Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
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यह काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (105-2628-ई-400-001-MY2) से अनुदान और ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा, राष्ट्रीय चुंग सिंग विश्वविद्यालय और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों में पीएच.डी. कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।

1. नरम लिथोग्राफी द्वारा एक वेफर मोल्ड का निर्माण
नोट: मास्क पैटर्न डेटा हमारे पिछले प्रकाशन14में उपलब्ध है।
<ol><li>15 मिनट के लिए एक 120 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर निर्जली...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण में विभिन्न कोशिकाओं के अंतरकोशिकीय अन्योन्यक्रिया ट्यूमर17की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . सेल-सेल अन्योन्यक्रियाओं के तंत्र को समझने के लिए सह-संवर...

एकल कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के कुशल कब्जा और पर्याप्त संस्कृति स्थान प्रदान एकल कोशिकाओं के कई प्रकार के एकल सह संस्कृति प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं1. कमजोर पड़ने को सीमित करना आवश्यक उपकरणों की कम लागत के कारण, ऐसे प्रयोगों के लिए एकल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। हालांकि, Poison वितरण सीमा के कारण, अधिकतम एकल सेल अधिग्रहण संभावना केवल 37% है, प्रयोगात्मक आपरेशन कठिन और समय लेने वाली2बना रही है. इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग कर उच्च कुशलता से एकल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए Poison वितरण सीमा को दूर कर सकते हैं3. तथापि, महंगे इंस्थाइनेशन और अनुरक्षण लागत के कारण एफएसीएस कुछ प्रयोगशालाओं तक सुलभ नहीं हो सकता है। माइक्रोफेब्रिडेभित उपकरणों को हाल ही में एकल सेल ट्रैपिंग4,सिंगल सेल युग्मन5,और एकल सेल कल्चर अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है। इन उपकरणों को सही एकल कोशिकाओं में हेरफेर करने की क्षमता के आधार पर फायदेमंद होते हैं6,उच्च throughput प्रयोगों प्रदर्शन, या नमूना और अभिकर्मक खपत को कम. हालांकि, वर्तमान microfluidic उपकरणों के साथ कई सेल प्रकार के साथ एकल सेल सह संस्कृति प्रयोगों प्रदर्शन अभी भी Poisson वितरण1,7,8, या की अक्षमता की सीमा के कारण चुनौतीपूर्ण है उपकरणों एकल कोशिकाओंकेदो से अधिक प्रकार पर कब्जा करने के लिए 4,5,6,9,10.
उदाहरण के लिए, योन एट अल. सेल सेल बातचीत अध्ययन11के लिए एक microfluidic डिवाइस की सूचना दी. यह डिवाइस कोशिकाओं को एक कक्ष में युग्मित करने के लिए गुणनात्मक विधि का उपयोग करता है. हालांकि, यह केवल डिवाइस संरचना में ज्यामितीय प्रतिबंधों के कारण दो अलग-अलग सेल प्रकारों की युग्मन प्राप्त कर सकता है। ली एट अल से एक और रिपोर्ट पर कब्जा करने और एकल कोशिकाओं12जोड़ी के लिए एक नियतात्मक विधि का प्रदर्शन किया. इस डिवाइस नियतात्मक विधि से बाँधना दक्षता बढ़ जाती है, लेकिन यह लंबे समय तक आपरेशन कोशिकाओं जोड़ी के लिए आवश्यक समय तक सीमित है. विशेष रूप से, दूसरा सेल कैप्चर केवल 24 ज के बाद सतह से जुड़ा हुआ है के बाद किया जा सकता है. झाओ एट अल. एक एकल सेल13के दो प्रकार पर कब्जा करने के लिए एक छोटी बूंद आधारित microfluidic डिवाइस की सूचना दी। हम यह पाया जा सकता है कि छोटी बूंद-आधारित माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस अभी भी पॉइसन वितरण तक सीमित है और केवल गैर-अनुलग्न कोशिकाओं पर उपयोग किया जा सकता है, और खेती की प्रक्रिया के दौरान संस्कृति समाधान को बदलना संभव नहीं है।
पहले, हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक "हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप" विकसित की है जो नियतात्मक हाइड्रोडायनामिक बलों का उपयोग संस्कृति कक्ष में एकल-सेल के कई प्रकार ों पर कब्जा करने के लिए करता है और बाद में सेल सह-संस्कृति प्रयोग का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन कर सकता है व्यक्तिगत सेल प्रवास व्यवहार के तहत सेल सेल बातचीत14| हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप में इकाइयों के एक सरणीवाले ससेट शामिल होते हैं जिनमें प्रत्येक में सर्पाकार उप-पास चैनल, एक कैप्चर-साइट, और एक संस्कृति कक्ष होता है। सर्पिन बाइ-पास चैनल और संस्कृति कक्ष के बीच प्रवाह प्रतिरोध में अंतर का उपयोग करके, और एक विशेष रूप से डिजाइन आपरेशन प्रक्रिया, एकल कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार बार बार संस्कृति कक्ष में कब्जा कर लिया जा सकता है. विशेष रूप से, संस्कृति कक्ष के पर्याप्त स्थान न केवल सेल पर कब्जा करने के दौरान बाहर निकाल दिया जा रहा से सेल को रोका जा सकता है, लेकिन यह भी कोशिकाओं के प्रसार के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करते हैं, proliferate और माइग्रेट, लाइव एकल सेल बातचीत के अवलोकन के लिए अनुमति देता है. इस आलेख में, हम इस डिवाइस और विस्तृत प्रोटोकॉल चरणों के उत्पादन पर ध्यान केंद्रित।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

सेल सह संस्कृति परख व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार के बीच सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए बेहतर कैंसर सहित रोगों के जीव विज्ञान को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, पारंपरिक सह-संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करके अत्यधिक विषम कोशिका आबादी में अंतरकोशिकीय अन्योन्यक्रियाओं के जटिल तंत्र को स्पष्ट करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि कोशिका उपजनसंख्या की विषमता औसत मूल्यों से अस्पष्ट है; पारंपरिक सह-संस्कृति प्रणालियों का उपयोग केवल जनसंख्या संकेत का वर्णन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार को ट्रैक करने में असमर्थ हैं। इसके अलावा, पारंपरिक एकल सेल प्रयोगात्मक तरीकों क्योंकि Poison वितरण के सेल हेरफेर में कम दक्षता है. Microfabricated उपकरणों एकल सेल अध्ययन के लिए एक उभरती हुई तकनीक है क्योंकि वे सही उच्च throughput पर एकल कोशिकाओं में हेरफेर कर सकते हैं और नमूना और अभिकर्मक खपत को कम कर सकते हैं. यहाँ, हम अवधारणा और कई एकल सेल सह संस्कृति के लिए एक microfluidic चिप के आवेदन का वर्णन. चिप कुशलतापूर्वक एक संस्कृति कक्ष में एकल कोशिकाओं के कई प्रकार पर कब्जा कर सकते हैं ($46%) और एकल-सेल स्तर पर सेल-सेल इंटरैक्शन के तहत कोशिकाओं के व्यवहार (उदा., माइग्रेशन, प्रसार, आदि) का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त संस्कृति स्थान उपयोगी है। लसीका endothelial कोशिकाओं और मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा जीने के लिए कई एकल सेल बातचीत अध्ययन के लिए microfluidic मंच पर एक एकल सेल सह संस्कृति प्रयोग करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

थे डिवाइस है a थ्री-लेयर स्ट्रक्चर अस showed बी द क्रॉस-सेक्शन फोटोग्राफ ऑफ़ a कट पीडीएमएस डिवाइस (चित्र 1A). पहली परत में एक कैप्चर-साइट (6.0 डिग्री चौड़ाई में और 4.6 डिग्री मीटर ऊंचाई ...

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Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

यह रिपोर्ट एकल कोशिका संस्कृति प्रयोग स्थापित करने के लिए एक माइक्रोफ्लूइड चिप-आधारित विधि का वर्णन करती है जिसमें कई एकल कोशिकाओं के उच्च दक्षता युग्मन और सूक्ष्म विश्लेषण प्राप्त किए जा सकते हैं।

एक Microfluidic चिप के साथ एक निर्धारणात्मक मैनर में एकल सेल आधारित सह संस्कृति की स्थापना

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

सेल व्यवहार पर सेल-सेल इंटरैक्शन के प्रभाव को समझने के लिए गतिशील लाइव सेल छवि अवलोकन के साथ कैप्चर दक्षता को प्रभावी ढंग से जोड़ना महत्वपूर्ण है। यह ट्यूब एक बड़े कक्ष में कई एकल कोशिकाओं को अत्यधिक कुशलता से कैप्चर कर सकती है, और कई एकल-सेल इंटरैक्शन व्यवहारों की गतिशील ट्रैकिंग के लिए पर्याप्त संस्कृतियों का आधार प्रदान कर सकती है। पीडीएमएस डिवाइस तैयार करके शुरू करें।वजन वाली डिश में एक वेफर मोल्ड रखें जिसमें 100 माइक्रोलीटर ट्राइक्लोरोसिलेन को एक डेसीकेटर में रखें और 15 मिनट के लिए वैक्यूम लगाएं। वैक्यूम बंद करो और कम से कम एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डक्षेर मोल्ड में लविनाइज करें। पीडीएमएस बेस और पीडीएमएस इलाज एजेंट को दस से एक के अनुपात में मिलाएं, फिर 15 सेंटीमीटर डिश में वेफर मोल्ड पर मिश्रण के कुल 20 ग्राम डालें ।15 सेंटीमीटर डिश को एक डेसीकेटर में रखें और डेढ़ मिनट के लिए वैक्यूम लगाएं। इसके बाद डिश को डेसीकेटर से निकालकर पीडीएमएस में अवशिष्ट हवा के बुलबुले को नाइट्रोजन गैस से खत्म कर दें। दो से चार घंटे तक 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में डिश रखकर पीडीएमएस का इलाज करें।समाप्त होने पर, वेफर मोल्ड से पीडीएमएस प्रतिकृति को हटा दें, और पीडीएमएस पर 1.5 मिलीमीटर इनलेट और 0.5 मिलीमीटर आउटलेट पंच करें। पीडीएमएस प्रतिकृति और स्लाइड सतह को हटाने योग्य टेप के साथ साफ करें। सतह को ऑक्सीजन प्लाज्मा से ट्रीट करें।फिर, मैन्युअल रूप से पीडीएमएस प्रतिकृति को स्लाइड के साथ संरेखित करें और उन्हें एक दूसरे के संपर्क में लाएं। पीडीएमएस स्लाइड को एक दिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में छोड़ दें। अगले दिन पीडीएमएस डिवाइस को पीबीएस से भरे कंटेनर में विसर्जित कर दें।इसे डिसिकेटर में रखें, और 15 मिनट के लिए वैक्यूम लगाएं। डिवाइस को सेल कल्चर हुड में ले जाएं और इसे 30 मिनट के लिए यूवी लाइट के साथ स्टरलाइज करें । पीडीएमएस डिवाइस बफर को मध्यम से बदलें और इसे एक दिन के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।जब कोशिकाएं 70 से 80% की मजबूती हासिल करती हैं, तो संस्कृति माध्यम को हटा दें और धीरे-धीरे उन्हें पीबीएस के पांच मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। DMEM/F-12 मध्यम के एक मिलीलीटर WNT5B sh4 और pLKO-GFP कोशिकाओं के लिए एक माइक्रोमोलर फ्लोरोसेंट डाई युक्त जोड़ें, और उन्हें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट । इनक्यूबेशन के बाद, धीरे से बाँझ PBS के पांच मिलीलीटर के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोने, PBS को हटा दें, और ०.२५% Tripsin-EDTA के दो मिलीलीटर जोड़ें ।कमरे के तापमान पर चार मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट, तो धीरे से सेल टुकड़ी को बढ़ावा देने के लिए संस्कृति पकवान नल । WNT5B sh4 और pLKO-GFP कोशिकाओं को तितर-बितर करने के लिए DMEM/F-12 माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें, कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें तीन मिनट के लिए ३०० xg पर अपकेंद्रित्र करें । सुपरनेट को हटा दें और डीएमईएम/एफ-12 माध्यम के एक मिलीलीटर में सेल पेलेट को धीरे-धीरे निलंबित करें।सेल एकत्रीकरण को रोकने के लिए प्रति मिलीलीटर तीन गुना दस से पांचवीं कोशिकाओं की एकाग्रता पर सेल निलंबन का एक मिलीलीटर तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें। डिवाइस और सिरिंज पंप के आउटलेट के बीच पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन ट्यूब को कनेक्ट करें। माध्यम निकालें, और तैयार सेल निलंबन का एक माइक्रोलीटर पीडीएमएस डिवाइस के इनलेट में जोड़ें।इसके बाद, प्रति मिनट 0.3 माइक्रोलीटर की प्रवाह दर पर सिरिंज पंप का उपयोग करके डिवाइस में सेल सस्पेंशन लोड करें। डिवाइस के इनलेट में DMEM/F-12 माध्यम का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर एक सिरिंज पंप का उपयोग कर डिवाइस में माध्यम लोड । प्रति मिनट 10 माइक्रोलीटर की प्रवाह दर पर सिरिंज पंप के साथ डिवाइस में DMEM/F12 माध्यम के 0.3 माइक्रोलीटर लोड करें।कोशिकाओं को लोड करने के बाद, ट्यूब को हटा दें, और एक बंद संस्कृति प्रणाली बनाने के लिए पॉलीओल्फिन टेप के साथ इनलेट और आउटलेट को सील करें। पीडीएमएस डिवाइस को 10 सेंटीमीटर कल्चर डिश में ले जाएं और मीडियम के वाष्पीकरण से बचने के लिए डिवाइस के चारों ओर 10 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस जोड़ें । ट्रिपल एकल सेल संस्कृति के लिए एक इनक्यूबेटर के लिए संस्कृति पकवान हस्तांतरण।पीडीएमएस डिवाइस में कैप्चर साइट के साथ तीन-लेयर स्ट्रक्चर है जो कल्चर चैंबर और बाईपास चैनल से जुड़ता है । संस्कृति कक्ष और बाईपास चैनल के बीच प्रवाह प्रतिरोध में अंतर सेल को कैप्चर स्थिति में प्रवाहित करने की अनुमति देता है, जिसके कारण निम्नलिखित सेल बाईपास चैनल के माध्यम से अगले कैप्चर साइट पर जाता है। भाटा कदम पर कब्जा साइट से सेल जारी करने और संस्कृति कक्ष में भेजने के लिए प्रयोग किया जाता है।इस प्रोटोकॉल की सेल कैप्चर दक्षता का मूल्यांकन तीन अलग-अलग सेल प्रकारों पर किया गया था। मानव लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाएं, या एलईसीएस, मानव मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा टी2.6 कोशिकाएं WNT5B-विशिष्ट लघु हेयरपिन आरएनए, और पीएलको-जीएफपी वेक्टर नियंत्रण कोशिकाओं को व्यक्त करती हैं। तीन प्रदर्शित कोशिकाओं की एकल सेल कैप्चर क्षमता एलईसी के लिए लगभग 71%, WNT5B sh4 कोशिकाओं के लिए 74%, और पीएल्को-जीएफपी कोशिकाओं के लिए 78%थी।ट्रिपल सिंगल-सेल कैप्चर एफिशिएंसी 48% थी इस विधि का उपयोग लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं और स्क्वैमस कैंसर कोशिकाओं की कई एकल-कोशिका सह-संस्कृतियों के लिए किया जा सकता है, और कोशिका के प्रसार और आकृति विज्ञान को माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि तैयार सेल निलंबन में न्यूनतम सेल समुच्चय है, क्योंकि सेल समुच्चय न केवल एकल बांधना दक्षता को कम करता है, बल्कि माइक्रो चैनलों को भी रोक सकता है। अलग-अलग कोशिकाओं के बीच सेल-सेल इंटरैक्शन सेल व्यवहार को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।हमारी विधि शोधकर्ताओं को एक एकल सेल स्तर पर सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने में मदद करने के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान कर सकती है, जिससे नए तंत्रों की खोज हो सकती है जिसे जनसंख्या आधारित अध्ययनों से आसानी से प्राप्त नहीं किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

एक microfluidic आधारित एकल कण के लिए द्रव्यगतिकी जाल

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On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

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एकल कक्षों के बहुमुखी रासायनिक विश्लेषण के लिए एक microfluidic चिप

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

प्रीडिजाइन्ड आकार और आकार के साथ पॉलीमेरिक और बायोहाइब्रिड फाइबर का माइक्रोफ्लुइडिक फैब्रिकेशन

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

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This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

एक multichannel दोहरे बिजली क्षेत्र microfluidic चिप का उपयोग कर लंग कैंसर कोशिकाओं के Electrotaxis अध्ययन

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A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

उच्च throughput एकल सेल अलगाव और संस्कृति के लिए एक microfluidic मंच

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Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

में Microengineered मानव आंत्र Villi साथ रहने का Microbiome के सह-संस्कृति एक आंत-ऑन-ए-चिप Microfluidic डिवाइस

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

छवि निर्देशित, लेजर आधारित संवहनी व्युत्पन्न Microfluidic नेटवर्क का निर्माण

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

सूखी फिल्म Photoresist-विद्युत Microfluidic आधारित सेंसर मंच: उपकरण निर्माण, पर चिप परख तैयारी, और सिस्टम ऑपरेशन

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...