Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
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Ces travaux ont été appuyés par une subvention du ministère des Sciences et de la Technologie (105-2628-E-400-001-MY2), et du Programme de doctorat en génie tissulaire et en médecine régénérative, de l'Université nationale Chung Hsing et des Instituts nationaux de recherche en santé.

1. Fabrication d'un moule de gaufrette par lithographie douce
REMARQUE : Les données du modèle de masque sont disponibles dans notre publication précédente14.
<ol><li>Déshydrater une plaquette de silicium de 4 pouces dans un four à 120 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Spin coat 4 g de SU-8 2 photoresist négatif sur une plaquette de silicium de 4 pouces à 1000 tr/min pour 30 s pour créer une couche de 5 m d'épaisseur (couche #1).</li>
	<li>La couche de cuisson do...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Les interactions intercellulaires de diverses cellules dans le microenvironnement de tumeur jouent un rôle important dans la progression de la tumeur17. Afin de comprendre le mécanisme des interactions cellules-cellules, les systèmes de co-culture sont utilisés comme méthode d'analyse commune. Cependant, plusieurs types de cellules et l'hétérogénéité des cellules elles-mêmes ont conduit à la complexité expérimentale et des difficultés analytiques.
La puce...

La capture efficace de différents types de cellules individuelles et la fourniture d'un espace de culture suffisant sont nécessaires pour les expériences de co-culture à cellule unique de plusieurs types de cellules individuelles1. Limiter la dilution est la méthode la plus couramment utilisée pour préparer les cellules individuelles pour de telles expériences, en raison du faible coût de l'équipement requis. Cependant, en raison de la limitation de distribution de Poisson, la probabilité maximale d'acquisition d'une seule cellule n'est que de 37 %, ce qui rend l'opération expérimentale laborieuse et longue2. En revanche, l'utilisation de la fluorescence activée tri des cellules (FACS) peut surmonter la limitation de distribution Poisson à haute efficacité préparer les cellules uniques3. Toutefois, les FACS peuvent ne pas être accessibles à certains laboratoires en raison des coûts d'instrumentation et d'entretien coûteux. Des dispositifs microfabriqués ont été récemment développés pour le piégeage à cellule unique4, l'appariement à cellule unique5, et les applications de culture monocellulaire. Ces dispositifs sont avantageux en fonction de leur capacité à manipuler avec précision les cellules individuelles6, effectuer des expériences à haut débit, ou de réduire la consommation d'échantillons et de réactifs. Cependant, l'exécution d'expériences de co-culture unicellulaires avec plusieurs types de cellules avec les dispositifs microfluidiques actuels est toujours difficile en raison de la limitation de la distribution Poisson1,7,8, ou l'incapacité de les dispositifs pour capturer plus de deux types de cellules simples4,5,6,9,10.
Par exemple, Yoon et coll. ont signalé un dispositif microfluidique pour l'étude d'interaction cellule-cellule11. Ce dispositif utilise la méthode probabiliste pour jumeler les cellules dans une chambre. Cependant, il ne peut atteindre l'appariement de deux types de cellules différents en raison de restrictions géométriques dans la structure de l'appareil. Un autre rapport de Lee et coll. a démontré une méthode déterministe pour capturer et jumeler les cellules individuelles12. Ce dispositif augmente l'efficacité d'appariement par la méthode déterministe mais il est limité par le temps de fonctionnement prolongé requis pour coupler des cellules. Plus précisément, la deuxième capture cellulaire ne peut être effectuée qu'après que la première cellule capturée a été fixée à la surface après 24 h. Zhao et coll. ont signalé un dispositif microfluidique à base de gouttelettes pour capturer deux types d'une seule cellule13. Nous pouvons trouver que le dispositif microfluidique à base de gouttelettes est encore limité à la distribution de Poisson et ne peut être utilisé que sur les cellules non attachées, et il n'est pas possible de changer la solution de culture pendant le processus de culture.
Auparavant, nous avons mis au point une « puce de fermeture hydrodynamique » microfluidique qui utilise des forces hydrodynamiques déterministes pour capturer plusieurs types de cellules individuelles dans la chambre de culture et peut par la suite effectuer une expérience de co-culture cellulaire pour analyser comportement de migration cellulaire individuel dans le cadre des interactions cellule-cellule14. La puce de fermeture hydrodynamique comprend un ensemble d'unités qui contiennent chacune un canal de contournement serpentin, un site de capture et une chambre de culture. En utilisant la différence de résistance au débit entre le canal de contournement serpentin et la chambre de culture, et une procédure d'opération spécialement conçue, différents types de cellules individuelles peuvent être capturés à plusieurs reprises dans la chambre de culture. Notamment, l'espace suffisant de la chambre de culture peut non seulement empêcher la cellule d'être rincée pendant la capture cellulaire, mais aussi fournir suffisamment d'espace pour les cellules de se propager, proliférer et migrer, permettant d'observer les interactions vivantes unicellulaire. Dans cet article, nous nous concentrons sur la production de cet appareil et les étapes détaillées du protocole.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Les tests de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier les interactions cellules-cellules entre les différents types de cellules afin de mieux comprendre la biologie des maladies, y compris le cancer. Cependant, il est difficile de clarifier le mécanisme complexe des interactions intercellulaires dans les populations cellulaires très hétérogènes en utilisant des systèmes de co-culture conventionnels parce que l'hétérogénéité de la sous-population cellulaire est obscurcie par les valeurs moyennes; les systèmes conventionnels de co-culture ne peuvent être utilisés que pour décrire le signal de la population, mais sont incapables de suivre le comportement des cellules individuelles. En outre, les méthodes expérimentales monocellulaires conventionnelles ont une faible efficacité dans la manipulation cellulaire en raison de la distribution de Poisson. Les dispositifs microfabriqués sont une technologie émergente pour les études unicellulaires, car ils peuvent manipuler avec précision les cellules individuelles à haut débit et peuvent réduire la consommation d'échantillons et de réactifs. Ici, nous décrivons le concept et l'application d'une puce microfluidique pour plusieurs co-cultures unicellulaires. La puce peut capturer efficacement plusieurs types de cellules individuelles dans une chambre de culture (46 %) et dispose d'un espace de culture suffisant utile pour étudier le comportement des cellules (p. ex. migration, prolifération, etc.) sous interaction cellule-cellule au niveau unicellulaire. Des cellules endothéliales lymphatiques et le carcinome squamous oral de cellules ont été employés pour effectuer une expérience de co-culture unicellulaire sur la plate-forme microfluidique pour des études multiples vivantes d'interaction unicellulaire.

L'appareil a une structure à trois couches comme le montre la photographie transversale d'un dispositif PDMS coupé (figure 1A). La première couche contient un site de capture (6,0 m de largeur et 4,6 m de hauteur) qui relie la chambre de culture et le canal de contournement. La différence de résistance au débit entre la chambre de culture et le canal de contournement fait en quoi les cellules s'écoulent dans la position de capture et r...

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Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Ce rapport décrit une méthode microfluidique basée sur la puce pour mettre en place une expérience de culture cellulaire unique dans laquelle l'appariement à haut rendement et l'analyse microscopique de plusieurs cellules individuelles peuvent être atteints.

Établir des co-cultures à base de cellules uniques dans une manière déterministe avec une puce microfluidique

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Il est essentiel de combiner efficacement l’efficacité de capture avec l’observation dynamique de l’image cellulaire vivante pour comprendre l’effet de l’interaction cellule-cellule sur les comportements cellulaires. Ce tube peut capturer très efficacement plusieurs cellules individuelles dans une chambre plus grande, et fournir une base de cultures suffisante, pour le suivi dynamique de multiples comportements d’interaction unicellules. Commencez par préparer l’appareil PDMS.Placer un moule à gaufrettes dans le plat de pesage avec 100 microlitres de trichlorosilane dans un dessiciateur et appliquer un aspirateur pendant 15 minutes. Arrêtez le vide et salinisez le moule à gaufrettes dans le dessiccateur à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Mélanger la base PDMS et l’agent curatif PDMS à un rapport de dix pour un, puis verser un total de 20 grammes du mélange sur le moule à gaufrettes dans un plat de 15 centimètres.Placer le plat de 15 centimètres dans un dessiccateur et appliquer un aspirateur pendant une minute et demie. Retirez ensuite le plat du dessicateur et éliminez les bulles d’air résiduelles dans le PDMS avec du gaz azoté. Guérir le PDMS en plaçant le plat dans un four à 65 degrés Celsius pendant deux à quatre heures.Une fois terminé, retirez la réplique PDMS du moule à gaufrettes et perforez une entrée de 1,5 millimètre et une prise de 0,5 millimètre sur le PDMS. Nettoyez la réplique PDMS et la surface de la glissière avec du ruban amovible. Traiter la surface avec du plasma d’oxygène.Ensuite, alignez manuellement la réplique PDMS avec la diapositive et les mettre en contact les uns avec les autres. Laissez la glissière PDMS dans le four à 65 degrés Celsius pendant une journée. Le lendemain, immerger l’appareil PDMS dans un conteneur rempli de PBS.Placez-le dans le dessiccateur et appliquez le vide pendant 15 minutes. Déplacez l’appareil sur un capot de culture cellulaire et stérilisez-le avec de la lumière UV pendant 30 minutes. Remplacez le tampon de l’appareil PDMS par un milieu et incubez-le à quatre degrés Celsius pendant une journée.Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, enlever le milieu de culture et les laver doucement trois fois avec cinq millilitres de PBS. Ajouter un millilitre de milieu DMEM/F-12 contenant un colorant fluorescent micromolaire aux cellules WNT5B sh4 et pLKO-GFP, et les incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, laver délicatement les cellules trois fois avec cinq millilitres de PBS stérile, retirer le PBS, et ajouter deux millilitres de 0,25%Trypsin-EDTA.Incuber les cellules pendant quatre minutes à température ambiante, puis tapoter doucement le plat de culture pour favoriser le décollement cellulaire. Ajouter quatre millilitres de milieu DMEM/F-12 pour disperser les cellules WNT5B sh4 et pLKO-GFP, transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et les centrifuger à 300 xg pendant trois minutes. Retirer le supernatant et suspendre délicatement la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu DMEM/F-12.Préparez un millilitre de suspension cellulaire à une concentration de trois fois dix à cinq cellules par millilitre et gardez-le sur la glace pour empêcher l’agrégation cellulaire. Connectez le tube de polytétrafluoroéthylène entre la sortie de l’appareil et la pompe à seringues. Retirez le milieu et ajoutez un microlitre de la suspension cellulaire préparée dans l’entrée de l’appareil PDMS.Ensuite, chargez la suspension cellulaire dans l’appareil à l’aide d’une pompe à seringues à un débit de 0,3 microlitres par minute. Ajouter un microlitre de milieu DMEM/F-12 dans l’entrée de l’appareil, puis charger le milieu dans l’appareil à l’aide d’une pompe à seringues. Chargez 0,3 microlitres de milieu DMEM/F12 dans l’appareil avec la pompe à seringues à un débit de 10 microlitres par minute.Une fois les cellules chargées, retirez le tube et scellez l’entrée et la sortie avec du ruban polyolefin pour créer un système de culture fermé. Déplacez l’appareil PDMS dans un plat de culture de 10 centimètres et ajoutez 10 millilitres de PBS stérile autour de l’appareil pour éviter l’évaporation du milieu. Transférer le plat de culture dans un incubateur pour une triple culture unicelliste.L’appareil PDMS a une structure à trois couches avec un site de capture qui se connecte à la chambre de culture et au canal de dérivation. La différence de résistance au débit entre la chambre de culture et le canal de dérivation permet à la cellule de s’écouler dans la position de capture, ce qui fait passer la cellule suivante par le canal de dérivation jusqu’au site de capture suivant. L’étape de reflux est utilisée pour libérer la cellule du site de capture et l’envoyer dans la chambre de culture.L’efficacité de capture cellulaire de ce protocole a été évaluée sur trois types de cellules différents. Cellules endothéliales lymphatiques humaines, ou LECs, carcinome squameux oral humain de cellules T2.6 cellules exprimant WNT5B-spécifique ARN court d’épingle à cheveux, et cellules de contrôle vectorielle pLKO-GFP. L’efficacité de capture à cellule unique des trois cellules démontrées était d’environ 71 % pour les LEC, de 74 % pour les cellules WNT5B sh4 et de 78 % pour les cellules pLKO-GFP.L’efficacité triple de capture d’une seule cellule était de 48%Cette méthode peut être utilisée pour plusieurs co-cultures unicellules de cellules endothéliales lymphatiques et de cellules cancéreuses squameuses, et la prolifération et la morphologie de la cellule peuvent être observées au microscope. Il est important de s’assurer que les suspensions cellulaires préparées ont un minimum d’agrégats cellulaires, parce que les agrégats cellulaires réduisent non seulement l’efficacité de l’appariement unique, mais peuvent également obstruer les canaux micro. L’interaction cellule-cellule entre les cellules individuelles joue un rôle important dans le contrôle des comportements cellulaires.Notre méthode peut fournir un outil efficace pour aider les chercheurs à étudier l’interaction cellule-cellule à un seul niveau cellulaire, ce qui peut conduire à la découverte de nouveaux mécanismes qui ne peuvent pas être facilement obtenus à partir d’études basées sur la population.

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This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Le Multi-Chip organes - Une plate-forme microfluidique à long terme Coculture multi-tissus

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l&#39;image

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...