Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק ממשרד המדע והטכנולוגיה (105-2628-E-400-001-MY2), ואת תוכנית הדוקטורט בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, אוניברסיטת צ'ונג הסינג הלאומית ומכוני מחקר בריאות לאומית.

1. ייצור עובש וופל על ידי ליתוגרפיה רכה
הערה: נתוני תבנית המסיכה זמינים בפרסום הקודם שלנו14.
<ol><li>מייבשים 4-בעובי וופל סיליקון בתנור של 120 ° c במשך 15 דקות.</li>
	<li>ספין מעיל 4 גרם של SU-8 2 שלילי photoresist על 4-inch סיליקון וופל ב 1,000 rpm עבור 30 כדי ליצור 5 יקרומטר שכבה עבה (שכבה #1).</l...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

האינטראקציות התרבות של תאים שונים מיקרוסביבה הגידול לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות הגידול17. כדי להבין את המנגנון של אינטראקציות תא תא, מערכות שיתוף התרבות משמשות כשיטה אנליטית נפוצה. עם זאת, סוגי תאים מרובים והטרוגניות של התאים עצמם הובילו למורכבות ניסויית ולקשיים אנליטיים.
<p cla...

לכידה יעילה של סוגים שונים של תאים בודדים ואספקת מרחב תרבותי מספיק נדרשים עבור ניסויים תא יחיד שיתוף התרבות של סוגים מרובים של תאים בודדים1. הגבלת דילול היא השיטה הנפוצה ביותר כדי להכין את התאים היחידים עבור ניסויים כאלה, בשל העלות הנמוכה של ציוד נדרש. עם זאת, בשל מגבלת התפלגות פואסון, ההסתברות המרבית לרכישת תא בודד היא רק 37%, מה שהופך את הפעולה הניסיונית לעמלולגזול זמןרב. לעומת זאת, שימוש במיון תאים המופעל באמצעות הזריחה (FACS) יכול להתגבר על מגבלת התפלגות פואסון כדי להכין תאים בודדים באופן יעיל ברמה3. עם זאת, FACS לא יכול להיות נגיש למעבדות מסוימות בשל עלות מכשור יקר ותחזוקה. התקנים מיקרו-מפוברק פותחו לאחרונה עבור השמנה של תא בודד4, זיווג של תא בודד5ויישומי תרבות תא בודדים. התקנים אלה מבוססים על יכולתם לטפל באופן מדויק בתאים בודדים6, לבצע ניסויים בתפוקה גבוהה, או להפחית את הצריכה הכימית של המדגם. עם זאת, ביצוע ניסויים בשיתוף עם תאים בודדים עם סוגי תאים מרובים עם מכשירים מיקרופלואידים הנוכחיים עדיין מאתגרים בשל הגבלת התפלגות פואסון1,7,8או אי-יכולת של התקנים כדי ללכוד יותר משני סוגים של תאים בודדים4,5,6,9,10.
לדוגמה, יון ואח ' דיווח על מכשיר מיקרופלואידיג למחקר האינטראקציה תא תא11. התקן זה משתמש בשיטה הפרוליסטית כדי לזווג תאים בחדר אחד. עם זאת, הוא יכול להשיג רק את הזיווג של שני סוגי תאים שונים עקב הגבלות גיאומטריות במבנה ההתקן. דו ח נוסף של לי ואח ' הפגין שיטה דטרמיניסטית ללכוד ולזווג תאים בודדים12. התקן זה מגביר את יעילות השיוך בשיטה הדטרמיניסטית, אך הוא מוגבל על-ידי זמן הפעולה הממושך הנדרש לזוג תאים. באופן ספציפי, לכידת התא השני יכול להתבצע רק לאחר שהתא הראשון שנלכד מחובר לפני השטח לאחר 24 שעות. זאו ואח ' דיווח על מכשיר מיקרופלואידיג מבוסס-droplet כדי ללכוד שני סוגים של תא אחד13. אנו יכולים למצוא כי מכשיר מיקרופלואידיג מבוסס-droplet עדיין מוגבל להתפלגות פואסון וניתן להשתמש בו רק בתאים שאינם מחוברים, ואין אפשרות לשנות את פתרון התרבות במהלך תהליך הטיפוח-תרגול.
בעבר, פיתחנו מיקרופלואידים "שבב שחרור הידרודינמי" כי מנצל כוחות הידרודינמיים דטרמיניסטי ללכוד סוגים מרובים של תא יחיד לתוך חדר התרבות, ולאחר מכן ניתן לבצע ניסוי שיתוף התרבות התא כדי לנתח התנהגות בודדת של העברת תאים תחת אינטראקציות תא תא14. שבב המעבר ההידרודינמי כולל מערך מסודר של יחידות, שכל אחד מהם מכיל ערוץ הומה-מעבר, אתר לכידת וחדר תרבות. על-ידי שימוש בשינוי בעמידות הזרימה בין הערוץ המיועד למעבר לבין חדר התרבות, והליך פעולה שתוכנן במיוחד, ניתן ללכוד שוב ושוב לתוך חדר התרבות. בעיקר, המרחב הגדול של חדר התרבות יכול לא רק למנוע את הריקון של התא במהלך לכידת התא, אלא גם לספק מספיק מקום עבור התאים כדי להפיץ, מתרבים ולהגר, ומאפשר התבוננות של לחיות אינטראקציה בין תאים בודד. במאמר זה, אנו מתמקדים בייצור של התקן זה ושלבי פרוטוקול מפורטים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

שיתוף התרבות של התא שימש בשימוש נרחב ללימוד אינטראקציות תא תא בין סוגי תאים שונים כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של מחלות כולל סרטן. עם זאת, הוא מאתגר להבהיר את המנגנון המורכב של אינטראקציות בין-סלולריות באוכלוסיות תאים הטרוגניות ביותר באמצעות מערכות שיתוף התרבות המקובלת, מכיוון שטרוגניות של אוכלוסיית המשנה של התא מטושטשת מהערכים הממוצעים; ניתן להשתמש במערכות שיתוף התרבות המקובלות רק כדי לתאר את אות האוכלוסיה, אך אינן מסוגלות לעקוב אחר התנהגות של תאים בודדים. יתרה מזאת, שיטות נסיוניות רגילות של תא יחיד בעלות יעילות נמוכה בטיפול בתאים בגלל התפלגות פואסון. התקנים מיקרו-מפוברק הם טכנולוגיה מתפתחים למחקרים בעלי תאים בודדים, משום שהם יכולים לטפל במדויק בתאים בודדים בתפוקה גבוהה ולהפחית את הצריכה הכימית של המדגם. כאן, אנו מתארים את המושג ואת היישום של שבב מיקרופלואידיג עבור מספר רב של תאים בודדים-שיתוף תרבויות. השבב יכול ביעילות ללכוד סוגים מרובים של תאים בודדים בחדר התרבות (~ 46%) והוא בעל מרחב תרבותי מספיק שימושי לחקר התנהגות התאים (למשל, הגירה, התפשטות וכדומה) תחת אינטראקציה תא תא ברמת התא היחיד. תאים אנדותל הלימפה וקרצינומה של תאים אוראלי קשקש שימשו כדי לבצע ניסוי של תא יחיד שיתוף התרבות על פלטפורמת microfluidic עבור חיים מרובים בודד אינטראקציה מחקרים.

ההתקן כולל מבנה בן שלוש שכבות, כפי שמוצג על-ידי הצילום החתך של התקן PDMS שנחתך (איור 1א). השכבה הראשונה מכילה אתר לכידת (6.0 יקרומטר ברוחב ו 4.6 יקרומטר בגובה) המחבר את חדר התרבות ואת ערוץ ידי-pass. ההבדל בין התנגדות הזרימה בין חדר התרבות והערוץ של המעבר גור...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

דוח זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידיג כדי להגדיר ניסוי של תרבות תא בודדת שבה ניתן להשיג שיוך ביעילות גבוהה וניתוח מיקרוסקופי של תאים בודדים מרובים.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

זה קריטי לשלב ביעילות יעילות לכידה עם תצפית דינמית של תמונת תא חי כדי להבין את ההשפעה של אינטראקציה בין תאים לתאים על התנהגויות תאים. צינור זה יכול ללכוד ביעילות רבה תאים בודדים מרובים בתא גדול יותר, ולספק בסיס תרבויות מספיק, למעקב דינמי של התנהגויות אינטראקציה מרובות של תא יחיד. התחל בהכנת התקן PDMS.מניחים תבנית רקיק בצלחת השקילה עם 100 microliters של טריכלורוסילאן ב desiccator ולהחיל ואקום במשך 15 דקות. עצרו את הוואקום ומליחים את תבנית הוופלים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. מערבבים את בסיס PDMS ואת סוכן ריפוי PDMS ביחס של עשר לאחד, ולאחר מכן לשפוך סך של 20 גרם של התערובת על עובש רקיק בצלחת 15 ס"מ.מניחים את המנה 15 ס"מ לתוך desiccator ולהחיל ואקום במשך 1 וחצי דקות. לאחר מכן להסיר את המנה מן היודש ולחסל בועות אוויר שיורית PDMS עם גז חנקן. לרפא את PDMS על ידי הנחת המנה בתנור ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד ארבע שעות.בסיום, הסר את העותק המשוכפל של PDMS מתבנית הוופלים ולחץ על משקע של 1.5 מילימטר ושקע של 0.5 מילימטר ב- PDMS. נקה את העותק המשוכפל של PDMS ואת משטח השקופית באמצעות סרט נשלף. טפל במשטח עם פלזמת חמצן.לאחר מכן, ליישר באופן ידני את העותק המשוכפל PDMS עם השקופית ולהביא אותם במגע אחד עם השני. השאירו את מגלשת ה-PDMS בתנור של 65 מעלות ליום אחד. למחרת, לטבול את התקן PDMS במיכל מלא PBS.מניחים אותו לתוך desiccator, ולהחיל ואקום במשך 15 דקות. להעביר את המכשיר למכסה המנוע של תא תרבות ולעקר אותו עם אור UV במשך 30 דקות. החלף את מאגר התקן PDMS במדיום והדקר אותו בארבע מעלות צלזיוס ליום אחד.כאשר התאים להשיג 70 עד 80%confluency, להסיר את מדיום התרבות בעדינות לשטוף אותם שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של PBS. הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום DMEM/F-12 המכיל צבע פלואורסצנטי מיקרומולרי אחד לתאי WNT5B sh4 ו-pLKO-GFP, והדגירה אותם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי, להסיר את PBS, ולהוסיף שני מיליליטר של 0.25%Trypsin-EDTA.דגירה התאים במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בעדינות הקש על צלחת התרבות כדי לקדם את ניתוק התא. הוסף ארבעה מיליליטר של DMEM / F-12 בינוני כדי לפזר WNT5B sh4 ו pLKO-GFP תאים, להעביר את התאים לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגה אותם ב 300 xg במשך שלוש דקות. הסר את העל-טבעי והשהה בעדינות את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום DMEM/F-12.הכינו מיליליטר אחד של השעיית תאים בריכוז של שלוש פעמים עשר עד חמישית תאים למיליליטר ולשמור אותו על קרח כדי למנוע צבירת תאים. חבר את צינור הפוליטטרהפלואורואתילן בין שקע ההתקן למשאבת המזרק. הסר את המדיום, והוסף מיקרוליטר אחד של מתלי התא המוכנים לתוך התוך ההתקן PDMS.לאחר מכן, לטעון את מתלי התא לתוך המכשיר באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 0.3 microliters לדקה. הוסף מיקרוליטר אחד של מדיום DMEM/F-12 לתוך התוך ההתקן ולאחר מכן טען את המדיום לתוך ההתקן באמצעות משאבת מזרק. טען 0.3 מיקרוליטרים של מדיום DMEM/F12 לתוך המכשיר עם משאבת המזרק בקצב זרימה של 10 מיקרוליטרים לדקה.לאחר התאים נטענים, להסיר את הצינור, ולאטום את inlet ושקע עם סרט פוליאולפין כדי ליצור מערכת תרבות סגורה. העבר את התקן PDMS לצלחת תרבות של 10 ס"מ והוסף 10 מיליליטר של PBS סטרילי סביב המכשיר כדי למנוע אידוי של מדיום. מעבירים את צלחת התרבות לאנקובטור לתרבות משולשת של תאים בודדים.להתקן PDMS מבנה בן שלוש שכבות עם אתר לכידה המתחבר לתא התרבות ולערוץ המעקף. ההבדל בהתנגדות לזרימה בין תא התרבות לערוץ המעקף מאפשר לתא לזרום לתוך תנוחת הלכידה, מה שגורם לתא הבא לעבור דרך ערוץ העקיפה לאתר הלכידה הבא. שלב הרפלוקס משמש לשחרור התא מאתר הלכידה ולשליחתו לתא התרבות.יעילות לכידת התאים של פרוטוקול זה הוערכה בשלושה סוגי תאים שונים. תאי אנדותל לימפוטיים אנושיים, או LECs, קרצינומה של תאי קשקש אוראלי אנושי T2.6 תאים המבטאים WNT5B ספציפי סיכת ראש קצרה RNA, ותאי בקרה וקטוריים pLKO-GFP. יעילות הלכידה החד-תאית של שלושת התאים שהודגמה הייתה כ- 71% עבור ה- LECs, 74% עבור תאי WNT5B sh4 ו- 78% עבור תאי pLKO-GFP.יעילות הלכידה המשולשת של תא יחיד הייתה 48%%שיטה זו יכולה לשמש עבור תרבויות מרובות של תאים אנדותל לימפתיים ותאי סרטן מימיים, והתרבות והמורפולוגיה של התא ניתן לראות תחת מיקרוסקופ. חשוב לוודא כי מתלי התא המוכנים כוללים צבירות תאים מינימליות, מכיוון שצבירה של תאים לא רק מפחיתה את יעילות הזוגיות הבודדת, אלא גם יכולה לסתום את ערוצי המיקרו. אינטראקציה בין תאים בודדים ממלאת תפקיד חשוב בשליטה על אופני פעולה של תאים.השיטה שלנו יכולה לספק כלי יעיל שיסייע לחוקרים לחקור אינטראקציה בין תאים ברמת תא יחיד, מה שעלול להוביל לגילוי מנגנונים חדשים שלא ניתן להשיג בקלות ממחקרים מבוססי אוכלוסייה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Microfluidic מבוססי הידרודינמית מלכודת חלקיקים יחיד

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...