Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (105-2628-E-400-001-MY2) und des Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University und National Health Research Institutes unterstützt.

1. Herstellung einer Waferform durch weiche Lithographie
HINWEIS: Maskenmusterdaten sind in unserer vorherigen Publikation14verfügbar.
<ol><li>Einen 4-Zoll-Siliziumwafer in einem 120 °C-Ofen für 15 min dehydrieren.</li>
	<li>Spin Coat 4 g SU-8 2 negative Photoresist auf einen 4-Zoll-Silizium-Wafer bei 1.000 U/min für 30 s, um eine 5 'm dicke Schicht (Schicht #1) zu schaffen.</li>
	<li>Weiche Backschicht #1 auf einer 65 °C-Kochplatte für 1 min und übertragen Sie...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Die interzellulären Wechselwirkungen verschiedener Zellen in der Tumormikroumgebung spielen eine wichtige Rolle bei der Progression des Tumors17. Um den Mechanismus der Zell-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen, werden Co-Kultur-Systeme als gemeinsame analytische Methode verwendet. Mehrere Zelltypen und die Heterogenität der Zellen selbst haben jedoch zu experimenteller Komplexität und analytischen Schwierigkeiten geführt.
Der hydrodynamische Abschaltchip ermöglicht ...

Effiziente Erfassung verschiedener Typen von Einzelzellen und Bereitstellung von ausreichend Kulturraum sind für Einzelzell-Kokulturexperimente mehrerer Typen von Einzelzellenerforderlich 1. Die Begrenzung der Verdünnung ist aufgrund der geringen Kosten der erforderlichen Ausrüstung die am häufigsten verwendete Methode, um die einzelnen Zellen auf solche Experimente vorzubereiten. Aufgrund der Poisson-Verteilungsbeschränkung beträgt die maximale Einzelzellerfassungswahrscheinlichkeit jedoch nur 37 %, was die experimentelle Operation mühsam und zeitaufwändig macht2. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) die Poisson-Verteilungsbeschränkung überwinden, um hocheffiziente Einzelzellen vorzubereiten3. FACS ist jedoch aufgrund teurer Instrumentierungs- und Wartungskosten für einige Laboratorien möglicherweise nicht zugänglich. Mikrofabrizierte Geräte wurden vor kurzem für Einzelzellen-Trapping4,Einzelzellen-Kopplung5und Einzelzellen-Kulturanwendungen entwickelt. Diese Geräte sind vorteilhaft aufgrund ihrer Fähigkeit, einzelne Zellen genau zu manipulieren6, durchführen Hochdurchsatzexperimente, oder reduzieren Proben- und Reagenzverbrauch. Die Durchführung einzelliger Kokulturexperimente mit mehreren Zelltypen mit den aktuellen mikrofluidischen Geräten ist jedoch immer noch eine Herausforderung, da die Poisson-Verteilung1,7,8oder die Unfähigkeit die Geräte, um mehr als zwei Arten von einzelnen Zellenzuerfassen 4,5,6,9,10.
Zum Beispiel berichteten Yoon et al. über ein mikrofluidisches Gerät für die Zell-Zell-Interaktionsstudie11. Dieses Gerät verwendet die probabilistische Methode, um Zellen in einer Kammer zu koppeln. Es kann jedoch nur die Kopplung von zwei verschiedenen Zelltypen aufgrund geometrischer Einschränkungen in der Gerätestruktur erreichen. Ein weiterer Bericht von Lee et al. zeigte eine deterministische Methode, einzelne Zellen zu erfassen und zu paaren12. Dieses Gerät erhöht die Kopplungseffizienz durch die deterministische Methode, ist jedoch durch die längere Betriebszeit begrenzt, die zum Koppeln von Zellen erforderlich ist. Insbesondere kann die zweite Zellaufnahme erst durchgeführt werden, nachdem die erste gefangene Zelle nach 24 h an die Oberfläche angeschlossen wurde. Zhao et al. berichteten von einem tropfenbasierten mikrofluidischen Gerät, um zwei Arten einer einzelnen Zelle zu erfassen13. Wir können feststellen, dass das tropfenbasierte mikrofluidische Gerät immer noch auf die Poisson-Verteilung beschränkt ist und nur auf nicht angeschlossenen Zellen verwendet werden kann, und es ist nicht möglich, die Kulturlösung während des Kultivierungsprozesses zu ändern.
Zuvor haben wir einen mikrofluidischen "hydrodynamischen Abschaltchip" entwickelt, der deterministische hydrodynamische Kräfte nutzt, um mehrere Arten von Einzelzellen in die Kulturkammer einzufangen und anschließend ein Zell-Kokulturexperiment durchführen kann, um individuelles Zellmigrationsverhalten unter Zell-Zell-Wechselwirkungen14. Der hydrodynamische Abschaltchip besteht aus einem arrayierten Einheitensatz, der jeweils einen Serpentin-By-Pass-Kanal, einen Capture-Site und eine Kulturkammer enthält. Durch die Verwendung des Differenzwiderstands zwischen dem Serpentin-Umgehungskanal und der Kulturkammer und einem speziell entwickelten Operationsverfahren können verschiedene Arten von Einzelzellen wiederholt in die Kulturkammer eingefangen werden. Insbesondere kann der große Raum der Kulturkammer nicht nur verhindern, dass die Zelle während der Zellaufnahme gespült wird, sondern auch genügend Raum für die Zellausbreitung, Vermehrung und Migration bieten, was die Beobachtung lebender einzelliger Wechselwirkungen ermöglicht. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Produktion dieses Geräts und detaillierte Protokollschritte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Zell-Co-Kultur-Assays wurden häufig für die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen verwendet, um die Biologie von Krankheiten einschließlich Krebs besser zu verstehen. Es ist jedoch schwierig, den komplexen Mechanismus interzellulärer Wechselwirkungen in hochheterogenen Zellpopulationen mithilfe konventioneller Kokultursysteme zu klären, da die Heterogenität der Zellsubpopulation durch die Durchschnittswerte verdeckt wird; die herkömmlichen Co-Kultur-Systeme können nur verwendet werden, um das Populationssignal zu beschreiben, sind aber nicht in der Lage, das Verhalten einzelner Zellen zu verfolgen. Darüber hinaus haben herkömmliche einzellige experimentelle Methoden aufgrund der Poisson-Verteilung eine geringe Effizienz bei der Zellmanipulation. Mikrogefertigte Geräte sind eine neue Technologie für Einzelzellstudien, da sie einzelne Zellen mit hohem Durchsatz genau manipulieren und den Proben- und Reagenzverbrauch reduzieren können. Hier beschreiben wir das Konzept und die Anwendung eines mikrofluidischen Chips für mehrere einzellige Kokulturen. Der Chip kann effizient mehrere Arten von Einzelzellen in einer Kulturkammer erfassen (ca. 46%) und verfügt über einen ausreichenden Kulturraum, der nützlich ist, um das Verhalten der Zellen (z. B. Migration, Proliferation usw.) unter Zell-Zell-Interaktion auf einzelzeller Ebene zu untersuchen. Lymphatische Endothelzellen und orales Plattenepithelkarzinom wurden verwendet, um ein einzelliges Kokulturexperiment auf der mikrofluidischen Plattform für live multiple Einzelzell-Interaktionsstudien durchzuführen.

Das Gerät hat eine dreilagige Struktur, wie das Querschnittsfoto eines geschnittenen PDMS-Geräts zeigt (Abbildung 1A). Die erste Schicht enthält eine Erfassungsstelle (6,0 m in der Breite und 4,6 m in der Höhe), die die Kulturkammer mit dem Umgehungskanal verbindet. Der Unterschied im Strömungswiderstand zwischen der Kulturkammer und dem Umgehungskanal bewirkt, dass die Zellen in die Erfassungsposition fließen und den Eingang des kleine...

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Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Dieser Bericht beschreibt eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zum Einrichten eines Einzelzellkulturexperiments, bei dem eine hocheffiziente Kopplung und mikroskopische Analyse mehrerer Einzelzellen erreicht werden kann.

Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Es ist wichtig, die Erfassungseffizienz effektiv mit der dynamischen Beobachtung von Live-Zellenbildern zu kombinieren, um die Auswirkungen der Zell-Zell-Interaktion auf das Zellverhalten zu verstehen. Diese Röhre kann sehr effizient mehrere einzelne Zellen in einer größeren Kammer erfassen und eine ausreichende Kulturbasis für die dynamische Verfolgung mehrerer einzelliger Interaktionsverhalten eisern. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des PDMS-Geräts.Eine Waferform mit 100 Mikroliter Trichlorsilan in einen Trockenbau geben und 15 Minuten lang ein Vakuum auftragen. Stoppen Sie das Vakuum und versalzen Sie die Waferform im Trockenbau bei 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Mischen Sie die PDMS-Basis und das PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis von zehn zu eins, dann gießen Sie insgesamt 20 Gramm der Mischung in einer 15-Zentimeter-Schale auf die Waferform.Die 15-Zentimeter-Schale in einen Trockenbau geben und eineinhalb Minuten lang ein Vakuum auftragen. Dann entfernen Sie die Schale aus dem Trockenturm und beseitigen Restluftblasen im PDMS mit Stickstoffgas. Heilen Sie das PDMS, indem Sie die Schale zwei bis vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius in einen Ofen stellen.Entfernen Sie nach Fertigstellung das PDMS-Replikat aus der Waferform, und stanzen Sie einen 1,5-Millimeter-Einlass und einen 0,5-Millimeter-Auslass auf das PDMS. Reinigen Sie das PDMS-Replikat und die Folienoberfläche mit Wechselband. Behandeln Sie die Oberfläche mit Sauerstoffplasma.Richten Sie dann das PDMS-Replikat manuell an der Folie aus und bringen sie miteinander in Kontakt. Lassen Sie die PDMS-Folie einen Tag lang im 65-Grad-Celsius-Ofen. Tauchen Sie am nächsten Tag das PDMS-Gerät in einen mit PBS gefüllten Behälter ein.Legen Sie es in den Trockenheitor, und vakuumieren für 15 Minuten. Bewegen Sie das Gerät auf eine Zellkulturhaube und sterilisieren Sie es 30 Minuten lang mit UV-Licht. Ersetzen Sie den PDMS-Gerätepuffer durch Medium, und inkubieren Sie ihn einen Tag lang bei vier Grad Celsius.Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie es mit fünf MilliliterPBS dreimal. Fügen Sie den WNT5B sh4- und pLKO-GFP-Zellen einen Milliliter DMEM/F-12-Medium mit einem mikromollaren Fluoreszenzfarbstoff hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit fünf Millilitern sterilem PBS, entfernen Sie die PBS und fügen Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA hinzu.Inkubieren Sie die Zellen für vier Minuten bei Raumtemperatur, dann tippen Sie vorsichtig auf die Kulturschale, um die Zellablösung zu fördern. Fügen Sie vier Milliliter DMEM/F-12 Medium hinzu, um WNT5B sh4 und pLKO-GFP-Zellen zu dispergieren, die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr zu übertragen und sie drei Minuten lang bei 300 xg zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet vorsichtig in einem Milliliter DMEM/F-12-Medium wieder auf.Bereiten Sie einen Milliliter Zellsuspension mit einer Konzentration von dreimal zehn bis fünf Promille pro Milliliter vor und halten Sie sie auf Eis, um eine Zellaggregation zu verhindern. Schließen Sie das Polytetrafluorethylen-Rohr zwischen dem Auslass des Geräts und der Spritzenpumpe an. Entfernen Sie das Medium, und fügen Sie einen Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension in den Einlass des PDMS-Geräts ein.Als nächstes laden Sie die Zellsuspension mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 Mikroliterpro Minute in das Gerät. Fügen Sie einen Mikroliter DMEM/F-12 Medium in den Einlass des Geräts ein, und laden Sie das Medium dann mit einer Spritzenpumpe in das Gerät. Laden Sie 0,3 Mikroliter DMEM/F12 Medium mit der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 10 Mikroliterpro Minute in das Gerät.Nachdem die Zellen geladen wurden, entfernen Sie das Rohr und versiegeln Sie den Ein- und Auslass mit Polyolefinband, um ein geschlossenes Kultursystem zu erstellen. Bewegen Sie das PDMS-Gerät auf eine 10-Zentimeter-Kulturschale und fügen Sie 10 Milliliter sterile PBS um das Gerät herum, um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden. Übertragen Sie das Kulturgericht in einen Inkubator für eine dreifache Einzelzellenkultur.Das PDMS-Gerät verfügt über eine dreischichtige Struktur mit einer Erfassungsstelle, die mit der Kulturkammer und dem Bypasskanal verbunden ist. Der Unterschied im Strömungswiderstand zwischen der Kulturkammer und dem Bypasskanal ermöglicht es der Zelle, in die Erfassungsposition zu fließen, wodurch die folgende Zelle durch den Bypasskanal zum nächsten Erfassungsort gelangt. Der Refluxschritt wird verwendet, um die Zelle von der Aufnahmestelle zu befreien und in die Kulturkammer zu senden.Die Effizienz der Zellerfassung dieses Protokolls wurde anhand von drei verschiedenen Zelltypen bewertet. Menschliche lymphatische Endothelzellen oder LECs, humane plattenförmige Zellkarzinom T2.6-Zellen, die WNT5B-spezifische kurze Haarnadel-RNA exdrücken, und pLKO-GFP-Vektorkontrollzellen. Die Einzelzellerfassungseffizienz der drei nachgewiesenen Zellen betrug etwa 71 % für die LECs, 74 % für WNT5B sh4-Zellen und 78 % für die pLKO-GFP-Zellen.Die dreifache einzelzellige Erfassungseffizienz betrug 48%Diese Methode kann für mehrere einzellige Kokulturen von lymphatischen Endothelzellen und Plattenepithelzellen verwendet werden, und die Proliferation und Morphologie der Zelle kann unter dem Mikroskop beobachtet werden. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die vorbereiteten Zellsuspensionen minimale Zellaggregate haben, da Zellaggregate nicht nur die Effizienz der einzelnen Kopplung reduzieren, sondern auch die Mikrokanäle verstopfen können. Die Zell-Zell-Interaktion zwischen einzelnen Zellen spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Zellverhaltens.Unsere Methode kann ein effizientes Werkzeug bieten, um Forschern dabei zu helfen, die Zell-Zell-Interaktion auf einer einzelnen Zellebene zu untersuchen, was zur Entdeckung neuer Mechanismen führen kann, die nicht ohne weiteres aus populationsbasierten Studien gewonnen werden können.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Einem mikrofluidischen-basierte Hydrodynamische Trap für einzelne Teilchen

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Forschung

Biotechnik

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

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The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...