membranen, samt deres lyse Rings stress og belastning. En av de vanligste teknikkene som eksisterer for å måle bøying stivhet av en gigantisk vesicle er svingninger analyse6,7, basert på direkte video mikroskop observasjon; men dette krever store synlige membran svingninger, og er ikke systematisk innhentet på tykke membraner (f. eks polymersomes). Areal Komprimerbar modul kan være eksperimentelt bestemmes ved hjelp av Langmuir Blodgett teknikk, men oftest på en monolag8. Den micropipette aspirasjon teknikken gjør at måling av både moduli på en bilayer forming gigantiske unilamellære vesicle (GUV) i ett eksperiment.
Følgende metode er hensiktsmessig for alle amfifile molekyler eller makromolekyler stand til å danne bilayers og følgelig blemmer av electroformation. Dette krever en væske karakter av bilayer ved temperaturen på electroformation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required equipment and materials for micropipette design</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filament installed</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>NARISHGE Co.</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>fitted with two objectives (10x and 32x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for coating pipette tips with BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 10 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>626616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 5 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable acetate cellulose filter</td>
			<td>Cluzeau Info Labo</td>
			<td>L5003SPA</td>
			<td>Pore size: 0.22&#181;m, diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies.</td>
			<td>TSP530660</td>
			<td>Inner Diameter 536&#181;m, Outer Diameter 660&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 500 &#181;L luer Lock GASTIGHT</td>
			<td>Hamilton Syringe Company</td>
			<td>1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rotatory mixer</td>
			<td>Labinco</td>
			<td>28210109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulation Set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damped Optical Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>used as support of microscope to prevent external vibrations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP 2</td>
			<td>The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Mitutoyo Corporation</td>
			<td>350-354-10</td>
			<td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass water reservoir (100 ml)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for sucrose and amphiphile solution preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810146C</td>
			<td>Rhodamine tagged lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroformation set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L glass capillary ringcaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9600110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H Grease</td>
			<td>Apiezon</td>
			<td>Apiezon H Grease</td>
			<td>Silicon-free grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide coated glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>703184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN2138R1</td>
			<td>0.8 x 38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohmmeter (Multimeter)</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>VC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28676.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

Gigantiske blemmer innhentet fra fosfolipider og kopolymerer kan utnyttes i ulike programmer: kontrollert og målrettet narkotika levering, Biomolecular anerkjennelse innen biosensors for diagnostisering, funksjonelle membraner for kunstige celler, og utvikling av bioinspired mikro/nano-reaktorer. I alle disse programmene, karakterisering av deres membran egenskaper er av fundamental betydning. Blant eksisterende karakterisering teknikker, micropipette aspirasjon, utviklet av E. Evans, tillater måling av mekaniske egenskaper av membranen som areal Komprimerbar modul, bøying modul og lyse stress og belastning. Her presenterer vi alle metoder og detaljerte prosedyrer for å få gigantiske blemmer fra tynn film av en lipid eller kopolymer (eller begge), produksjon og overflatebehandling av Mikropipetter, og aspirasjon prosedyre som fører til måling av alle parametrene tidligere nevnt.

Med protokollen nevnt, har vi studert ulike syntetiske gigantiske unilamellære vesicle (GUV), Hentet fra en fosfolipid: 2-oleoyl-1-Palmitoyl-sn-glycero-3-PHOSPHOCHOLINE (POPC), en triblock kopolymer: Poly (ethyleneoxide)-b-Poly (dimethylsiloxane)-b-Poly (ethyleneoxide) (folk12-b-PDMS43-b-folk12) syntetisert i en tidligere studie13, og en diblokk kopolymer Poly (dimethylsiloxane)-b</e...

Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Målet med protokollen er å pålitelig måle membran mekaniske egenskaper gigantiske blemmer ved micropipette aspirasjon.

Obtention av Giant Unilamellære hybrid blemmer av Electroformation og måling av deres mekaniske egenskaper ved Micropipette aspirasjon

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Denne protokollen forenkler en pålitelig måling av membran mekaniske egenskaper av syntetisk og ekte polymer lipid vesikkel ved hjelp av en mikropipette aspirasjon teknikk. Dette er den eneste teknikken som gjør at membranfleksibilitet og ustabilitet kan strekkes for å bli vurdert i enkelteksperimenter. Denne protokollen innebærer en rekke prosedyrer fra vesikkelforberedelse til den mekaniske vurderingen.Det er svært viktig å være tålmodig og å løse eventuelle tekniske problemer som de oppstår. Visualisering på disse teknikkene er avgjørende for å forstå hvordan man skal behandle kapillæroverflaten og hvordan du utfører det obligatoriske prestress-trinnet. Viser opp vesikkelen uten feil.Demonstrert prosedyre vil være Martin Fauquignon, en ph.d.-student fra laboratoriet som arbeider med utvikling av hybrid polymer lipid vesikler. Før du begynner prosedyren plassere kaldt glass mikropipette kapillærer vertikalt i holdere. Og senk holderne til spissene er nedsenket i nylaget glukosebovin serum albumin løsning over natten.Neste morgen skal løsningen ha steget omtrent en centimeter inn i spissene ved kapillær handling. Bruk en 500 mikroliters glasssprøyte, utstyrt med en fleksibel smeltet silikakapillær, fyll hver pipette med glukoseoppløsningen. Aspirer deretter løsningen fra hver pipette, før du fyller pipettene med fersk glukoseoppløsning flere ganger til hele serumet er fjernet.For å forberede et elektroformasjonskammer glir først ITO med et passende organisk løsningsmiddel, og identifiserer den ledende overflaten med et Ohmeter. Fest elektriske ledninger på den ledende siden av hvert lysbilde med tape. Dypp en kapillær i ampivial oppløsning til ca 5 mikroliter av løsningen er samlet inn ved kapillær virkning.Plasser den ladde kapillæren i kontakt med midten av ett GLASS ITO-plate og spre forsiktig oppløsningen over lysbildet. Når løsningsmidlet er fullstendig fordampet, bruk oppløsningen to ganger til som nettopp demonstrert. før du legger til et lag med silisiumfritt fett på begge sider av den åpnede O-ring avstandss avstandssalren rundt avsetningsområdet.Deretter plasserer du det ledende ansiktet til en annen ITO-glassplate på toppen av avstandssylet, og plasserer elektroformasjonskammeret under vakuum i 3 timer for å fjerne eventuelle spor av organisk løsningsmiddel. For elektroformasjon av Giant Unilamellar Vesicles, Plugg de elektriske ledningene inn i generatoren. Sett generatorfrekvensen til 10 Hertz, og amplituden til 2 Volt, topp til topp.Når spenningen er innstilt, bruk en sprøyte utstyrt med en 0,8 millimeter indre diameter nål for å injisere en milliliter 0,1 molar sukrose løsning inn i kammeret, og la kammeret under påførende spenning og frekvens i 75 minutter. På slutten av elektroformasjonen, slå av generatoren. Og bruk den ene millilitersprøyten til å aspirere et lite volum oppløsning til en luftboble produseres inne i kammeret.Vipp kammeret litt for å flytte boblen inn i kammeret, og for å hjelpe vesikler løsne fra lysbildeoverflaten. Og aspirer hele oppløsningsvolumet i sprøyten. Deretter overfører vesikkelløsningen til et en milliliter plastrør.For å sette opp materialene for mikromanipulering, aspirerer for å skape en vannstrøm, en tank med rent vann, til en holder. Og trykk lett mens du hever tanken for å eliminere eventuelle luftbobler, og for å skape positivt trykk. Fyll en serumbelagt kapillær med fersk glukoseoppløsning til en dråpe dannes på spissen.Fjern sprøyteslangen fra metallholderen for å skape en liten vannstrøm på enden av holderen, og snu kapillæren opp ned for å koble glukosedråpen til vannstrømmen. Skru deretter kapillæren og holderen sammen. For å plassere pipetten lim to glasssklier fra et skreddersydd aluminiumsstadium sammen med vakuumfett.Og installer lysbildene på et mikroskopstadium. Bruk en en milliliter pipette, danner en menisk mellom de to lysbildene med 0,1 molarglukose. Plasser pipetten og holderen på mikromanipulatorens motorenhet.Stram klemknappen, og bruk styrespaken på kontrollpanelet i grov modus. Senk mikropipetten i nærheten av glukose menisken. Bruk finmodus til å justere plasseringen av spissen til midten av menisken.Senk spissen i glukosen for å rengjøre sine ytre og indre overflater. Etter noen minutter, trekk kapillæren fra menisken og erstatt glukosen med en frisk menisk. Aspirer to mikroliter av Giant Unilamellar Vesicles i 0,1 molar sukrose, inn i en 20 milliliter mikropipettespiss.Introdder vesikler i menisken. Bruk mikroskopet til å observere vesikler nederst på lysbildekammeret. Når vesikler er litt deflatert, sett inn sugepipetten og fokuser på pipettens spiss.Sett deretter grunnlinjehøyden på vanntanken til trykket der partiklenes bevegelse stoppes. Omgi menisken med mineralolje for å forhindre fordampning. For å utføre et mikropipetteaspirasjonseksperiment, senk pipettespissen ned i menisken.Lag en liten mengde sugetrykk for å aspirere en vesikkel. Membranen til den valgte vesikkelen skal litt svinge og bør ikke presentere noen synlige defekter. Bruk mikromanipulatoren til å heve pipetten til et høyere nivå for å isolere den aspirerte vesikkelen fra andre vesikler.Senk vanntanken til ca. 10 centimeter for å forstresse vesikkelen før du løfter tanken for å returnere trykket til startverdien. Fra en høyde på 0, 5 centimeter, reduser sugetrykket sakte til et trykk som membranen svinger er nådd. Øk deretter trykket for å tydelig visualisere en tunge i spissen, projeksjonslengden på noen få mikrometer.For å bestemme bøyemodulen, øk sugetrykket, ett mikrometer om gangen på en trinnvis måte. Inntil 0,5 til 0,8 milliNewtons per meter er nådd. Venter fem sekunder, og tar et øyeblikksbilde av tungen etter hvert trinn.For å bestemme området compressibility modulus, og lysis spenning og belastning fortsetter å øke sugetrykket fra 0,5 milliNewtons per meter til bruddspenningen er nådd. I dette representative eksperimentet var området compressibility modulus og lysis belastning for POPC i perfekt enighet med det som forventes fra litteraturen. I denne tabellen kan typiske verdier for polymersomene oppnådd observeres.Legg merke til at seigheten i membranen hentet fra diblock copolymers er langt større enn de som er hentet fra triblock copolymer. Interessant, ved hjelp av diblock copolymer, er det mulig å få en Giant Hybrid Unilamilar Lipid Polymer Vesicles som viser en mer robust seighet enn det som måles for liposomer. Denne protokollen kan være nyttig for å måle vesikkel med en pipette, for eksempel for å måle membranens permeabilitet gjennom asmatisk sjokk.Pass på å fullføre hvert trinn med rigor og presisjon, spesielt når du setter opp tribuneforbindelsen. Denne teknikken har blitt utnyttet til å forstå fysisk opprinnelse av membranfisjon, gjennom måling av linjespenning ved hovedgrensene i modifiserte vesikler.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Fabricating Nanogaps by Nanoskiving

Fabrikere Nanogaps ved Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse av Bestilte biomolekylære strukturer ved selvbygging av Short Peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Syntese av ikke-uniformt Pr-dopet SrTiO<sub&gt; 3</sub&gt; Keramikk og deres Termo Properties

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Syntese og karakterisering av Fe-dopet Aluminosilicate nanorør med Enhanced Electron ledende egenskaper

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Måling av partikkelstørrelsesfordelingen i Grumsete Solutions ved dynamisk lysspredning Mikros

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -belagt hule glassmikrosfærer med superhydrophobic og høy IR-reflekterende egenskaper syntetisert ved en Soft-kjemi Metode

This manuscript proposes a soft-chemistry method to develop superhydrophobic and highly IR-reflective hollow glass microspheres (HGM). The anatase TiO2 ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Fabrikasjon og Testing av fotoniske termometre

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Forberedelse og karakterisering av C60/Graphene Hybrid nanostrukturer

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membran ombygging av gigantiske blemmer svar på lokaliserte kalsium Ion graderinger

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Disentangling høy styrke Copolymer Aramid fibre å aktivere fastsettelse av sine mekaniske egenskaper

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...