Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

이 작품은 과학기술부(105-2628-E-400-001-MY2)의 보조금과 조직공학 및 재생의학 박사 과정, 국립중흥대학교 및 국립보건연구원의 지원으로 지원되었다.

1. 부드러운 석판화에 의한 웨이퍼 금형 의 제조
참고: 마스크 패턴 데이터는 이전 발행물14에서사용할 수 있습니다.
<ol><li>4인치 실리콘 웨이퍼를 120°C 오븐에서 15분 동안 탈수합니다.</li>
	<li>스핀 코트 4 g의 SU-8 2 네거티브 포토레지스트를 1,000 rpm에서 4인치 실리콘 웨이퍼에 30s의 5 μm 두께층(레이어 #1)을 생성한다.</li>
	<li>소프트 베이킹 층을 65°C 핫플레이...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

종양 미세환경에서 다양한 세포의 세포간 상호작용은종양(17)의진행에 중요한 역할을 한다. 세포 세포 상호 작용의 메커니즘을 이해하기 위해, 공동 배양 시스템은 일반적인 분석 방법으로 사용된다. 그러나, 다중 세포 모형 및 세포 자체의 이질성은 실험적인 복잡성 및 분석 어려움으로 이끌어 냈습니다.
유체역학적 shuttling 칩은 희석 방법 및 마이크로웰 플...

단일 세포의 상이한 유형의 효율적인 포획 및 충분한 배양 공간을 제공하는 것은 단일 세포의 여러 유형의 단일 세포 공동 배양 실험에 필요합니다1. 희석을 제한하는 것은 필요한 장비의 낮은 비용으로 인해 이러한 실험을 위해 단일 세포를 제조하는 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 푸아송 분포 제한으로 인해 최대 단일 셀 획득 확률은 37%에 불과하여 실험 작업이 힘들고 시간이 많이 소요됩니다2. 이에 반해, 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 이용하여 푸아송 분포 한계를 극복할 수 있고 단일 세포를 고효율로준비한다(3). 그러나 FACS는 비용이 많이 드는 계측 및 유지 보수 비용으로 인해 일부 실험실에서 접근하지 못할 수 있습니다. 마이크로 패브릭 장치는 최근 단일 셀 트래핑4,단일 셀 페어링5및 단일 세포 배양 응용 을 위해 개발되었습니다. 이러한 장치는 단일 셀6을정확하게 조작하거나, 높은 처리량의 실험을 수행하거나, 샘플 및 시약 소비를 줄이는 능력에 따라 유리합니다. 그러나, 현재 미세 유체 장치를 가진 다중 세포 모형을 가진 단세포 동시 배양 실험을 수행하는 것은 푸아송 분포1,7,8,또는 무능력의 한계 때문에 아직도 도전적입니다 장치는 단일 셀4,5,6,9,10의두 가지 유형 이상을 캡처합니다.
예를 들어, Yoon et al.은 세포-세포 상호작용 연구를 위한 미세유체 장치를보고한 11. 이 장치는 확률적 방법을 사용하여 세포를 하나의 챔버에 페어링합니다. 그러나 장치 구조의 기하학적 제한으로 인해 두 개의 서로 다른 셀 유형의 페어링만 달성할 수 있습니다. Lee et al.의 또 다른 보고서는 단일셀(12)을캡처하고 페어링하는 결정적인 방법을 시연했습니다. 이 장치는 결정적 방법에 의해 페어링 효율을 증가하지만 셀을 페어링하는 데 필요한 연장된 작동 시간에 의해 제한됩니다. 구체적으로, 제2 세포 포획은 24h 이후 의 표면에 부착된 제1 포획된 세포가 단일세포(13)의두 가지 유형을 포착하는 액적계 미세유체 장치를 보고한 후에만 수행될 수 있다. 우리는 액적 계 미세 유체 장치가 여전히 푸아송 분포에 국한되어 있고 부착되지 않은 세포에서만 사용할 수 있으며 재배 과정에서 배양 용액을 변경할 수 없다는 것을 알 수 있습니다.
이전에는 결정적 유체역학적 힘을 활용하여 여러 유형의 단일 세포를 배양 챔버로 포착하고 세포 공동 배양 실험을 수행하여 분석할 수 있는 미세 유체 "유체 역학 적 shuttling chipschip"을 개발했습니다. 세포 세포 상호 작용의 밑에 개별적인 세포 이동 행동14. 유체역학적 shuttling 칩은 각각 뱀 바이패스 채널, 캡처 사이트 및 배양 챔버를 포함하는 배열된 단위 세트를 포함한다. 서펜타인 바이패스 채널과 배양 챔버 사이의 유동 저항의 차이를 이용하여, 특별히 설계된 작동 절차, 상이한 유형의 단일 세포가 배양 챔버내로 반복적으로 포획될 수 있다. 특히, 배양 챔버의 충분한 공간은 세포가 세포 를 포착하는 동안 플러시되는 것을 방지 할뿐만 아니라 세포가 확산, 증식 및 마이그레이션할 수있는 충분한 공간을 제공하여 살아있는 단일 세포 상호 작용을 관찰 할 수 있습니다. 이 문서에서는 이 장치의 생산과 자세한 프로토콜 단계에 중점을 둡니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

세포 공동 배양 시험은 암을 포함하여 질병의 생물학을 더 잘 이해하기 위하여 다른 세포 모형 사이 세포 세포 상호 작용을 공부를 위해 널리 이용되었습니다. 그러나, 세포 하위 집단의 이질성이 평균 값에 의해 가려지기 때문에 기존의 공동 배양 시스템을 사용하여 고도로 이질적인 세포 집단에서 세포 간 상호 작용의 복잡한 메커니즘을 명확히하는 것은 어렵다; 종래의 공동 배양 시스템은 모집단 신호를 설명하는 데만 사용될 수 있지만 개별 세포 동작을 추적할 수 없습니다. 더욱이, 종래의 단세포 실험 방법은 푸아송 분포 때문에 세포 조작에서 낮은 효율을 가지고 있다. 마이크로 패브릭 장치는 높은 처리량으로 단일 셀을 정확하게 조작할 수 있고 샘플 및 시약 소비를 줄일 수 있기 때문에 단일 셀 연구를 위한 새로운 기술입니다. 여기서, 우리는 다중 단세포 공동 배양을 위한 미세 유체 칩의 개념 그리고 응용을 기술합니다. 이 칩은 배양 챔버에서 여러 유형의 단일 세포를 효율적으로 캡처할 수 있습니다(~46%). 및 단일 세포 수준에서 세포-세포 상호작용 하에서 세포의 행동(예를 들어, 이동, 증식 등)을 연구하는데 유용한 충분한 배양 공간을 갖는다. 림프내피 세포 및 경구 편평 상피 세포 암종은 살아있는 다중 단세포 상호작용 연구를 위한 미세유체 플랫폼에서 단일 세포 공동 배양 실험을 수행하기 위해 사용되었다.

이 장치는 컷 PDMS 장치의 단면 사진에 도시된 바와 같이 3층 구조를갖는다(도 1A). 첫 번째 레이어에는 배양 챔버와 바이패스 채널을 연결하는 캡처 사이트(폭 6.0 μm 및 높이 4.6 μm)가 포함되어 있습니다. 배양 챔버와 바이패스 채널 사이의 유동 저항의 차이로 인해 세포가 포획 위치로 흐르고 작은 경로의 입구를 채웁니다. 포획 위치에서 ?...

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Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

이 보고서는 여러 단일 세포의 고효율 페어링 및 현미경 분석을 달성할 수 있는 단일 세포 배양 실험을 설정하는 미세 유체 칩 기반 방법을 설명합니다.

미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

캡처 효율과 동적 라이브 셀 이미지 관찰을 효과적으로 결합하여 세포 상호 작용이 세포 행동에 미치는 영향을 이해하는 것이 중요합니다. 이 튜브는 더 큰 챔버에서 여러 단일 세포를 매우 효율적으로 캡처할 수 있으며, 다중 단일 세포 상호 작용 동작을 동적으로 추적하기 위한 충분한 배양 기반을 제공할 수 있습니다. 먼저 PDMS 장치를 준비합니다.웨이퍼 몰드를 100마이크로리터의 트리클로로실레인을 건조기에 놓고 15분간 진공청소기를 발라주세요. 진공을 멈추고 건조기에서 웨이퍼 몰드를 섭씨 37도에서 최소 한 시간 동안 살리시게 하십시오. PDMS 베이스와 PDMS 경화제를 10대 1의 비율로 혼합한 다음, 15센티미터 접시에 웨이퍼 몰드에 총 20그램의 혼합물을 붓습니다.15센티미터 의 접시를 건조기에 넣고 1분 반 동안 진공을 가드합니다. 그런 다음 건조기에서 접시를 제거하고 질소 가스로 PDMS의 잔류 기포를 제거합니다. 접시를 오븐에 넣고 2~4시간 동안 65도의 오븐에 놓아 PDMS를 치료합니다.완료되면 웨이퍼 금형에서 PDMS 복제본을 제거하고 1.5mm 입구와 PDMS의 0.5밀리미터 콘센트를 펀치합니다. 분리형 테이프로 PDMS 복제본과 슬라이드 표면을 청소합니다. 산소 플라즈마로 표면을 치료합니다.그런 다음 PDMS 복제본을 슬라이드와 수동으로 정렬하여 서로 접촉하게 합니다. 하루 동안 65도 의 온도 오븐에 PDMS 슬라이드를 둡니다. 다음 날, PBS로 채워진 컨테이너에 PDMS 장치를 침지합니다.건조기에 넣고 15분 동안 진공을 바르습니다. 장치를 세포 배양 후드로 이동하여 30 분 동안 UV 빛으로 살균하십시오. PDMS 장치 버퍼를 중간 크기로 교체하고 하루 동안 섭씨 4도에서 배양합니다.세포가 70~80%의 인플루언서를 달성하면 배양 배지를 제거하고 PBS의 5밀리리터로 세 번 부드럽게 세척합니다. WNT5B sh4 및 pLKO-GFP 세포에 1개의 마이크로몰러 형광염을 포함하는 DMEM/F-12 배지의 1밀리리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 멸균 PBS의 5 밀리리터로 세포를 세 번 부드럽게 씻고, PBS를 제거하고, 0.25%의 트립신-EDTA의 2밀리리터를 추가합니다.실온에서 4분 동안 세포를 배양한 다음 배양 접시를 부드럽게 탭하여 세포 분리를 촉진합니다. DMEM/F-12 배지 4밀리리터를 추가하여 WNT5B sh4 및 pLKO-GFP 세포를 분산시키고 세포를 15밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 3분 동안 300xg으로 분산시합니다. 상체를 제거하고 DMEM/F-12 배지의 1밀리리터에서 셀 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다.밀리리터당 3회에서 5번째 세포의 농도로 세포 현탁액 1밀리리터를 준비하고 세포 응집을 방지하기 위해 얼음위에 보관하십시오. 장치의 콘센트와 주사기 펌프 사이에 폴리테트라플루오로틸렌 튜브를 연결합니다. 매체를 제거하고 준비된 셀 서스펜션의 마이크로리터 1개를 PDMS 장치의 입구에 넣습니다.다음으로, 분당 0.3 마이크로리터의 유속으로 주사기 펌프를 사용하여 셀 서스펜션을 장치에 적재한다. DMEM/F-12 배지 의 마이크로리터 를 장치의 입구에 추가한 다음 주사기 펌프를 사용하여 매체를 장치에 로드합니다. DMEM/F12 배지의 0.3 마이크로리터를 분당 10마이크로리터의 유속으로 주사기 펌프로 장치에 적재한다.셀을 적재한 후 튜브를 제거하고 폴리올레핀 테이프로 입구와 콘센트를 밀봉하여 폐쇄배양 시스템을 만듭니다. PDMS 장치를 10센티미터 배양 접시로 이동하고 매체의 증발을 피하기 위해 장치 주위에 멸균 PBS 10 밀리리터를 추가합니다. 배양 접시를 3배의 단일 세포 배양을 위한 인큐베이터로 옮기.PDMS 장치에는 배양 챔버 및 바이패스 채널에 연결하는 캡처 사이트가 있는 3층 구조가 있습니다. 배양 챔버와 바이패스 채널 간의 유동 저항의 차이로 셀이 캡처 위치로 흐르게 되어 다음 셀이 우회 채널을 거쳐 다음 캡처 사이트로 이동하게 됩니다. 역류 단계는 포획 부위에서 세포를 방출하고 배양 챔버로 전송하는 데 사용됩니다.이 프로토콜의 세포 포획 효율은 세 가지 상이한 세포 유형에 대해 평가되었다. 인간 림프내피 세포, 또는 LEC, 인간 구강 편평상피 세포 암 T2.6 세포는 WNT5B 특이적 짧은 헤어핀 RNA및 pLKO-GFP 벡터 제어 세포를 발현한다. 3개의 입증된 세포의 단세포 포획 효율은 LECs의 약 71%, WNT5B sh4 세포에 대한 74%, pLKO-GFP 세포에 대한 78%였다.상기 삼중 단세포 포획 효율은 48%로 림프 내피 세포 및 편평암세포의 다중 단일세포 공동 배양에 사용될 수 있고, 세포의 증식 및 형태학은 현미경으로 관찰될 수 있다. 셀 응집체가 단일 페어링 효율을 감소시킬 뿐만 아니라 마이크로 채널을 막을 수 있기 때문에 준비된 셀 서스펜션에 최소한의 셀 응집체가 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 개별 적인 세포 사이 세포 세포 상호 작용 세포 행동을 통제에 중요 한 역할을.우리의 방법은 연구원이 인구 기지를 둔 연구 결과에서 쉽게 얻을 수 없는 새로운 기계장치의 발견으로 이끌어 낼 수 있는 단 하나 세포 수준에서 세포 상호 작용을 공부하는 것을 돕기 위하여 효율적인 공구를 제공할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

단일 입자 Microfluidic 기반 유체 트랩

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

연구

생체공학

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

온칩 내피 염증성 Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

미리 설계된 크기와 모양의 중합체 및 바이오 하이브리드 섬유의 미세 유체 제조

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

혈관 유래 미세 유체 네트워크의 이미지 유도, 레이저 기반의 제조

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...