Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra departementet for vitenskap og teknologi (105-2628-E-400-001-MY2), og Ph.D. program i vev engineering og regenererende medisin, National Chung Hsing University og National Health Research Institutes.

1. fabrikasjon av en wafer mold av myke Litografi
Merk: maske mønster data er tilgjengelig i forrige publikasjon14.
<ol><li>Tørke en 4-tommers silisium wafer i en 120 ° c ovnen i 15 min.</li>
	<li>Spin coat 4 g av SU-8 2 negative photoresist på en 4-tommers silisium wafer på 1 000 RPM for 30 s for å skape en 5 μm tykt lag (lag #1).</li>
	<li>Soft bake lag #1 på en 65 ° c kokeplate i 1 min og deretter overføre lag #1 til en 95 ° c kokeplate i 3 minutter.</li...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Den intercellulære interaksjoner av ulike celler i tumor mikromiljøet spille en viktig rolle i progresjon av svulsten17. For å forstå mekanismen av celle-celle interaksjoner, co-kultur systemer brukes som en felles analytisk metode. Imidlertid har flere celletyper og heterogenitet av cellene selv ført til eksperimentell kompleksitet og analytiske vanskeligheter.
Den hydrodynamisk skytteltrafikk-brikken tillater flere enkelt celle lasting i kultur kammeret med en de...

Effektiv fangst av ulike typer enkeltceller og gi tilstrekkelig kultur plass er nødvendig for én celle co-kultur eksperimenter av flere typer enkeltceller1. Begrense fortynning er den mest brukte metoden for å forberede enkeltceller for slike eksperimenter, på grunn av den lave kostnaden av utstyr som kreves. På grunn av begrensningen for Poisson-fordelingen er den maksimale sannsynligheten for enkelt celle anskaffelse bare 37%, noe som gjør den eksperimentelle operasjonen arbeidskrevende og tidkrevende2. Hvis du derimot bruker fluorescens aktivert celle sortering (FACS), kan det komme til å overkomme Poisson-fordelingen for å forberede enkeltceller3på en effektiv måte. Imidlertid kan FACS ikke være tilgjengelig for noen laboratorier på grunn av dyre instrumentering og vedlikeholdskostnader. Microfabricated enheter har nylig blitt utviklet for enkelt celle overlapping4, enkelt celle sammenkobling5og enkelt cellekultur applikasjoner. Disse enhetene er fordelaktige basert på deres evne til å manipulere enkeltceller6, utføre eksperimenter med høy gjennomstrømming, eller redusere prøve-og reagens forbruket. Men å utføre enkelt celle co-kultur eksperimenter med flere celletyper med gjeldende mikrovæskebasert enheter er fortsatt utfordrende på grunn av begrensning av Poisson-fordelingen1,7,8eller manglende evne til enhetene for å fange mer enn to typer enkeltceller4,5,6,9,10.
For eksempel Yoon et al. rapporterte en mikrovæskebasert enhet for celle-celle interaksjonsstudie11. Denne enheten bruker sannsynlighetsbasert-metoden til å sammenkoble celler i ett kammer. Det kan imidlertid bare oppnå sammenkobling av to forskjellige celletyper på grunn av geometriske begrensninger i enhets strukturen. En annen rapport fra Lee et al. demonstrerte en deterministisk metode for å fange og sammenkoble enkeltceller12. Denne enheten øker paring effektiviteten ved deterministisk metoden, men det er begrenset av den langvarige operasjonstiden som kreves for å pare celler. Nærmere bestemt kan den andre celle fangst bare utføres etter at den første fanget cellen er festet til overflaten etter 24 h. Zhao et al. rapporterte en dråpe-basert mikrovæskebasert enhet for å fange to typer av en enkelt celle13. Vi kan finne at dråpe BAS ert mikrovæskebasert enheten fortsatt er begrenset til Poisson-fordelingen og kan bare brukes på ikke-tilknyttede celler, og det er ikke mulig å endre kultur løsningen under dyrking prosessen.
Tidligere har vi utviklet en mikrovæskebasert "hydrodynamisk skytteltrafikk chip" som utnytter deterministisk hydrodynamisk styrker til å fange flere typer enkelt celle inn i kultur kammeret og kan deretter utføre celle co-kultur eksperiment for å analysere individuell celle migrasjon atferd under celle-celle interaksjoner14. Den hydrodynamisk skytteltrafikk chip består av en plassert sett av enheter som hver inneholder en Serpentine by-pass kanal, en fangst-området, og et kultur kammer. Ved å bruke forskjellen i strømningsmotstand mellom Serpentine by-pass kanal og kultur kammer, og en spesialdesignet operasjon prosedyre, ulike typer enkeltceller kan gjentatte ganger tatt inn i kultur kammeret. Spesielt, den store plassen i kultur kammeret kan ikke bare hindre at cellen blir spyles under celle fangst ut, men også gi tilstrekkelig plass for cellene til å spre seg, spre og migrere, slik at for å observere av Live enkelt celle interaksjoner. I denne artikkelen fokuserer vi på produksjonen av denne enheten og detaljerte protokoll trinn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Cell co-kultur analysene har vært mye brukt for å studere celle-celle interaksjoner mellom ulike celletyper for å bedre forstå biologi av sykdommer, inkludert kreft. Det er imidlertid utfordrende å klargjøre den komplekse mekanismen for intercellulære interaksjoner i svært heterogene celle populasjoner ved hjelp av konvensjonelle co-kultur systemer fordi heterogenitet av celle pasientpopulasjonen er skjult av de gjennomsnittlige verdiene; den konvensjonelle co-kultur systemer kan bare brukes til å beskrive befolkningen signalet, men er ute av stand til å spore individuelle celler atferd. Videre har konvensjonelle eksperimentelle metoder lav virkningsgrad i celle manipulering på grunn av Poisson-fordelingen. Microfabricated enheter er en ny teknologi for enkelt celle studier fordi de kan manipulere enkeltceller med høy gjennomstrømming og kan redusere prøve-og reagens forbruket. Her beskriver vi konseptet og anvendelsen av en mikrovæskebasert chip for flere single-Cell co-kulturer. Brikken kan effektivt fange opp flere typer enkeltceller i et kultur kammer (~ 46%) og har en tilstrekkelig kultur plass nyttig å studere cellene atferd (f. eks migrasjon, spredning, etc.) under celle-celle interaksjon på single-cellenivå. Lymfatisk endothelial celler og muntlig plateepitel celle kreft ble brukt til å utføre en enkelt celle co-kultur eksperiment på mikrovæskebasert plattform for Live flere single-celle interaksjonsstudier.

Enheten har en tre-lags struktur som vist ved tverrsnitt fotografi av et kutt PDMS enhet (figur 1a). Det første laget inneholder en fangst-site (6,0 μm i bredde og 4,6 μm i høyde) som forbinder kultur kammeret og by-pass kanal. Forskjellen i strømningsmotstand mellom kultur kammeret og by-pass-kanalen får cellene til å strømme inn i fangst posisjonen og fylle inngangen til den lille stien. Når en celle er fanget i opptaks posisjonen,...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Denne rapporten beskriver en mikrovæskebasert chip-basert metode for å sette opp et enkelt cellekultur eksperiment der høy effektivitet sammenkobling og mikroskopisk analyse av flere enkeltceller kan oppnås.

Etablering single-Cell basert co-kulturer i en deterministisk måte med en Mikrovæskebasert chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Det er viktig å effektivt kombinere fangsteffektivitet med dynamisk levende cellebildeobservasjon for å forstå effekten av cellecelleinteraksjon på celleatferd. Dette røret kan effektivt fange opp flere enkeltceller i et større kammer, og gi en tilstrekkelig kulturbase, for dynamisk sporing av flere encellede interaksjonsatferd. Start med å klargjøre PDMS-enheten.Legg en wafer-mugg i veiefatet med 100 mikroliter triklorosilan i en desiccator og påfør et vakuum i 15 minutter. Stopp vakuumet og salt wafer-formen i desiccatoren ved 37 grader Celsius i minst en time. Bland PDMS-basen og PDMS herdingsmiddelet i et forhold på ti til en, og hell deretter totalt 20 gram av blandingen på waferformen i en 15-centimeters tallerken.Legg 15-centimeters parabolen i en desiccator og påfør et vakuum i ett og et halvt minutt. Fjern deretter fatet fra desiccatoren og eliminere gjenværende luftbobler i PDMS med nitrogengass. Herd PDMS ved å plassere parabolen i en ovn på 65 grader celsius i to til fire timer.Når du er ferdig, fjerner du PDMS-replikaen fra wafer-formen og slår et 1,5 millimeter innløp og 0,5 millimeter utløp på PDMS. Rengjør PDMS-replikaen og lysbildeoverflaten med avtagbart bånd. Behandle overflaten med oksygenplasma.Deretter justerer du PDMS-replikaen manuelt etter lysbildet og bringer dem i kontakt med hverandre. La PDMS-sklien stå i 65 graders Celsius-ovnen i én dag. Neste dag senker du PDMS-enheten i en beholder fylt med PBS.Plasser den i desiccatoren, og påfør vakuum i 15 minutter. Flytt enheten til en cellekulturhette og steriliser den med UV-lys i 30 minutter. Erstatt PDMS-enhetsbufferen med medium og inkuber den ved fire grader Celsius i en dag.Når cellene oppnår 70 til 80% samløpet, fjern kulturmediet og vask dem forsiktig tre ganger med fem milliliter PBS. Tilsett en milliliter DMEM/F-12 medium som inneholder ett mikromolarfluoreserende fargestoff til WNT5B sh4- og pLKO-GFP-cellene, og inkuber dem i 30 minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjonen vasker du forsiktig cellene tre ganger med fem milliliter steril PBS, fjerner PBS og legger til to milliliter på 0,25% Trypsin-EDTA.Inkuber cellene i fire minutter ved romtemperatur, og trykk deretter forsiktig på kulturretten for å fremme celleavløsning. Tilsett fire milliliter DMEM / F-12 medium for å spre WNT5B sh4 og pLKO-GFP celler, overføre cellene til en 15-milliliter tube og sentrifuge dem på 300 xg i tre minutter. Fjern den overnaturlige og forsiktig re-suspendere cellepellet i ett milliliter DMEM /F-12 medium.Forbered en milliliter cellesuspensjon med en konsentrasjon på tre ganger ti til femte celler per milliliter og hold den på is for å forhindre celleaggregasjon. Koble polytetrafluoretylenrøret mellom utløpet av enheten og sprøytepumpen. Fjern mediet, og legg til en mikroliter av den forberedte cellefjæringen i innløpet til PDMS-enheten.Deretter legger du cellefjæringen inn i enheten ved hjelp av en sprøytepumpe med en strømningshastighet på 0,3 mikroliter per minutt. Legg til en mikroliter DMEM/F-12 medium i innløpet på enheten, og legg deretter mediet inn i enheten ved hjelp av en sprøytepumpe. Legg 0,3 mikroliter DMEM/F12 medium inn i enheten med sprøytepumpen med en strømningshastighet på 10 mikroliter per minutt.Etter at cellene er lastet, fjern røret og forsegle innløpet og utløpet med polyolefintape for å skape et lukket kultursystem. Flytt PDMS-enheten til en 10-centimeters kulturrett og tilsett 10 milliliter steril PBS rundt enheten for å unngå fordampning av medium. Overfør kulturretten til en inkubator for trippel encellekultur.PDMS-enheten har en tre-lags struktur med et fangstområde som kobles til kulturkammeret og bypass-kanalen. Forskjellen i strømningsmotstand mellom kulturkammeret og bypass-kanalen gjør at cellen kan strømme inn i fangstposisjonen, noe som fører til at følgende celle går gjennom bypasskanalen til neste fangststed. Reflukstrinnet brukes til å frigjøre cellen fra fangststedet og sende den inn i kulturkammeret.Cellefangsteffektiviteten til denne protokollen ble evaluert på tre forskjellige celletyper. Humane lymfatiske endotelceller, eller LECer, humant oral plateepitelkarsinom T2.6 celler som uttrykker WNT5B-spesifikke korthårnål RNA, og pLKO-GFP vektorkontrollceller. Enkeltcelledefangsteffektiviteten til de tre viste cellene var omtrent 71 % for LED-ene, 74 % for WNT5B sh4-celler og 78 % for pLKO-GFP-cellene.Trippel encellede fangsteffektivitet var 48%Denne metoden kan brukes til flere encellede co-kulturer av lymfatiske endotelceller og plateepitelkreftceller, og cellens spredning og morfologi kan observeres under et mikroskop. Det er viktig å sørge for at de forberedte cellesuspensjonene har minimale celleaggregater, fordi celleaggregater ikke bare reduserer enkeltkoblingseffektivitet, men kan også tette mikrokanalene. Cellecelleinteraksjon mellom individuelle celler spiller en viktig rolle i å kontrollere celleatferd.Vår metode kan gi et effektivt verktøy for å hjelpe forskere med å studere cellecelleinteraksjon på enkeltcellenivå, noe som kan føre til oppdagelsen av nye mekanismer som ikke lett kan fås fra befolkningsbaserte studier.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Microfluidic Chip for Allsidig Kjemisk analyse av enkeltceller

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fabrikasjon av polymere og biohybridfibre med forhåndsdesignet størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En mikrofluid Chip for ICPMS Sample Innledning

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikrofluid plattform for High-throughput encellede Isolering og kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur of Living mikrobiomer med mikro-oppbygd Menneskelig tarmtotter i en Gut-on-a-Chip mikrofluid Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Bildestyrt, Laser-baserte Fabrikasjon av vaskulær-avledet microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Tørr Film Photoresist-baserte elektrokjemisk Microfluidic Biosensor plattform: Enheten fabrikasjon, på prosessoren analysen forberedelser og systemdriften

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...