Name: obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00
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Los autores agradecen a la ANR su apoyo financiero (ANR Sysa).

1. Fabricación de micropipetas
NOTA: Aquí son necesarias micropipetas con un diámetro interior de 6 a 12 m y una longitud córnea de alrededor de 3-4 mm. A continuación se describe un método detallado de fabricación de micropipetas.
<ol><li>Coloque el capilar de vidrio borosilicato en la barra de tracción del tirador y fije uno de los extremos apretando la perilla.</li>
	<li>Deslice cuidadosamente el vidrio a través de los orificios en el lado de la cámara del calentador.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids.">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li><li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+vesicles.">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li><li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+vesicles+from+block+copolymers.">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li><li>Le Meins, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles.">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li><li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes.">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li><li>Rodr&#237;guez-Garc&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability.">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li><li>Angelova, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods.">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li><li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes.">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li><li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes.">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer/lipid+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs).">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li><li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+lipid+bilayers:+theory+and+possible+experiments.">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs)+does+not+systematically+lead+to+&amp;#34;intermediate''+membrane+properties.">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &amp;#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li><li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L&#945;+and+L&#945;-Gel+Coexistence+Regimes.">Material Studies of Lipid Vesicles in the L&#945; and L&#945;-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li><li>Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).</li><li>Chen, D., Santore, M. 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V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity,+Stability,+and+Area/Molecule:&#8201;+A+Micropipet+Aspiration+Approach.">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:&#8201; A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li><li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity.">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li></ol>

El recubrimiento del micropipeta es uno de los puntos clave para obtener mediciones fiables. Se debe evitar la adhesión de la vesícula a la micropipeta, y se utiliza comúnmente un recubrimiento en la literatura17,18,19,20,21, con BSA, é-caseína o surfasil. Los detalles del procedimiento de recubrimiento rara vez se mencionan.
L...

Las vesículas gigantes obtenidas a partir de fosfolípidos (liposomas) han sido ampliamente utilizadas desde la década de 1970 como la membrana celular básica modelo1. A finales de la década de 1990, las morfologías vesiculares obtenidas del autoensamblaje de copolímeros, denominados polímeros en referencia a sus análogos de lípidos2,3,aparecieron rápidamente como una alternativa interesante a los liposomas que poseen una débil estabilidad mecánica y una pobre funcionalidad química modular. Sin embargo, su carácter biomimético celular es bastante limitado en comparación con los liposomas ya que estos últimos están compuestos de fosfolípidos, el componente principal de la membrana celular. Además, su baja permeabilidad a la membrana puede ser un problema en algunas aplicaciones como la administración de fármacos donde se requiere la difusión controlada de especies a través de la membrana. Recientemente, la asociación de fosfolípidos con copolímeros de bloque para diseñar vesículas y membranas híbridas de polímero-lípido sha sido objeto de un número creciente de estudios4,5. La idea principal es diseñar entidades que combinen sinérgicamente los beneficios de cada componente (biofuncionalidad y permeabilidad de las bicapas lipídicas con la estabilidad mecánica y versatilidad química de las membranas poliméricas), que pueden ser explotadas en diferentes aplicaciones: entrega controlada y dirigida de fármacos, reconocimiento biomolecular dentro de biosensores para el diagnóstico, membranas funcionales para células artificiales, desarrollo de micro-nano-reactores bioinspirados.
Hoy en día, diferentes comunidades científicas (bioquímicos, químicos, biofísicos, físico-químicos, biólogos) tienen un creciente interés en el desarrollo de un modelo de membrana celular más avanzado. Aquí, nuestro objetivo es presentar, lo más detalladamente posible, metodologías existentes (electroformación, aspiración de micropipetas) para obtener y caracterizar las propiedades mecánicas de las vesículas gigantes y los recientes modelos de membrana celular "avanzados" que son vesículas gigantes de lípidos de polímero híbrido4,5.
El propósito de estos métodos es obtener una medición fiable de la compresibilidad de la zona y los módulos de flexión de la membrana, así como su tensión de lisis y tensión. Una de las técnicas más comunes existentes para medir la rigidez de flexión de una vesícula gigante es el análisis de fluctuación6,7, basado en la observación directa del microscopio de vídeo; pero esto requiere una gran fluctuación visible de la membrana, y no se obtiene sistemáticamente en membranas gruesas (por ejemplo, polímeros). El módulo de compresibilidad de área se puede determinar experimentalmente utilizando la técnica Langmuir Blodgett, pero más a menudo en una monocapa8. La técnica de aspiración de micropipetas permite la medición de ambos módulos en una bicapa formando vesícula unilamellar gigante (GUV) en un experimento.
El siguiente método es adecuado para todas las moléculas anfifílicas o macromoléculas capaces de formar bicapas y, en consecuencia, vesículas por electroformación. Esto requiere un carácter fluido de la bicapa a la temperatura de la electroformación.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required equipment and materials for micropipette design</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filament installed</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>NARISHGE Co.</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>fitted with two objectives (10x and 32x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for coating pipette tips with BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 10 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>626616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 5 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable acetate cellulose filter</td>
			<td>Cluzeau Info Labo</td>
			<td>L5003SPA</td>
			<td>Pore size: 0.22&#181;m, diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies.</td>
			<td>TSP530660</td>
			<td>Inner Diameter 536&#181;m, Outer Diameter 660&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 500 &#181;L luer Lock GASTIGHT</td>
			<td>Hamilton Syringe Company</td>
			<td>1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rotatory mixer</td>
			<td>Labinco</td>
			<td>28210109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulation Set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damped Optical Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>used as support of microscope to prevent external vibrations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP 2</td>
			<td>The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Mitutoyo Corporation</td>
			<td>350-354-10</td>
			<td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass water reservoir (100 ml)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for sucrose and amphiphile solution preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810146C</td>
			<td>Rhodamine tagged lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroformation set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L glass capillary ringcaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9600110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H Grease</td>
			<td>Apiezon</td>
			<td>Apiezon H Grease</td>
			<td>Silicon-free grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide coated glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>703184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN2138R1</td>
			<td>0.8 x 38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohmmeter (Multimeter)</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>VC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28676.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

Las vesículas gigantes obtenidas a partir de fosfolípidos y copolímeros pueden explotarse en diferentes aplicaciones: administración controlada y dirigida de fármacos, reconocimiento biomolecular dentro de biosensores para el diagnóstico, membranas funcionales para células artificiales y desarrollo de micro/nanorreactores bioinspirados. En todas estas aplicaciones, la caracterización de sus propiedades de membrana es de importancia fundamental. Entre las técnicas de caracterización existentes, la aspiración de micropipetas, pionera por E. Evans, permite la medición de las propiedades mecánicas de la membrana, como el módulo de compresibilidad de área, el módulo de flexión y la tensión y la tensión de lisis y la tensión y la tensión. Aquí, presentamos todas las metodologías y procedimientos detallados para obtener vesículas gigantes a partir de la película delgada de un lípido o copolímero (o ambos), la fabricación y tratamiento superficial de micropipetas, y el procedimiento de aspiración que conduce a la medición de todos los parámetros mencionados anteriormente.

Con el protocolo antes mencionado, hemos estudiado diferentes vesículas unilamellares gigantes sintéticas (GUV), obtenidas a partir de un fosfolípido: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), un copolímero tribloque: Poli(etilenoóxido)-b-Poli(dimethylsiloxane)-b-Poly(etilóxido) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) sintetizado en un estudio anterior13, y un copolímero dibloque Poly...

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Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

El objetivo del protocolo es medir de forma fiable las propiedades mecánicas de membrana de las vesículas gigantes por aspiración de micropipetas.

Obtención de vesículas híbridas unilamelares gigantes por electroformación y medición de sus propiedades mecánicas por aspiración de micropipeta

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Este protocolo facilita una medición fiable de las propiedades mecánicas de membrana de la vesícula de lípido de polímero sintético y real utilizando una técnica de aspiración de micropipeta. Esta es la única técnica que permite que la flexibilidad de la membrana y la inestabilidad se estiren para ser evaluadas en experimentos individuales. Este protocolo implica una serie de procedimientos desde la preparación de la vesícula hasta la evaluación mecánica.Es muy importante ser paciente y resolver cualquier problema técnico a medida que surgen. La visualización de estas técnicas es fundamental para comprender cómo tratar adecuadamente la superficie capilar y cómo realizar el paso de pretensado obligatorio. Mostrando la vesícula sin defectos.El procedimiento de demostración será Martin Fauquignon, un estudiante de doctorado del laboratorio que trabaja en el desarrollo de vesículas de lípidos de polímero híbrido. Antes de comenzar el procedimiento coloque los capilares de micropipeta de vidrio frío verticalmente en los soportes. Y baje los soportes hasta que las puntas se sumerjan en una solución de albúmina sérica bovina de glucosa recién preparada durante la noche.A la mañana siguiente la solución debería haber subido alrededor de un centímetro en las puntas por acción capilar. Usando una jeringa de vidrio de 500 microlitros, equipada con un capilar flexible de sílice fusionada, llene cada pipeta con la solución de glucosa. A continuación, aspirar la solución de cada pipeta, antes de rellenar las pipetas con solución de glucosa fresca varias veces hasta que se haya eliminado todo el suero.Para preparar una cámara de electroformación, primero limpie los portaobjetos ITO con un disolvente orgánico adecuado e identifique la superficie conductora con un ohmeter. Coloque los cables eléctricos en el lado conductor de cada diapositiva con cinta adhesiva. Sumerja un capilar en solución ampivial hasta que se hayan recogido aproximadamente 5 microlitros de la solución por acción capilar.Coloque el capilar cargado en contacto con el centro de una placa ITO de vidrio y extienda suavemente la solución a través de la corredera. Cuando el disolvente se haya evaporado por completo, aplique la solución dos veces más como se acaba de demostrar. antes de añadir una capa de grasa libre de silicio en ambos lados del espaciador de junta tórica abierto alrededor del área de deposición.A continuación, coloque la cara conductora de una segunda placa de vidrio ITO en la parte superior del espaciador y coloque la cámara de electroformación bajo vacío durante 3 horas para eliminar cualquier rastro de disolvente orgánico. Para la electroformación de las Vesículas Unilamellar Gigantes, enchufe los cables eléctricos en el generador. Establezca la frecuencia del generador en 10 Hertz, y la amplitud a 2 Voltios, pico a pico.Cuando se haya ajustado la tensión, utilice una jeringa equipada con una aguja de 0,8 milímetros de diámetro interior para inyectar un mililitro de solución de sacarosa molar 0,1 en la cámara, y deje la cámara bajo la tensión y frecuencia aplicadas durante 75 minutos. Al final de la electroformación, apague el generador. Y utilice la jeringa de un mililitro para aspirar un pequeño volumen de solución hasta que se produzca una burbuja de aire dentro de la cámara.Incline ligeramente la cámara para mover la burbuja a la cámara y para ayudar a que las vesículas se desprendan de la superficie del deslizamiento. Y aspirar todo el volumen de solución en la jeringa. A continuación, transfiera la solución de vesícula a un tubo de plástico de un mililitro.Para configurar los materiales para la micromanipulación, aspirar a crear un flujo de agua, un tanque de agua pura, a un soporte. Y toque ligeramente mientras eleva el tanque para eliminar cualquier burbuja de aire, y para crear presión positiva. Llene un capilar recubierto de suero con solución fresca de glucosa hasta que se forme una gota en la punta.Retire el tubo de la jeringa del soporte metálico para crear un ligero flujo de agua al final del soporte, y gire el capilar boca abajo para conectar la gota de glucosa al flujo de agua. A continuación, atornille el capilar y el soporte. Para colocar la pipeta, pegue dos portaobjetos de vidrio de una etapa de aluminio hecha a medida junto con grasa al vacío.E instale las diapositivas en una etapa del microscopio. Usando una pipeta de un mililitro, forme un menisco entre los dos portaobjetos con 0,1 de glucosa molar. Coloque la pipeta y su soporte en la unidad de motor del micromaniprógrafo.Apriete la perilla de sujeción y utilice el joystick del panel de control en modo grueso. Baje la micropipeta cerca del menisco de glucosa. Utilice el modo fino para ajustar la posición de la punta al centro del menisco.Sumerja la punta en la glucosa para limpiar sus superficies externas e internas. Después de unos minutos, retira el capilar del menisco y reemplaza la glucosa con un menisco fresco. Aspirar dos microlitros de vesículas unilamelares gigantes en 0,1 sacarosa molar, en una punta de micropipeta de 20 mililitros.Introducir las vesículas en el menisco. Utilice el microscopio para observar las vesículas en la parte inferior de la cámara deslizante. Cuando las vesículas estén ligeramente desinfladas, vuelva a insertar la pipeta de succión y concéntrese en la punta de la pipeta.A continuación, establezca la altura de línea base del tanque de agua a la presión a la que se detiene el movimiento de las partículas. Rodear el menisco con aceite mineral para evitar la evaporación. Para realizar un experimento de aspiración de micropipeta, baje la punta de la pipeta en el menisco.Cree una pequeña cantidad de presión de succión para aspirar una vesícula. La membrana de la vesícula seleccionada debe fluctuar ligeramente y no debe presentar defectos visibles. Utilice el micromaniprógrafo para elevar la pipeta a un nivel superior para aislar la vesícula aspirada de otras vesículas.Baje el tanque de agua a aproximadamente 10 centímetros para pretensar la vesícula antes de elevar el tanque para devolver la presión al valor inicial. A partir de una altura de 0,5 centímetros, disminuya lentamente la presión de succión hasta alcanzar una presión a la que fluctúa la membrana. A continuación, aumentar la presión para visualizar claramente una lengua en la punta, la longitud de proyección de unos pocos micras.Para determinar el módulo de flexión, aumente la presión de aspiración, un micrómetro a la vez de manera escalonada. Hasta que se alcancen de 0,5 a 0,8 milinewtons por metro. Esperando cinco segundos, y tomando una instantánea de la lengua después de cada paso.Para determinar el módulo de compresibilidad del área, y la tensión y la tensión de la lysis continúan aumentando la presión de aspiración de 0,5 milinuevos por metro hasta alcanzar la tensión de ruptura. En este experimento representativo, el módulo de compresión de área y la cepa de lysis para POPC estaban en perfecto acuerdo con lo esperado de la literatura. En esta tabla se pueden observar valores típicos para los polímeros obtenidos.Tenga en cuenta que la dureza de la membrana obtenida de copolímeros diblock es mucho mayor que la obtenida del copolímero tribloque. Curiosamente, utilizando el copolímero diblock, es posible obtener un líbrimo de polímero unilamilar híbrido gigante vesículas que demuestran una dureza más robusta que la medida para los liposomas. Este protocolo puede ser útil para medir la vesícula con una pipeta, por ejemplo, para medir la permeabilidad de la membrana a través de choque asmático.Asegúrese de completar cada paso con rigor y precisión, especialmente al configurar la conexión tribuna. Esta técnica ha sido aprovechada para entender el origen físico de la fisión de la membrana, a través de la medición de la tensión de la línea en los límites principales en las vesículas modificadas.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Fabricating Nanogaps by Nanoskiving

Fabricación Nanogaps por Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Investigación

Química

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In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

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Síntesis de dopado-Pr no uniformemente SrTiO<sub&gt; 3</sub&gt; Cerámica y sus propiedades termoeléctricas

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TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Recubiertas con microesferas de vidrio huecas con propiedades superhidrófobas y alta IR-reflectantes sintetizado por un método de química suave

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In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

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