Name: obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Yazarlar minnetle mali destek (ANR Sysa) için ANR kabul.

1. Mikropipetlerin imalatı
NOT: Burada iç çapı 6 ila 12 mm arasında değişen ve 3-4 mm civarında konik uzunluğu olan mikropipetler gereklidir. Mikropipet in iã§in ayrÄ±ntÄ±lÄ± bir yöntem aşağıda veå tirilere tanÄ±mlanmÄ±Å tÄ±r.
<ol><li>Borosilikat cam kılcal yerleştirin çekmece çekmecesine ve bir ucunu knob sıkarak düzeltmek.</li>
	<li>Bardağı ısıtıcı haznesinin kenarındaki deliklerden dikkatlice kaydırın.</li>
	<li>Diğer uçtaki kelepçeucunu sık...

<ol>
	<li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids.">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li><li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+vesicles.">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li><li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+vesicles+from+block+copolymers.">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li><li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+polymer/lipid+vesicles:+state+of+the+art+and+future+perspectives.">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li><li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Hybrid+Lipid/Polymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform.">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li><li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles.">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li><li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes.">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li><li>Rodr&#237;guez-Garc&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability.">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods.">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li><li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes.">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li><li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes.">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer/lipid+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs).">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li><li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+lipid+bilayers:+theory+and+possible+experiments.">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li><li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+(GHUVs)+does+not+systematically+lead+to+&amp;#34;intermediate''+membrane+properties.">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &amp;#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li><li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L&#945;+and+L&#945;-Gel+Coexistence+Regimes.">Material Studies of Lipid Vesicles in the L&#945; and L&#945;-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li><li>Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).</li><li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles:+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae,+but+with+mechanical+stability+and+control.">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li><li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes.">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li><li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+behavior+of+membranes+with+sterols.">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li><li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity,+Stability,+and+Area/Molecule:&#8201;+A+Micropipet+Aspiration+Approach.">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:&#8201; A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li><li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity.">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li></ol>

Mikropipetin kaplaması güvenilir ölçümler elde etmek için önemli noktalardan biridir. Mikropipet vezikül yapışması önlenmelidir, ve bir kaplama yaygın literatürde kullanılır17,18,19,20,21, BSA ile, β-kazein veya surfasil. Kaplama prosedürünün ayrıntıları nadiren belirtilir.
BSA'nın çözülmesi iyi bir isolif...

Fosfolipidlerden elde edilen dev veziküller (lipozomlar) 1970'lerden beri temel hücre zarı modeli1olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. 1990'ların sonlarında, kopolimerlerin kendi kendine biraraya gelen vesiküler morfolojileri, lipid analoglarına referans olarak polimeromlar olarak adlandırılan2,3, hızla zayıf mekanik stabilite ve zayıf modüler kimyasal işlevselliğe sahip lipozomlara ilginç bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, ikinci fosfolipidler oluşur beri onların hücre biyomimetik karakteri oldukça lipozomlar ile karşılaştırıldığında sınırlıdır, hücre zarının ana bileşeni. Ayrıca, düşük membran geçirgenliği, zar dan türlerin kontrollü difüzyonunun gerekli olduğu ilaç dağıtımı gibi bazı uygulamalarda sorun olabilir. Son zamanlarda, blok kopolimerler ile fosfolipidlerin ilişki melez polimer-lipid veziküller ve membranlar tasarımı çalışmaların artan sayıda konu olmuştur4,5. Ana fikir sinerjik her bileşenin yararları birleştirmek varlıklar tasarlamaktır (biyo-işlevsellik ve polimer membranların mekanik istikrar ve kimyasal çok yönlülük ile lipid bilayers geçirgenlik), hangi farklı uygulamalarda istismar edilebilir: kontrollü ve hedefli ilaç teslimatı, tanı için biyosensörler içinde biyomoleküler tanıma, yapay hücreler için fonksiyonel membranlar, biyo-ilham mikro-nano-reaktörlerin geliştirilmesi.
Günümüzde, farklı bilimsel topluluklar (biyokimyacılar, kimyagerler, biyofizikçiler, fiziko-kimyagerler, biyologlar) daha gelişmiş bir hücre zarı modelinin geliştirilmesine olan ilgiartmaktadır. Burada, amacımız, mümkün olduğunca ayrıntılı olarak, mevcut metodolojileri (elektroformasyon, mikropipette aspirasyon) elde etmek ve dev veziküllerin mekanik özellikleri ve hibrid polimer lipid dev veziküller olan son "gelişmiş" hücre zarı modelleri karakterizesunmaktır 4,5.
Bu yöntemlerin amacı, membranın alan sıkıştırılabilirliğinin ve bükülme modulisinin güvenilir bir şekilde ölçülmesinin yanı sıra, membranın lysis gerilimi ve gerilmelerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlamaktır. Dev bir vezikül bükme sertliğini ölçmek için mevcut en yaygın tekniklerden biri dalgalanma analizi6,7, doğrudan video mikroskop gözlemdayalı; ancak bu büyük görünür membran dalgalanması gerektirir ve kalın membranlar (örn. polimeromlar) üzerinde sistematik olarak elde edilmez. Alan sıkıştırılabilirlik modülü deneysel Langmuir Blodgett tekniği kullanılarak belirlenebilir ama en sık bir monolayer8. Mikropipet aspirasyon tekniği, bir deneyde dev unilamellar vezikül (GUV) oluşturan iki katmanlı bir modüler in ölçülmesine olanak sağlar.
Aşağıdaki yöntem, iki katmanlı ve dolayısıyla elektroformasyon ile veziküller oluşturabilen tüm amfilik moleküller veya makromoleküller için uygundur. Bu elektroformasyon sıcaklığında iki katmanlı bir sıvı karakteri gerektirir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required equipment and materials for micropipette design</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filament installed</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>NARISHGE Co.</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>fitted with two objectives (10x and 32x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for coating pipette tips with BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 10 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>626616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 5 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable acetate cellulose filter</td>
			<td>Cluzeau Info Labo</td>
			<td>L5003SPA</td>
			<td>Pore size: 0.22&#181;m, diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies.</td>
			<td>TSP530660</td>
			<td>Inner Diameter 536&#181;m, Outer Diameter 660&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 500 &#181;L luer Lock GASTIGHT</td>
			<td>Hamilton Syringe Company</td>
			<td>1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rotatory mixer</td>
			<td>Labinco</td>
			<td>28210109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulation Set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damped Optical Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>used as support of microscope to prevent external vibrations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP 2</td>
			<td>The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Mitutoyo Corporation</td>
			<td>350-354-10</td>
			<td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass water reservoir (100 ml)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for sucrose and amphiphile solution preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810146C</td>
			<td>Rhodamine tagged lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroformation set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L glass capillary ringcaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9600110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml syringe Luer Tip</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H Grease</td>
			<td>Apiezon</td>
			<td>Apiezon H Grease</td>
			<td>Silicon-free grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide coated glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>703184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN2138R1</td>
			<td>0.8 x 38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohmmeter (Multimeter)</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>VC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28676.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtention of giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

Fosfolipidlerden ve kopolimerlerden elde edilen dev veziküller farklı uygulamalarda kullanılabilir: kontrollü ve hedefli ilaç dağıtımı, tanı için biyosensörler içinde biyomoleküler tanıma, yapay hücreler için fonksiyonel membranlar ve biyoilham mikro/nano-reaktörlerin geliştirilmesi. Tüm bu uygulamalarda membran özelliklerinin karakterizasyonu temel önemtaşımaktadır. Mevcut karakterizasyon teknikleri arasında, E. Evans'ın öncülük ettiği mikropipet aspirasyonu, membranın alan sıkıştırılabilirlik modülü, bükme modülü ve lysis gerilimi ve gerilme gibi mekanik özelliklerinin ölçülmesine olanak sağlar. Burada, bir lipid veya kopolimerin ince filmden (veya her ikisinden) dev veziküller elde etmek için tüm metodolojileri ve ayrıntılı prosedürleri, mikropipetlerin üretim ve yüzey işlemesini ve daha önce bahsedilen tüm parametrelerin ölçülmelerine yol açan aspirasyon prosedürünü saklı atıyoruz.

Yukarıda belirtilen protokolle, biz farklı sentetik dev unilamellar vezikül inceledik (GUV), bir fosfolipid elde: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC), bir triblok kopolimer: Poli (etilenoksit)-b-Poli(dimethylsiloxane)-b-Poly(etilenoksit) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) bir önceki çalışmada sentezlenen13, ve bir diblock kopolimer Poli(dimethylsiloxane)-b-Poly( etil...

Watch this Scientific Journal Video about Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration at JoVE.com

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Protokolün amacı, dev veziküllerin membran mekanik özelliklerini mikropipet aspirasyonu ile güvenilir bir şekilde ölçmektir.

Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Bu protokol, mikropipet aspirasyon tekniği kullanılarak sentetik ve gerçek polimer lipid vezikülmembran mekanik özelliklerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesini kolaylaştırmaktadır. Bu, membran esnekliği ve kararsızlığının tek deneylerde değerlendirilmek üzere gerilmesine izin veren tek tekniktir. Bu protokol vezikül hazırlığından mekanik değerlendirmeye kadar bir dizi prosedür içerir.Sabırlı olmak ve ortaya çıkan her türlü teknik sorunu çözmek çok önemlidir. Bu teknikler üzerinde görselleştirme nasıl düzgün kılcal yüzey tedavi ve nasıl zorunlu prestress adım gerçekleştirmek için anlamak için önemlidir. Vezikül'ün hatasız ortaya çıkmasın.Gösterme prosedürü Martin Fauquignon, laboratuvar hibrid polimer lipid veziküllerin geliştirilmesi üzerinde çalışan bir doktora öğrencisi olacaktır. İşleme başlamadan önce soğuk cam mikropipet kılcal damarları dikey olarak tutuculara yerleştirin. Ve ipuçları bir gecede taze hazırlanmış glikoz sığır serum albumin çözeltisi batırılır kadar sahipleri düşürün.Ertesi sabah çözelti kılcal eylem ile ipuçları içine yaklaşık bir santimetre artmış olmalıdır. Esnek erimiş silika kılcal damar ile donatılmış 500 mikrolitrelik cam şırınga kullanarak, glikoz çözeltisi ile her pipet doldurun. Daha sonra her pipetten çözeltiyi aspire edin, pipetleri taze glikoz solüsyonu yla doldurmadan önce serumun tamamı çıkarılıncaya kadar birkaç kez.Bir elektroformasyon odası hazırlamak için, ilk uygun organik çözücü ile ITO slaytlar temiz ve bir Ohmetre ile iletken yüzeyi belirlemek. Yapışkan bantla her slaydın iletken tarafına elektrik telleri takın. Çözeltinin yaklaşık 5 mikrolitre kılcal eylem tarafından toplanana kadar ampivial çözelti içine bir kılcal daldırma.Yüklü kılcal damarı bir cam ITO plakasının ortasına yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça slayta doğru yayın. Çözücü tamamen buharlaştığında, çözeltiyi az önce gösterildiği gibi iki kez daha uygulayın. biriktirme alanı etrafında açılan O-ring spacer her iki tarafında silikonsuz gres tabakası eklemeden önce.Daha sonra, ikinci bir ITO cam plakanın iletken yüzünü boşluk tabakasının üstüne yerleştirin ve elektroformasyon odasını 3 saat vakum altına yerleştirin ve organik çözücü izlerini giderin. Dev Unilamellar Veziküllerin elektroformasyonu için elektrik kablolarını jeneratöre takın. Jeneratör frekansını 10 Hertz'e, genliğini 2 Volt'a ayarlayın.Voltaj ayarlandığında, 0,8 milimetrelik iç çaplı iğneyle donatılmış bir şırınga kullanarak hazneye 0,1 molar sakaroz çözeltisi mililitre enjekte edin ve odayı uygulanan voltaj ve frekansın altında 75 dakika bekletin. Elektroformasyonun sonunda jeneratörü kapatın. Ve bir mililitreşşonu kullanarak odanın içinde bir hava kabarcığı üretilene kadar küçük bir çözelti hacmini aspire edin.Kabarcığı odaya taşımak ve veziküllerin slayt yüzeyinden ayrılmasına yardımcı olmak için odayı hafifçe yatırın. Ve çözeltinin tüm hacmini şırıngaya aspire edin. Sonra, bir mililitreplastik tüp içine vezikül çözeltisi aktarın.Mikromanipülasyon için malzeme kurmak için, bir su akışı oluşturmak için aspire, saf su tankı, bir tutucu. Ve herhangi bir hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için tankı yükseltirken hafifçe dokunun, ve pozitif basınç oluşturmak için. Ucunda bir damla oluşana kadar taze glikoz çözeltisi ile serum kaplı kılcal doldurun.Tutucunun sonunda hafif bir su akışı oluşturmak için şırınga boruyu metal tutucudan çıkarın ve glikoz damlasını su akışına bağlamak için kılcal damarı ters çevirin. Sonra, kılcal ve tutucuyu birbirine vidalayın. Pipeti konumlandırmak için, vakum gresi ile birlikte özel yapım alüminyum sahneden iki cam slayt tutkal.Ve slaytları mikroskop aşamasına töyorum. Bir mililitrelik pipet kullanarak, 0.1 molar glikoz ile iki slayt arasında bir menisküs oluşturur. Pipeti ve tutucuyu mikromanipülatörün motor ünitesine yerleştirin.Sıkma tonunu sıkın ve kontrol paneli joystick'ini kaba modda kullanın. Glikoz menisküs yakın mikropipet indirin. Menisküs merkezine ucun konumunu ayarlamak için ince modu kullanın.Dış ve iç yüzeyleri temizlemek için glikoz ucu batırın. Birkaç dakika sonra, menisküs kılcal geri çekin ve taze bir menisküs ile glikoz değiştirin. 20 mililitrelik mikropipet ucuna 0,1 azı sakaroziçinde iki mikrolitre Dev Unilamellar Vezikülasi aspire edin.Vezikülleri menisküse sok. Slayt odasının altındaki vezikülleri gözlemlemek için mikroskobu kullanın. Veziküller hafifçe söndüğünde, emme pipetini yeniden takın ve pipetin ucuna odaklanın.Daha sonra su tankının taban çizgisi yüksekliğini parçacıkların hareketinin durdurulduğu basınca ayarlayın. Buharlaşmayı önlemek için menisküsleri mineral yağile çevreleyin. Bir mikropipet aspirasyon deneyi yapmak için, pipet ucunu menisküsiçine indirin.Bir vezikül aspire emme basıncı küçük bir miktar oluşturun. Seçilen vezikül membranı hafifçe dalgalanmalı ve görünür bir kusur bulunmamalıdır. Diğer veziküllerden aspire vezikül izole etmek için pipet daha yüksek bir seviyeye yükseltmek için mikromanipülatör kullanın.Suyu yaklaşık 10 santimetreye düşürerek vezikülün ilk değerine geri döndürmek için tankı yükseltmeden önce veziküle uygulayın. 0,5 santimetre yükseklikten, membranın dalgalandığı bir basınca kadar emme basıncını yavaşça düşürün. Sonra açıkça ucu, birkaç mikron projeksiyon uzunluğu bir dil görselleştirmek için basıncı artırmak.Bükme modülbelirlemek için, emiş basıncını artırın, adım adım bir şekilde bir seferde bir mikrometre. Metre başına 0,5 ila 0,8 miliNewton'a ulaşıncaya kadar. Beş saniye beklemek ve her adımdan sonra dilin fotoğrafını çekmek.Alan sıkıştırılabilirlik modülasyon belirlemek için, ve lysis gerginlik ve gerinim kopma gerilimi ulaşılıncaya kadar metre başına 0,5 miliNewton'dan emme basıncını artırmaya devam eder. Bu temsili deneyde POPC için alan sıkıştırılabilirlik modülü ve lysis zorlanma literatürden beklenen ile mükemmel bir uyum vardı. Bu tabloda elde edilen polimeromlar için tipik değerler gözlemlenebilir.Diblok kopolimerlerden elde edilen membranın tokluğunun triblok kopolimerden elde edilenlerden çok daha büyük olduğunu unutmayın. İlginçtir, diblock kopolimer kullanarak, bir Dev Hibrid Unilamilar Lipid Polimer Veziküller elde etmek mümkündür lipozomlar için ölçülen daha sağlam bir tokluk göstermek. Bu protokol, örneğin asmatik şok yoluyla membranın geçirgenliğini ölçmek için bir pipet ile vezikülölçümü için yararlı olabilir.Özellikle tribün bağlantısını kurarken her adımı titizlik ve hassasiyetle tamamladığınızdan emin olun. Bu teknik, modifiye veziküllerde ana sınırlardaki çizgi geriliminin ölçülmesi yoluyla membran fizyonunun fiziksel kökenini anlamak için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Fabricating Nanogaps by Nanoskiving

Nanoskiving tarafından Nanogaps imalatı

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Kısa Peptidlerinin Self-meclisi tarafından Sıralı Biyomoleküler Yapıların Oluşumu

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Muntazam olmayan biçimde Pr-katkılı SrTiO sentezi<sub&gt; 3</sub&gt; Seramik ve Bunların termoelektrik Özellikleri

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Geliştirilmiş Elektron İletken özellikleri ile Fe-katkılı Alüminosilikat Nanotüpler Sentezi ve Karakterizasyonu

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Dinamik ışık saçılımı Mikroskopi Bulanık Çözümleri Tane Büyüklüğü Dağılımının Ölçümü

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO2-coated Hollow Glass Microspheres with Superhydrophobic and High IR-reflective Properties Synthesized by a Soft-chemistry Method

TiO<sub&gt; 2</subBir Yumuşak kimya Yöntemi ile Sentezlenen Süper hidrofobik ve High IR-yansıtıcı özellikleri ile&gt; -kaplı çukur cam Mikrokürelerinin

This manuscript proposes a soft-chemistry method to develop superhydrophobic and highly IR-reflective hollow glass microspheres (HGM). The anatase TiO2 ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

İmalat ve fotonik termometreler test

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

C60/Graphene hibrid nanoyapıların malzemelerin hazırlık ve

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Disentangling yüksek mukavemetli kopolimer Aramid Elyaf mekanik özelliklerinin belirlenmesi etkinleştirmek için

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...