Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Ministero della Scienza e della Tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e dal Ph.D. Program in Ingegneria dei Tessuti e Medicina Rigenerativa, dalla National Chung Hsing University e dagli Istituti nazionali di ricerca sulla salute.

1. Fabbricazione di uno stampo di wafer mediante litografia morbida
NOTA: i dati del modello maschera sono disponibili nella pubblicazione precedente14.
<ol><li>Disidratare un wafer di silicio da 4 pollici in un forno a 120 gradi per 15 min.</li>
	<li>Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2 fotoresist negativo su un wafer di silicio da 4 pollici a 1.000 giri/m per 30 s per creare uno strato di 5 m di spessore (strato #1).</li>
	<li>Cuocere lo strato morbido #1 su una pias...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Le interazioni intercellulari di varie cellule nel microambiente tumorale svolgono un ruolo importante nella progressione del tumore17. Per comprendere il meccanismo delle interazioni cellula-cellula, i sistemi di cocoltura vengono utilizzati come metodo analitico comune. Tuttavia, più tipi di cellule e l'eterogeneità delle cellule stesse hanno portato a complessità sperimentale e difficoltà analitiche.
Il chip di chiusura idrodinamico consente il caricamento di pi?...

L'acquisizione efficiente di diversi tipi di celle singole e la fornitura di spazio di coltura sufficiente sono necessari per esperimenti di cocoltura a cella singola di più tipi di celle singole1. Limitare la diluizione è il metodo più comunemente usato per preparare le singole cellule per tali esperimenti, a causa del basso costo delle attrezzature necessarie. Tuttavia, a causa della limitazione della distribuzione di Poisson, la probabilità massima di acquisizione di una singola cellula è solo del 37%, rendendo l'operazione sperimentale laboriosa e dispendiosa in termini di tempo2. Al contrario, l'utilizzo dello smistamento delle celle attivate a fluorescenza (FACS) può superare la limitazione della distribuzione di Poisson per preparare in modo elevato le singole celle3. Tuttavia, FACS potrebbe non essere accessibile ad alcuni laboratori a causa di costosi costi di strumentazione e manutenzione. I dispositivi microfabbricati sono stati recentemente sviluppati per l'intrappolamento a cella singoladi 4, l'abbinamento a cella singola5e le applicazioni di coltura a cella singola. Questi dispositivi sono vantaggiosi in base alla loro capacità di manipolare con precisione singole celle6, eseguire esperimenti ad alto rendimento o ridurre il consumo di campioni e reagenti. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti di cocoltura a cella singola con più tipi di cellule con gli attuali dispositivi microfluidici è ancora difficile a causa della limitazione della distribuzione di Poisson1,7,8, o l'incapacità di i dispositivi per catturare più di due tipi di celle singole4,5,6,9,10.
Per esempio, Yoon et al. ha segnalato un dispositivo microfluidico per lo studio di interazione cellulare-cellula11. Questo dispositivo utilizza il metodo probabilistico per accoppiare le celle in una camera. Tuttavia, può ottenere solo l'associazione di due diversi tipi di cella a causa di restrizioni geometriche nella struttura del dispositivo. Un altro rapporto di Lee et al. ha dimostrato un metodo deterministico per catturare e accoppiare singole celle12. Questo dispositivo aumenta l'efficienza di accoppiamento con il metodo deterministico, ma è limitato dal tempo di funzionamento prolungato richiesto per accoppiare le celle. In particolare, l'acquisizione della seconda cella può essere eseguita solo dopo che la prima cella catturata è stata attaccata alla superficie dopo che24 h. Possiamo riscontrare che il dispositivo microfluidico a base di gocciolamento è ancora limitato alla distribuzione di Poisson e può essere utilizzato solo su cellule non collegate, e non è possibile modificare la soluzione di coltura durante il processo di coltivazione.
In precedenza, abbiamo sviluppato un "chip di chiusura idrodinamico" microfluidico che utilizza forze idrodinamiche deterministiche per catturare più tipi di cellule singole nella camera di coltura e successivamente può eseguire esperimenti di cocoltura cellulare per analizzare comportamento di migrazione delle singole cellule nelle interazioni cellula-cellula14. Il chip di chiusura idrodinamico comprende un array di unità che contengono ciascuno un canale di passaggio serpentino, un sito di cattura e una camera di coltura. Utilizzando la differenza di resistenza al flusso tra il canale di passaggio serpentino e la camera di coltura, e una procedura operativa appositamente progettata, diversi tipi di singole cellule possono essere ripetutamente catturati nella camera di coltura. In particolare, l'ampio spazio della camera di coltura può non solo impedire che la cellula venga arrossata durante la cattura delle cellule, ma anche fornire spazio sufficiente per le cellule per diffondersi, proliferare e migrare, consentendo l'osservazione di interazioni vive a singola cellula. In questo articolo, ci concentriamo sulla produzione di questo dispositivo e passaggi di protocollo dettagliati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

I saggi di cocoltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule per comprendere meglio la biologia delle malattie tra cui il cancro. Tuttavia, è difficile chiarire il complesso meccanismo delle interazioni intercellulari in popolazioni cellulari altamente eterogenee che utilizzano sistemi di cocoltura convenzionali perché l'eterogeneità della sottopopolazione cellulare è oscurata dai valori medi; i sistemi di cocoltura convenzionali possono essere utilizzati solo per descrivere il segnale della popolazione, ma non sono in grado di monitorare il comportamento delle singole cellule. Inoltre, i metodi sperimentali convenzionali a cella singola hanno una bassa efficienza nella manipolazione cellulare a causa della distribuzione di Poisson. I dispositivi microfabbricati sono una tecnologia emergente per gli studi a cella singola perché possono manipolare con precisione singole cellule ad alta produttività e possono ridurre il consumo di campioni e reagenti. Qui, descriviamo il concetto e l'applicazione di un chip microfluidico per più cocolture unicellulari. Il chip è in grado di catturare in modo efficiente più tipi di singole cellule in una camera di coltura (46%) e dispone di uno spazio di coltura sufficiente utile per studiare il comportamento delle cellule (ad esempio, migrazione, proliferazione, ecc.) sotto l'interazione cellula-cellula a livello di cellula singola. Le cellule endotiliche linfotiche e il carcinoma a cellule squamose orali sono stati utilizzati per eseguire un esperimento di cocoltura a cellule singole sulla piattaforma microfluidica per studi di interazione tra le singole imcellere dal vivo.

Il dispositivo ha una struttura a tre strati come mostrato dalla fotografia trasversale di un dispositivo PDMS tagliato (Figura 1A). Il primo strato contiene un sito di cattura (6,0 m di larghezza e 4,6 m di altezza) che collega la camera di coltura e il canale di passaggio. La differenza di resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale by-pass fa sì che le cellule scorra nella posizione di cattura e riempiono l'ingresso del picc...

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Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Questo rapporto descrive un metodo microfluidico basato su chip per impostare un esperimento di coltura a cella singola in cui è possibile ottenere l'abbinamento ad alta efficienza e l'analisi microscopica di più cellule singole.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

È fondamentale combinare efficacemente l'efficienza di acquisizione con l'osservazione dinamica dell'immagine delle cellule vive per comprendere l'effetto dell'interazione cellula-cellula sui comportamenti delle cellule. Questo tubo può catturare in modo altamente efficiente più celle singole in una camera più grande e fornire una base di colture sufficiente, per il tracciamento dinamico di più comportamenti di interazione a cella singola. Iniziare preparando il dispositivo PDMS.Mettere uno stampo wafer nella piastra di pesatura con 100 microlitri di triclorosilano in un essiccatore e applicare un vuoto per 15 minuti. Fermare il vuoto e salinizzare lo stampo del wafer nell'essiccatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerizzazione PDMS con un rapporto di dieci a uno, quindi versare un totale di 20 grammi della miscela sullo stampo del wafer in un piatto di 15 centimetri.Mettere il piatto di 15 centimetri in un essiccatore e applicare un vuoto per un minuto e mezzo. Quindi rimuovere il piatto dall'essiccatore ed eliminare le bolle d'aria residue nel PDMS con gas azoto. Curare il PDMS mettendo il piatto in forno a 65 gradi celsius per due o quattro ore.Al termine, rimuovere la replica PDMS dallo stampo del wafer e perforare un ingresso di 1,5 millimetri e una presa di 0,5 millimetri sul PDMS. Pulire la replica PDMS e la superficie di scorrimento con nastro rimovibile. Trattare la superficie con plasma di ossigeno.Quindi, allineare manualmente la replica PDMS con la diapositiva e metterli in contatto tra loro. Lasciare la diapositiva PDMS nel forno a 65 gradi Celsius per un giorno. Il giorno successivo, immergere il dispositivo PDMS in un contenitore pieno di PBS.Posizionarlo nell'essiccatore e applicare il vuoto per 15 minuti. Spostare il dispositivo su un cappuccio di coltura cellulare e sterilizzarlo con luce UV per 30 minuti. Sostituire il buffer del dispositivo PDMS con il mezzo e incubarlo a quattro gradi Celsius per un giorno.Quando le cellule raggiungono una confluenza dal 70 all'80%, rimuovere il mezzo di coltura e lavarle delicatamente tre volte con cinque millilitri di PBS. Aggiungere un millilitro di mezzo DMEM/F-12 contenente un colorante fluorescente micromolare alle celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con cinque millilitri di PBS sterile, rimuovere il PBS e aggiungere due millilitri dello 0,25% di tripside-EDTA.Incubare le cellule per quattro minuti a temperatura ambiente, quindi toccare delicatamente il piatto di coltura per promuovere il distacco cellulare. Aggiungere quattro millilitri di mezzo DMEM/F-12 per disperdere le cellule WNT5B sh4 e pLKO-GFP, trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugarle a 300 xg per tre minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere delicatamente il pellet cellulare in un millilitro di mezzo DMEM/F-12.Preparare un millilitro di sospensione cellulare a una concentrazione di tre per dieci-quinta cella per millilitro e tenerlo sul ghiaccio per evitare l'aggregazione cellulare. Collegare il tubo di politetrafluoroetilene tra l'uscita del dispositivo e la pompa della siringa. Rimuovere il supporto e aggiungere un microlitro della sospensione cellulare preparata nell'ingresso del dispositivo PDMS.Quindi, caricare la sospensione cellulare nel dispositivo utilizzando una pompa per siringhe a una portata di 0,3 microlitri al minuto. Aggiungere un microlitro di mezzo DMEM/F-12 nell'ingresso del dispositivo, quindi caricare il mezzo nel dispositivo utilizzando una pompa per siringhe. Caricare 0,3 microlitri di mezzo DMEM/F12 nel dispositivo con la pompa della siringa a una portata di 10 microlitri al minuto.Dopo aver caricato le celle, rimuovere il tubo e sigillare l'ingresso e l'uscita con nastro poliolefine per creare un sistema di coltura chiuso. Spostare il dispositivo PDMS su un piatto di coltura di 10 centimetri e aggiungere 10 millilitri di PBS sterile intorno al dispositivo per evitare l'evaporazione del mezzo. Trasferire il piatto di coltura in un incubatore per la tripla coltura uni-cella.Il dispositivo PDMS ha una struttura a tre livelli con un sito di acquisizione che si collega alla camera di coltura e al canale di bypass. La differenza nella resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale di bypass consente alla cella di fluire nella posizione di acquisizione, il che fa sì che la cella seguente attraversa il canale di bypass fino al sito di acquisizione successivo. Il passo di reflusso viene utilizzato per rilasciare la cella dal sito di acquisizione e inviarla nella camera di coltura.L'efficienza di acquisizione delle celle di questo protocollo è stata valutata su tre diversi tipi di celle. Cellule endoteliali linfatiche umane, o LEC, cellule del carcinoma a cellule squamose orali umane T2.6 che esprimono RNA a forcina corta specifico per WNT5B e cellule di controllo vettoriale pLKO-GFP. L'efficienza di acquisizione a cella singola delle tre celle dimostrate era di circa il 71% per i LED, del 74% per le celle sh4 WNT5B e del 78% per le celle pLKO-GFP.La tripla efficienza di cattura a singola cellula è stata del 48%Questo metodo può essere utilizzato per più co-colture unicellari di cellule endoteliali linfatiche e cellule tumorali squamose, e la proliferazione e la morfologia della cellula possono essere osservate al microscopio. È importante assicurarsi che le sospensioni cellulari preparate abbiano aggregati cellulari minimi, perché gli aggregati cellulari non solo riducono l'efficienza di associazione singola, ma possono anche ostruire i micro canali. L'interazione cellula-cella tra le singole cellule svolge un ruolo importante nel controllo dei comportamenti delle cellule.Il nostro metodo può fornire uno strumento efficace per aiutare i ricercatori a studiare l'interazione cellula-cellula a un singolo livello cellulare, il che può portare alla scoperta di nuovi meccanismi che non possono essere facilmente ottenuti da studi basati sulla popolazione.

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A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultura del vivere Microbiome con Microengineered umana intestinale Villi in un Gut-on-a-chip microfluidico dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...