Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et stipendium fra ministeriet for videnskab og teknologi (105-2628-E-400-001-MY2), og Ph.D.-programmet i vævsteknik og regenerativ medicin, national Chung Hsing University og nationale sundheds forskningsinstitutioner.

1. fabrikation af en wafer skimmel ved Soft litografi
Bemærk: data for maske mønstre er tilgængelige i vores tidligere publikation14.
<ol><li>Der dehydreres en 4-tommer silicium wafer i en 120 °C ovn i 15 min.</li>
	<li>Spin coat 4 g af Su-8 2 negativ fotoresist på en 4-tommer silicium wafer på 1.000 rpm for 30 s at skabe et 5 μm tykt lag (Layer #1).</li>
	<li>Blødt bage lag #1 på en 65 °C kogeplade i 1 min og derefter overføre lag #1 til en 95 °C kogeplad...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Den intercellulære interaktioner mellem forskellige celler i tumor mikromiljø spiller en vigtig rolle i progression af tumoren17. For at forstå mekanismen for celle celle interaktioner anvendes Co-kultur systemer som en fælles analytisk metode. Men, flere celletyper og heterogenitet af cellerne selv har ført til eksperimentel kompleksitet og analytiske vanskeligheder.
Den hydrodynamiske fjer-chip gør det muligt at indlæse flere enkeltceller i kultur kammeret ved ...

Effektiv opsamling af forskellige typer af enkeltceller og tilvejebringelse af tilstrækkelig kulturplads er nødvendig for enkelt celle-samkultur eksperimenter med flere typer enkeltceller1. Begrænsning fortynding er den mest almindeligt anvendte metode til at forberede de enkelte celler til sådanne eksperimenter, på grund af de lave omkostninger til udstyr, der kræves. Men på grund af Poisson fordeling begrænsning, den maksimale enkelt celle erhvervelse sandsynlighed er kun 37%, hvilket gør den eksperimentelle operation omstændelig og tidskrævende2. I modsætning hertil, ved hjælp af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) kan overvinde Poisson fordeling begrænsning til højt effektivt forberede enkeltceller3. Men, FACS kan ikke være tilgængelig for nogle laboratorier på grund af dyre instrumentering og vedligeholdelse omkostninger. Mikrofabrikerede enheder er for nylig blevet udviklet til enkelt celle diffusering4, enkelt celle parring5, og enkelt cellekultur applikationer. Disse enheder er fordelagtige baseret på deres evne til præcist at manipulere enkeltceller6, udføre høj gennemløb eksperimenter, eller reducere prøve og reagensforbrug. Men at udføre enkelt celle-Co-kultur eksperimenter med flere celletyper med de nuværende mikrofluidisk enheder er stadig udfordrende på grund af begrænsningen af Poisson distribution1,7,8, eller manglende evne til enhederne til at fange mere end to typer af enkeltceller4,5,6,9,10.
For eksempel, Yoon et al. rapporteret en mikrofluidisk enhed til celle-celle interaktion undersøgelse11. Denne enhed bruger probabilistisk metode til at parre celler i et kammer. Men det kan kun opnå parring af to forskellige celletyper på grund af geometriske begrænsninger i enhedens struktur. En anden rapport fra Lee et al. viste en deterministisk metode til opsamling og parring af enkeltceller12. Denne enhed øger parrings effektiviteten ved deterministisk metode, men den er begrænset af den forlængede Operations tid, der kræves for at parre celler. Specifikt kan den anden celle opsamling kun udføres efter den første erobrede celle er fastgjort til overfladen efter 24 h. Zhao et al. rapporterede en dråbe baseret mikrofluidisk enhed til at fange to typer af en enkelt celle13. Vi kan konstateret, at den dråbe baserede mikrofluidisk-enhed stadig er begrænset til Poisson-distributionen og kun kan anvendes på ikke-tilknyttede celler, og det er ikke muligt at ændre kultur opløsningen under dyrknings processen.
Tidligere har vi udviklet en mikrofluidic "Hydrodynamisk fjerbold chip", der udnytter deterministiske hydrodynamiske kræfter til at fange flere typer enkelt celle i kultur kammeret og efterfølgende kan udføre celle Co-kultur eksperiment for at analysere individuel celle migrering adfærd under celle-celle interaktioner14. Den hydrodynamiske fjer-chip består af et klædt sæt af enheder, der hver indeholder en Serpentine by-pass kanal, en Capture-site, og et kultur kammer. Ved at bruge forskellen i strømnings modstanden mellem Serpentine by-pass-kanalen og kultur kammeret og en specielt designet Operations procedure kan forskellige typer enkeltceller gentagne gange optages i kultur kammeret. Især den rigelige plads i kultur kammeret kan ikke kun forhindre cellen i at blive skyllet under celle opsamling, men også give tilstrækkelig plads til cellerne til at sprede, formere sig og migrere, giver mulighed for observation af levende enkelt celle interaktioner. I denne artikel fokuserer vi på produktionen af denne enhed og detaljerede protokol trin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Celle Co-kultur assays har været meget anvendt til at studere celle-celle interaktioner mellem forskellige celletyper til bedre at forstå biologi af sygdomme, herunder kræft. Det er imidlertid udfordrende at præcisere den komplekse mekanisme for intercellulære interaktioner i meget heterogene cellepopulationer ved hjælp af konventionelle Co-kultur systemer, fordi heterogeniteten af cellernes delpopulation er skjult af gennemsnitsværdierne; de konventionelle Co-kultur systemer kan kun bruges til at beskrive befolkningens signal, men er ude af stand til at spore individuelle celler adfærd. Endvidere, konventionelle enkelt-celle eksperimentelle metoder har lav effektivitet i celle manipulation på grund af Poisson fordeling. Mikrofabrikerede enheder er en ny teknologi til enkelt celle undersøgelser, fordi de præcist kan manipulere enkeltceller ved høj gennemløb og kan reducere prøve-og reagensforbruget. Her beskriver vi konceptet og anvendelsen af en mikrofluidisk chip til flere enkelt celle-Co-kulturer. Chippen kan effektivt fange flere typer af enkeltceller i et kultur kammer (~ 46%) og har et tilstrækkeligt kultur område, der er nyttigt til at studere cellernes adfærd (f. eks. migration, spredning osv.) under celle celle interaktion på enkelt celleniveau. Lymfatiske endotelceller og oralt planocellulært karcinom blev anvendt til at udføre et samkultur eksperiment med én celle på den mikrofluidiske platform til levende flere enkelt celle interaktionsstudier.

Enheden har en trelags struktur som vist ved tværsnit fotografiet af en cut PDMS enhed (figur 1a). Det første lag indeholder et opsamlingssted (6,0 μm i bredden og 4,6 μm i højden), der forbinder kultur kammeret og by-pass kanalen. Forskellen i strømnings modstanden mellem kultur kammeret og by-pass-kanalen bevirker, at cellerne flyder ind i opsamlings positionen og fylder indgangen til den lille sti. Når en celle er fanget ved erobrin...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Denne rapport beskriver en mikrofluidisk chip-baseret metode til at oprette et enkelt cellekultur eksperiment, hvor højeffektiv parring og mikroskopisk analyse af flere enkeltceller kan opnås.

Etablering af enkelt cellebaserede Co-kulturer på en deterministisk måde med en Mikrofluidisk chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Det er afgørende effektivt at kombinere fange effektivitet med dynamisk levende celle billedobservation at forstå effekten af celle-celle interaktion på celle adfærd. Dette rør kan meget effektivt fange flere enkelte celler i et større kammer, og give en tilstrækkelig kultur base, for dynamisk sporing af flere enkelt-celle interaktion adfærd. Start med at forberede PDMS-enheden.Placer en wafer skimmel i vejning fad med 100 mikroliter af trichlorosilane i en ekssiccator og anvende et vakuum i 15 minutter. Stop vakuum og saltinize wafer skimmel i eksiccator ved 37 grader Celsius i mindst en time. Bland PDMS base og PDMS hærdningsmiddel i et forhold på ti til en, derefter hældes i alt 20 gram af blandingen på wafer skimmel i en 15-centimeter skål.Placer 15-centimeter parabol i en eksikor og anvende et vakuum i halvandet minut. Fjern derefter skålen fra ekssiccatoren og eliminer resterende luftbobler i PDMS med nitrogengas. Hærd PDMS ved at placere skålen i en ovn ved 65 grader celsius i to til fire timer.Når du er færdig, skal du fjerne PDMS replika fra wafer skimmel, og punch en 1,5-millimeter indløb og 0,5-millimeter stikkontakt på PDMS. Rengør PDMS-replikaen og diasoverfladen med aftageligt tape. Behandl overfladen med iltplasma.Juster derefter PDMS-replikaen manuelt med diaset, og kom dem i kontakt med hinanden. Lad PDMS dias i 65 grader Celsius ovn for en dag. Den næste dag skal PDMS-enheden nedsænkes i en beholder fyldt med PBS.Placer den i ekssiccatoren, og påfør vakuum i 15 minutter. Flyt enheden til en cellekulturhætte, og steriliser den med UV-lys i 30 minutter. Udskift PDMS-enhedsbufferen med medium, og inkuber den ved fire grader Celsius i en dag.Når cellerne opnår 70 til 80%sammenløb, fjernes kulturmediet og forsigtigt vaskes tre gange med fem milliliter PBS. Der tilsættes en milliliter DMEM/F-12-medium, der indeholder et mikromolarlymulorescerende farvestof, til WNT5B sh4- og pLKO-GFP-cellerne, og de inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubationen vaskes cellerne forsigtigt tre gange med fem milliliter steril PBS, PBS fjernes, og der tilsættes to milliliter 0,25%Trypsin-EDTA.Inkuber cellerne i fire minutter ved stuetemperatur, og tryk derefter forsigtigt på kulturskålen for at fremme celleafrivelse. Tilsæt fire milliliter DMEM/F-12 medium for at sprede WNT5B sh4 og pLKO-GFP celler, overføre cellerne til et 15-milliliterrør og centrifugere dem ved 300 xg i tre minutter. Fjern supernatanten, og ophæng forsigtigt cellepellet igen i en milliliter DMEM/F-12-medium.Der klargør en milliliter cellesuspension ved en koncentration på tre gange ti til femte celler pr. milliliter, og den opbevares på is for at forhindre cellesammenlægning. Tilslut polytetrafluorethylenrøret mellem enhedens udløb og sprøjtepumpen. Fjern mediet, og tilsæt en mikroliter af den forberedte cellesuspension i PDMS-enhedens indløb.Dernæst skal du lægge cellesuspensionen ind i enheden ved hjælp af en sprøjtepumpe med en strømningshastighed på 0,3 mikroliter pr. minut. Tilføj en mikroliter DMEM/F-12 medium i indløbet af enheden, derefter indlæse mediet i enheden ved hjælp af en sprøjte pumpe. Læg 0,3 mikroliter DMEM/F12-medium i enheden med sprøjtepumpen med en strømningshastighed på 10 mikroliter pr. minut.Når cellerne er indlæst, skal du fjerne røret og forsegle indløbet og udløb med polyolefin tape for at skabe et lukket kultursystem. Flyt PDMS-enheden til en 10-centimeters kulturskål, og tilsæt 10 milliliter steril PBS rundt om enheden for at undgå fordampning af medium. Overfør kulturskålen til en kuvøse for tredobbelt encellet kultur.PDMS-enheden har en trelagsstruktur med et hentningswebsted, der opretter forbindelse til kulturkammeret og bypass-kanalen. Forskellen i flowmodstand mellem kulturkammeret og bypass-kanalen gør det muligt for cellen at flyde ind i opsamlingspositionen, hvilket får følgende celle til at gå gennem bypass-kanalen til det næste erobringssted. Reflukstrinnet bruges til at frigøre cellen fra opsamlingsstedet og sende den ind i kulturkammeret.Effektiviteten af cellefangst af denne protokol blev evalueret på tre forskellige celletyper. Humane lymfe endotelceller, eller LEC'er, humane orale planocellulært karcinom T2.6 celler udtrykker WNT5B-specifikke kort hårnål RNA, og pLKO-GFP vektor kontrolceller. De encellede indfangningseffektiviteter for de tre viste celler var ca. 71% for LEC'erne, 74% for WNT5B sh4 celler og 78% for pLKO-GFP celler.Den tredobbelte encellede opsamlingseffektivitet var 48%Denne metode kan bruges til flere encellede samkulturer af lymfecelledeksaktelialceller og planocellulologiske kræftceller, og cellens spredning og morfologi kan observeres under et mikroskop. Det er vigtigt at sikre, at de forberedte cellesuspensioner har minimale celleaggregerede, fordi celle aggregater ikke kun reducerer enkeltparingseffektiviteten, men også kan blokere mikrokanalerne. Cellecelleinteraktion mellem de enkelte celler spiller en vigtig rolle i styringen af cellernes adfærd.Vores metode kan være et effektivt værktøj til at hjælpe forskere med at studere celleinteraktion på et enkelt celleniveau, hvilket kan føre til opdagelsen af nye mekanismer, som ikke let kan opnås fra befolkningsbaserede undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Mikrofluid Chip til Alsidig kemisk analyse af enkelte celler

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fremstilling af polymere og biohybridfibre med foruddefineret størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En Mikrofluid Chip for ICPMS Sample Introduktion

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier af lungecancerceller ved hjælp af en Multichannel Dual-elektriske-felt Mikrofluid Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur af Living microbiome med Microengineered Menneskelig Intestinal Villi i en Gut-on-a-Chip mikrofluidanordning

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Image-styret, Laser-baserede Fremstilling af vaskulær-afledte Mikrofluid Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Tør Film Photoresist-baserede elektrokemisk mikrofluid Biosensor Platform: Enhed fabrikation, On-chip Assay forberedelse og drift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...