Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het ministerie van Wetenschappen en technologie (105-2628-E-400-001-MY2), en het Ph.D. programma in weefsel engineering en regeneratieve geneeskunde, nationale Chung Hsing University en National Health Research instituten.

1. fabricage van een wafer Mold door zachte lithografie
Opmerking: masker patroon gegevens zijn beschikbaar in onze vorige publicatie14.
<ol><li>Dehydraat een 4-inch silicium wafer in een oven van 120 °C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Spin Coat 4 g van Su-8 2 Negative fotoresist op een 4-inch silicium wafer bij 1.000 rpm voor 30 s om een 5 μm dikke laag te maken (Layer #1).</li>
	<li>Soft Bake Layer #1 op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 minuut en breng vervolgens ...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

De intercellulaire interacties van verschillende cellen in de tumor micro omgeving spelen een belangrijke rol in de progressie van de tumor17. Om het mechanisme van celcelinteracties te begrijpen, worden co-cultuur systemen gebruikt als een gemeenschappelijke analytische methode. Echter, meerdere celtypen en de heterogeniteit van de cellen zelf hebben geleid tot experimentele complexiteit en analytische moeilijkheden.
De hydrodynamische pendelen chip laat meerdere eence...

Efficiënte inname van verschillende soorten afzonderlijke cellen en het verstrekken van voldoende cultuur ruimte zijn nodig voor co-cultuur experimenten met één cel van meerdere typen enkelvoudige cellen1. Beperkende verdunning is de meest gebruikte methode om de afzonderlijke cellen voor dergelijke experimenten voor te bereiden, vanwege de lage kosten van de benodigde apparatuur. Vanwege de Poisson-verdelings beperking is de maximale kans op een enkelvoudige celverwerving echter slechts 37%, waardoor de experimentele operatie moeizaam en tijdrovend is2. Daarentegen kan het gebruik van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) de Poisson-verdelings begrenzing overwinnen tot hoog-efficiënt enkelvoudige cellen voorbereiden3. FACS is echter mogelijk niet toegankelijk voor sommige laboratoria vanwege dure instrumentatie-en onderhoudskosten. Micro fabricaat-apparaten zijn onlangs ontwikkeld voor single cell-overvulling4, eencellige pairing5en toepassingen voor één celcultuur. Deze apparaten zijn voordelig op basis van hun vermogen om nauwkeurig individuele cellen te manipuleren6, uitvoeren van experimenten met hoge doorvoer, of verminderen van monster en reagens verbruik. Het uitvoeren van eencellige co-cultuur experimenten met meerdere celtypen met de huidige microfluïdische apparaten is echter nog steeds een uitdaging vanwege de beperking van Poisson-distributie1,7,8of het onvermogen van de apparaten om meer dan twee soorten afzonderlijke cellen vast te leggen4,5,6,9,10.
Bijvoorbeeld, Yoon et al. rapporteerde een microfluïdisch apparaat voor cel-cel interactiestudie11. Dit apparaat gebruikt de probabilistische-methode om cellen in één kamer te koppelen. Het kan echter alleen de koppeling van twee verschillende celtypen bereiken vanwege geometrische beperkingen in de apparaatstructuur. Een ander verslag van Lee et al. demonstreerde een deterministische methode om enkelvoudige cellen vast te leggen en te koppelen12. Dit apparaat verhoogt de koppel efficiëntie door de deterministische methode, maar het wordt beperkt door de verlengde bewerkingstijd die nodig is om cellen te koppelen. Specifiek, de tweede cel Capture kan alleen worden uitgevoerd nadat de eerste vastgelegde cel is bevestigd aan het oppervlak na 24 h. Zhao et al. rapporteerde een op droplet gebaseerd microfluïdisch apparaat om twee typen van één cel13vast te leggen. We kunnen vinden dat het op druppel gebaseerde microfluïdische apparaat nog steeds beperkt is tot de Poisson-verdeling en alleen kan worden gebruikt op niet-aangehechte cellen, en het is niet mogelijk om de cultuur oplossing tijdens het teeltproces te veranderen.
Eerder hebben we een microfluïdische "hydrodynamische pendelen chip" ontwikkeld die deterministische hydrodynamische krachten gebruikt om meerdere soorten eencellige in de cultuur kamer vast te leggen en vervolgens celco-cultuur experiment kan uitvoeren om te analyseren individuele Celmigratie gedrag onder celcelinteracties14. De hydrodynamische pendelen chip bestaat uit een reeks eenheden die elk een serpentine by-pass kanaal, een Capture-site en een cultuur kamer bevat. Door gebruik te maken van het verschil in stromingsweerstand tussen het serpentine by-pass kanaal en de kweekkamer, en een speciaal ontworpen operatie procedure, kunnen verschillende soorten enkelvoudige cellen herhaaldelijk in de kweekkamer worden gevangen. Met name de ruime ruimte van de cultuur kamer kan niet alleen voorkomen dat de cel wordt gespoeld tijdens het vastleggen van de cel, maar biedt ook voldoende ruimte voor de cellen om te verspreiden, te vermenigvuldigen en te migreren, waardoor het observeren van Live eencellige interacties mogelijk is. In dit artikel richten we ons op de productie van dit apparaat en gedetailleerde protocol stappen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Celco-cultuur assays zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van celcelinteracties tussen verschillende celtypen om beter te begrijpen van de biologie van ziekten met inbegrip van Cancer. Het is echter een uitdaging om het complexe mechanisme van intercellulaire interacties in zeer heterogene celpopulaties te verduidelijken met behulp van conventionele co-cultuur systemen, omdat de heterogeniteit van de celsubpopulatie wordt bedekt door de gemiddelde waarden; de conventionele co-cultuur systemen kunnen alleen worden gebruikt om het bevolkings signaal te beschrijven, maar zijn niet in staat om het gedrag van individuele cellen te volgen. Bovendien hebben conventionele eencellige experimentele methoden een lage efficiëntie bij het manipuleren van cellen vanwege de Poisson-verdeling. Micro fabricaat-apparaten zijn een opkomende technologie voor eencellige studies omdat ze afzonderlijke cellen nauwkeurig kunnen manipuleren bij hoge doorvoer en het monster-en reagens verbruik kunnen verminderen. Hier beschrijven we het concept en de toepassing van een microfluïdische chip voor meerdere eencellige co-culturen. De chip kan efficiënt meerdere soorten afzonderlijke cellen in een cultuur kamer vastleggen (~ 46%) en heeft een voldoende cultuur ruimte die nuttig is om het gedrag van de cellen te bestuderen (bijv. migratie, proliferatie, enz.) onder celcelinteractie op het eencellige niveau. Lymfatische endotheliale cellen en oraal plaveiselcelcarcinoom werden gebruikt om een eencellige co-cultuur experiment uit te voeren op het microfluïdische platform voor Live meervoudige interactiestudies met één cel.

Het apparaat heeft een drie lagenstructuur zoals aangegeven door de doorsnede foto van een cut PDMS-apparaat (Figuur 1a). De eerste laag bevat een Capture-site (6,0 μm in breedte en 4,6 μm in hoogte) die de cultuur kamer en het by-pass kanaal verbindt. Het verschil in stromingsweerstand tussen de kweekkamer en het by-pass kanaal zorgt ervoor dat de cellen in de veroverings positie stromen en de ingang van het kleine pad vullen. Nadat een ce...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Het is van cruciaal belang om effectief te combineren capture efficiëntie met dynamische live cel beeld observatie om het effect van cel-cel interactie op celgedrag te begrijpen. Deze buis kan zeer efficiënt meerdere enkele cellen in een grotere kamer vastleggen en een voldoende cultuurbasis bieden, voor dynamische tracking van meerdere eencellige interactiegedrag. Begin met het voorbereiden van het PDMS-apparaat.Plaats een wafer mal in de weegschaal met 100 microliters van trichlorosilane in een desiccator en breng een vacuüm gedurende 15 minuten. Stop het vacuüm en verzilt de wafer schimmel in de desiccator op 37 graden Celsius voor ten minste een uur. Meng de PDMS-basis en PDMS-uithardingsmiddel met een verhouding van tien tegen één en giet vervolgens in totaal 20 gram van het mengsel op de wafermal in een schaal van 15 centimeter.Plaats de schotel van 15 centimeter in een desiccator en breng anderhalve minuut een vacuüm aan. Haal vervolgens de schotel uit de desiccator en elimineer restluchtbellen in de PDMS met stikstofgas. Genees de PDMS door de schotel twee tot vier uur in een oven op 65 graden Celsius te plaatsen.Als u klaar bent, verwijdert u de PDMS-replica uit de wafermal en slaat u een inlaat van 1,5 millimeter en een uitlaat van 0,5 millimeter op de PDMS. Reinig de PDMS-replica en het schuifoppervlak met verwijderbare tape. Behandel het oppervlak met zuurstofplasma.Vervolgens moet u de PDMS-replica handmatig uitlijnen met de dia en deze met elkaar in contact brengen. Laat de PDMS-dia één dag in de 65 graden Celsius oven staan. Dompel het PDMS-apparaat de volgende dag onder in een container gevuld met PBS.Plaats het in de desiccator, en breng vacuüm gedurende 15 minuten. Verplaats het apparaat naar een celkweekkap en steriliseer het gedurende 30 minuten met UV-licht. Vervang de PDMS-apparaatbuffer door medium en incubbate het op vier graden Celsius gedurende een dag.Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%samenvloeiing, verwijder de cultuur medium en voorzichtig wassen ze drie keer met vijf milliliter PBS. Voeg een milliliter DMEM/F-12 medium met één micromolar fluorescerende kleurstof toe aan de WNT5B sh4- en pLKO-GFP-cellen en broed ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur uit. Na de incubatie was je de cellen voorzichtig drie keer met vijf milliliter steriele PBS, verwijder je de PBS en voeg je twee milliliter van 0,25% Trypsin-EDTA toe.Incubeer de cellen gedurende vier minuten bij kamertemperatuur, dan zachtjes tik op de cultuur schotel om celloslating te bevorderen. Voeg vier milliliter DMEM/F-12 medium toe om WNT5B sh4- en pLKO-GFP-cellen te verspreiden, breng de cellen over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer ze drie minuten lang op 300 xg. Verwijder de supernatant en voorzichtig opnieuw op te schorten de cel pellet in een milliliter van DMEM / F-12 medium.Bereid een milliliter celsuspensie voor met een concentratie van drie keer tien tot vijf cellen per milliliter en houd het op ijs om celaggregatie te voorkomen. Sluit de polytetrafluorethyleenbuis aan tussen het stopcontact van het apparaat en de spuitpomp. Verwijder het medium en voeg één microliter van de voorbereide celsuspensie toe aan de inlaat van het PDMS-apparaat.Laad vervolgens de celsuspensie in het apparaat met behulp van een spuitpomp met een stroomsnelheid van 0,3 microliter per minuut. Voeg een microliter DMEM/F-12-medium toe aan de inlaat van het apparaat en laad het medium vervolgens in het apparaat met behulp van een spuitpomp. Laad 0,3 microliter dmem/F12-medium in het apparaat met de spuitpomp met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut.Nadat de cellen zijn geladen, verwijder de buis, en verzegel de inlaat en uitlaat met polyolefin tape om een gesloten cultuur systeem te creëren. Verplaats het PDMS-apparaat naar een kweekschotel van 10 centimeter en voeg 10 milliliter steriele PBS rond het apparaat toe om verdamping van medium te voorkomen. Breng het kweekschotel over naar een couveuse voor de driedubbele eencellige cultuur.Het PDMS-apparaat heeft een structuur met drie lagen met een opnamesite die verbinding maakt met de cultuurkamer en het bypasskanaal. Het verschil in stroomweerstand tussen de kweekkamer en het bypasskanaal zorgt ervoor dat de cel in de opnamepositie kan stromen, waardoor de volgende cel door het bypasskanaal naar de volgende opnameplaats gaat. De reflux stap wordt gebruikt om de cel vrij te geven van de capture site en stuur het naar de cultuur kamer.De efficiëntie van het celafvang van dit protocol is geëvalueerd op drie verschillende celtypen. Menselijke lymfe-endotheliale cellen, of LECs, menselijke orale plaveiselcelcarcinoom T2.6 cellen uitdrukken WNT5B-specifieke korte haarspeld RNA, en pLKO-GFP vector controlecellen. De single-cell capture efficiëntie van de drie aangetoonde cellen waren ongeveer 71%voor de LECs, 74% voor WNT5B sh4 cellen, en 78%voor de pLKO-GFP cellen.De drievoudige eencellige opname-efficiëntie was 48%Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere eencellige co-culturen van lymfeendotheelcellen en plaveiselkankercellen, en de proliferatie en morfologie van de cel kan worden waargenomen onder een microscoop. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de voorbereide celsuspensies minimale celaggregaten hebben, omdat celaggregaten niet alleen de efficiëntie van het koppelen van één paar verminderen, maar ook de microkanalen kunnen verstoppen. Celcelinteractie tussen afzonderlijke cellen speelt een belangrijke rol bij het beheersen van celgedrag.Onze methode kan een efficiënt instrument bieden om onderzoekers te helpen celcelinteractie op een celniveau te bestuderen, wat kan leiden tot de ontdekking van nieuwe mechanismen die niet gemakkelijk kunnen worden verkregen uit populatiestudies.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Een Microfluïdische-gebaseerde Hydrodynamische Trap voor Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Microfluïdische fabricage van polymere en biohybridevezels met vooraf ontworpen grootte en vorm

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Een Microfluïdische Chip voor ICPMS Sample Inleiding

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...