Name: obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt ANR för finansiellt stöd (ANR sysA).

1. fabricera Mikropipetter
Anmärkning: här behövs Mikropipetter med en innerdiameter på mellan 6 och 12 μm och en Kona längd runt 3-4 mm. En detaljerad metod för tillverkning av mikropipett beskrivs i följande.
<ol><li>Placera borosilicatglaset kapillär i dragstången av avdragare och fäst en av ändarna genom att dra åt ratten.</li>
	<li>Skjut försiktigt glaset genom hålen vid sidan av värme kammaren.</li>
	<li>Dra åt spännreglaget i den andra änden.</li>
	<li>Kontrollera s...

<ol>
	<li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids.">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li><li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+vesicles.">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li><li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+vesicles+from+block+copolymers.">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li><li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+polymer/lipid+vesicles:+state+of+the+art+and+future+perspectives.">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li><li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Hybrid+Lipid/Polymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform.">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li><li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles.">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li><li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes.">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li><li>Rodr&#237;guez-Garc&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability.">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods.">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li><li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes.">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li><li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes.">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer/lipid+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs).">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li><li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+lipid+bilayers:+theory+and+possible+experiments.">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs)+does+not+systematically+lead+to+&amp;#34;intermediate''+membrane+properties.">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &amp;#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li><li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L&#945;+and+L&#945;-Gel+Coexistence+Regimes.">Material Studies of Lipid Vesicles in the L&#945; and L&#945;-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li><li>Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).</li><li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles:+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae,+but+with+mechanical+stability+and+control.">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li><li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes.">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li><li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+behavior+of+membranes+with+sterols.">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li><li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity,+Stability,+and+Area/Molecule:&#8201;+A+Micropipet+Aspiration+Approach.">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:&#8201; A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li><li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity.">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li></ol>

Beläggningen på mikropipetten är en av de viktigaste punkterna för att få pålitliga mätningar. Vesikelens vidhäftning till mikropipetten måste förhindras och en beläggning används vanligen i litteraturen17,18,19,20,21, med BSA, β-Casein eller surfasil. Specificerar av beläggning tillvägagångssättet nämns sällan.
U...

Jätte blåsor som erhållits från fosfolipider (liposomer) har använts flitigt sedan 1970-talet som den grundläggande cellmembranet Model1. I slutet av 1990-talet, vesikulär morfologier som erhållits från själv-församlingen av sampolymerer, namngivna polymersomes i förhållande till deras lipidanaloger2,3, visade sig snabbt som ett intressant alternativ till liposomer som besitter svag mekanisk stabilitet och dålig modulär kemisk funktionalitet. Men, deras cell biomimetiska tecken är ganska begränsad jämfört med liposomer eftersom de senare består av fosfolipider, den viktigaste komponenten i cellmembranet. Dessutom kan deras låga membran permeabilitet vara ett problem i vissa tillämpningar som läkemedelsleverans där kontrollerad diffusion av arter genom membranet krävs. Nyligen har föreningen för fosfolipider med block sampolymerer för att designa hybrid polymer-lipid blåsor och membran varit föremål för ett ökande antal studier4,5. Huvudtanken är att designa enheter som synergistiskt kombinerar fördelarna med varje komponent (Bio-funktionalitet och permeabilitet av lipidbilayers med mekanisk stabilitet och kemisk mångsidighet av polymermembran), som kan utnyttjas i olika tillämpningar: kontrollerad och målinriktad läkemedelsleverans, Biomolekylär igenkänning inom biosensorer för diagnostik, funktionella membran för konstgjorda celler, utveckling av bio-inspirerade mikro-/nanoreaktors.
Nuförtiden har olika vetenskapliga samfund (biokemister, kemister, biofysiker, fysiologer, biologer) ökat intresset för utveckling av en mer avancerad cellmembran modell. Här, vårt mål är att presentera, så detaljerat som möjligt, befintliga metoder (elektroformation, micropipett aspiration) för att få och karakterisera de mekaniska egenskaperna hos jätte blåsor och den senaste "avancerade" cellmembran modeller som är hybrid polymer lipid jätte blåsor4,5.
Syftet med dessa metoder är att få tillförlitlig mätning av områdets kompressibilitet och böjning moduli av membranet samt deras Lys stress och påfrestningar. En av de vanligaste teknikerna som finns för att mäta böjstyvhet hos en gigantisk vesikel är fluktuationsanalys6,7, baserad på direkt video Mikroskop observation; men detta kräver stora synliga membran fluktuation, och inte systematiskt erhålls på tjocka membran (t. ex. polymersomer). Area kompressibility Modulus kan experimentellt bestämmas med hjälp av Langmuir Blodgett teknik men oftast på en enskiktslager8. Den micropipett aspiration teknik möjliggör mätning av både moduli på ett lipidens bildar Giant små vesikler (GUV) i ett experiment.
Följande metod är lämplig för alla amfifila molekyler eller makromolekyler som kan bilda lipidmonolager och därmed blåsor genom elektrobildning. Detta kräver en flytande karaktär av lipidens vid temperaturen på elektroformation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required equipment and materials for micropipette design</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filament installed</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>NARISHGE Co.</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>fitted with two objectives (10x and 32x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for coating pipette tips with BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 10 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>626616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 5 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable acetate cellulose filter</td>
			<td>Cluzeau Info Labo</td>
			<td>L5003SPA</td>
			<td>Pore size: 0.22&#181;m, diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies.</td>
			<td>TSP530660</td>
			<td>Inner Diameter 536&#181;m, Outer Diameter 660&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 500 &#181;L luer Lock GASTIGHT</td>
			<td>Hamilton Syringe Company</td>
			<td>1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rotatory mixer</td>
			<td>Labinco</td>
			<td>28210109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulation Set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damped Optical Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>used as support of microscope to prevent external vibrations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP 2</td>
			<td>The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Mitutoyo Corporation</td>
			<td>350-354-10</td>
			<td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass water reservoir (100 ml)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for sucrose and amphiphile solution preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810146C</td>
			<td>Rhodamine tagged lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroformation set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L glass capillary ringcaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9600110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H Grease</td>
			<td>Apiezon</td>
			<td>Apiezon H Grease</td>
			<td>Silicon-free grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide coated glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>703184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN2138R1</td>
			<td>0.8 x 38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohmmeter (Multimeter)</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>VC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28676.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

Jätte blåsor som erhålls från fosfolipider och sampolymerer kan utnyttjas i olika tillämpningar: kontrollerad och målinriktad läkemedelsleverans, Biomolekylär erkännande inom biosensorer för diagnostik, funktionella membran för konstgjorda celler och utveckling av bioinspirerade mikro-/nanoreaktorer. I alla dessa tillämpningar är karaktäriseringen av deras membran egenskaper av fundamental betydelse. Bland befintliga karakterisering tekniker, micropipett aspiration, pionjärer genom E. Evans, gör det möjligt att mäta mekaniska egenskaper av membranet såsom område sammanpressbarhet Modulus, böjning Modulus och lysis stress och stam. Här presenterar vi alla metoder och detaljerade förfaranden för att få jätte blåsor från den tunna filmen av en lipid eller sampolymer (eller båda), tillverkning och ytbehandling av Mikropipetter, och aspiration förfarande som leder till mätning av alla parametrar som tidigare nämnts.

Med protokollet ovan har vi studerat olika syntetiska jätte små vesikel (GUV), som erhållits från en fosfolipid: 2-oleoyl-1-palmitoyl-SN-glycero-3-fosfokolin (POPC), en triblocksampolymer: poly (etylenoxid)-b-poly (dimetylsiloxan)-b-poly (etyleneoxid) (PEO12-b-PDMS43-b-Peo12) syntetiseras i en tidigare studie13, och en diblock sampolymer poly (dimetylsiloxan)-b-poly ( etyleno...

Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Målet med protokollet är att på ett tillförlitligt sätt mäta membran mekaniska egenskaper hos gigantiska vesikler genom micropipett aspiration.

Obtention av gigantiska unilamellar hybrid blåsor genom Elektroformation och mätning av deras mekaniska egenskaper genom Micropipett aspiration

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Detta protokoll underlättar en tillförlitlig mätning av membranets mekaniska egenskaper hos syntetiska och verkliga polymer lipid vesikel med hjälp av en micropipette aspiration teknik. Detta är den enda teknik som gör att membran flexibilitet och instabilitet som skall sträckas att bedömas i enstaka experiment. Detta protokoll innebär en rad förfaranden från vesikelpreparering till den mekaniska bedömningen.Det är mycket viktigt att ha tålamod och att lösa eventuella tekniska frågor när de uppstår. Visualisering på dessa tekniker är avgörande för att förstå hur man korrekt behandla kapillärytan och hur man utför den obligatoriska prestress steg. Visar upp vesikel utan defekter.Demonstrera förfarande kommer att Martin Fauquignon, en doktorand från laboratoriet arbetar med utvecklingen av hybrid polymer lipid vesiklar. Innan du börjar förfarandet placera kallt glas mikropipette kapillärer vertikalt i hållare. Och sänk innehavarna tills spetsarna är nedsänkta i nyberedda glukos bovin serum albumin lösning över natten.Nästa morgon lösningen borde ha stigit ungefär en centimeter i spetsarna genom kapillärverkan. Med hjälp av en 500 mikroliterglasspruta, utrustad med en flexibel smält kiseldioxid kapillär, fylla varje pipett med glukoslösningen. Aspirera sedan lösningen från varje pipetten, innan pipetterna fylls på med färsk glukoslösning flera gånger tills allt serumet som tagits bort.För att förbereda en elektroformationskammare, först rengör ITO glider med en lämplig organisk lösningsmedel, och identifiera den ledande ytan med en Ohmeter. Fäst elektriska ledningar på den ledande sidan av varje objektglas med självhäftande tejp. Doppa en kapillär i ampivial lösning tills ca 5 mikroliter av lösningen har samlats in genom kapillärverkan.Placera den laddade kapillären i kontakt med mitten av en glas ITO-platta och sprid försiktigt lösningen över rutschkanan. När lösningsmedlet har helt avdunstat, applicera lösningen ytterligare två gånger som bara visats. innan ett lager av kiselfritt fett läggs på båda sidor om den öppnade O-ringsdidern runt området för deposition.Därefter placera ledande ansikte av en andra ITO glasskiva på toppen av distansen, och placera elektroformationskammaren under vakuum i 3 timmar för att ta bort eventuella spår av organiskt lösningsmedel. För elektroformation av Giant Unilamellar Vesicles, Plug de elektriska ledningarna i generatorn. Ställ generatorn frekvensen till 10 Hertz, och amplituden till 2 Volt, topp till topp.När spänningen har ställts in, använd en spruta utrustad med en 0,8 millimeters innerdiameter nål för att injicera en milliliter av 0,1 molar sackaroslösning i kammaren, och lämna kammaren under den anbringade spänningen och frekvensen i 75 minuter. I slutet av elektroformationen, stäng av generatorn. Och använd en milliliter sprutan att aspirera en liten volym av lösning tills en luftbubbla produceras inne i kammaren.Luta kammaren något för att flytta bubblan in i kammaren, och för att hjälpa vesiklarna lossna från glidytan. Och aspirera hela volymen av lösning i sprutan. Sedan överför vesikellösningen till ett en milliliter plaströr.För att ställa in materialen för mikromanipulationen, aspirera för att skapa ett vattenflöde, en tank av rent vatten, till en hållare. Och lätt peka samtidigt höja tanken för att eliminera eventuella luftbubblor, och för att skapa positivt tryck. Fyll en serumbelagd kapillär med färsk glukoslösning tills en droppe bildas i spetsen.Ta bort sprutslangen från metallhållaren för att skapa ett lätt vattenflöde i slutet av hållaren, och vänd kapillären upp och ner för att ansluta glukosdroppsan till vattenflödet. Skruva sedan ihop kapillären och hållaren. För att positionera pipetten limmar du två glasglas från ett specialtillverkat aluminiumsteg tillsammans med vakuumfett.Och installera bilderna på ett mikroskop skede. Med hjälp av en milliliterpipett, bilda en menisk mellan de två bilderna med 0,1 molar glukos. Placera pipetten och dess hållare på mikromanipulatorns motorenhet.Dra åt klämvredet, och använd styrspaken för kontrollpanelen i grovt läge. Sänk mikropipette nära glukos menisken. Använd finläget för att justera spetsens läge till mitten av menisken.Sänk ner spetsen i glukosen för att rengöra dess yttre och inre ytor. Efter några minuter, dra tillbaka kapillären från menisken och ersätta glukos med en färsk menisk. Aspirera två mikroliter av Giant Unilamellar Vesicles i 0,1 molar sackaros, till en 20 milliliter mikropipette spets.För in vesiklarna i menisken. Använd mikroskopet för att observera vesiklarna längst ner i objektglaskammaren. När vesiklarna är något tömda, sätt in sugpipetten igen och fokusera på pipettens spets.Ställ sedan in vattentankens baslinjehöjd till det tryck vid vilket partiklarnas rörelse stoppas. Omge menisken med mineralolja för att förhindra avdunstning. För att utföra ett mikropipette aspirationsexperiment, sänk pipettspetsen i menisken.Skapa en liten mängd sugtryck för att aspirera en vesicle. Membranet i den valda vesikel bör något fluktuera och bör inte presentera några synliga defekter. Använd mikromanipulatorn för att höja pipetten till en högre nivå för att isolera den aspirerade vesikel från andra vesiklar.Sänk vattentanken till cirka 10 centimeter för att förstressa vesikel innan du höjer tanken för att återgå trycket till det initiala värdet. Från en höjd av 0,5 centimeter, långsamt minska sugtrycket tills ett tryck vid vilket membranet fluktuerar nås. Öka sedan trycket för att tydligt visualisera en tunga i spetsen, projektionslängden hos några mikrometer.För att bestämma böjmodulus, öka sugtrycket, en mikrometer i taget på ett stegvis sätt. Tills 0,5 till 0,8 milliNewtons per meter nås. Väntar fem sekunder, och tar en ögonblicksbild av tungan efter varje steg.För att bestämma området kompressibilitet modulus, och lys spänning och stam fortsätta att öka sugtrycket från 0,5 milliNewtons per meter tills bristning spänningen nås. I detta representativa experiment området compressibility modulus och lysis stam för POPC var i perfekt överenskommelse med det som förväntas från litteraturen. I denna tabell typiska värden för polymeromerna erhållna kan observeras.Observera att segheten i membranet som erhålls från diblock copolymers är långt större än de som erhålls från Triblock copolymer. Intressant, med hjälp av diblock copolymer, är det möjligt att få en Giant Hybrid Unilamilar Lipid Polymer Vesicles som visar en mer robust seghet än den som mäts för liposomer. Detta protokoll kan vara till hjälp för att mäta vesikel med en pipett, till exempel för att mäta membranets permeabilitet genom asmatisk chock.Var noga med att slutföra varje steg med stringens och precision, särskilt när du ställer in tribunen anslutning. Denna teknik har utnyttjats för att förstå fysiskt ursprung av membranklysion, genom mätning av linjespänning vid de viktigaste gränserna i modifierade vesiklar.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Fabricating Nanogaps by Nanoskiving

Fabricating Nanogaps genom Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildning av Beställda Biomolecular Structures av självorganisering av korta peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Syntes av icke-likformigt Pr-dopade SrTiOa<sub&gt; 3</sub&gt; Keramik och deras Termo Egenskaper

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Syntes och karakterisering av Fe-dopad Aluminatsilikat Nanorör med förbättrad elektronledande egenskaper

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Mätning av partikelstorleksfördelning i grumliga lösningar genom dynamisk ljusspridning Mikroskopi

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -belagda ihåliga glasmikrosfärer med superhydrofob och High IR-reflekterande egenskaper syntetiserades genom ett Soft-kemi Metod

This manuscript proposes a soft-chemistry method to develop superhydrophobic and highly IR-reflective hollow glass microspheres (HGM). The anatase TiO2 ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Tillverkning och provning av fotoniska termometrar

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Förberedelse och karakterisering av C60/Graphene Hybrid nanostrukturer

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membranet omdaning av gigantiska blåsor som svar på lokaliserade kalcium Jon övertoningar

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Förgrymmat höghållfasta sampolymer Aramid fibrer för att möjliggöra bestämning av mekaniska egenskaper

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...