Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Ministério da ciência e tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e o programa de doutorado em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, Universidade Nacional Chung Hsing e institutos nacionais de pesquisa em saúde.

1. fabricação de um molde da bolacha pela litografia macia
Nota: os dados do padrão de máscara estão disponíveis em nossa publicação anterior14.
<ol><li>Desidratar uma bolacha de silício de 4 polegadas num forno a 120 ° c durante 15 min.</li>
	<li>O revestimento da rotação 4 g do fotororesist negativo SU-8 2 em um wafer do silicone de 4 polegadas em 1.000 rpm para 30 s para criar uma camada grossa de 5 μm (camada #1).</li>
	<li>A camada macia do Bake #1 e...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

As interações intercelular de várias pilhas no microambiente do tumor jogam um papel importante na progressão do tumor17. A fim compreender o mecanismo de interações da pilha-pilha, os sistemas da cocultura são usados como um método analítico comum. Entretanto, os tipos múltiplos da pilha e a heterogeneidade das pilhas elas mesmas conduziram à complexidade experimental e às dificuldades analíticas.
O chip de shuttling hidrodinâmico permite o carregamento m...

A captura eficiente de diferentes tipos de células individuais e o fornecimento de espaço de cultura suficiente são necessários para experimentos de cocultura de célula única de vários tipos de células individuais1. A diluição limitante é o método mais comumente utilizado para preparar as células individuais para tais experimentos, devido ao baixo custo do equipamento necessário. No entanto, devido à limitação da distribuição de Poisson, a probabilidade máxima de aquisição de célula única é de apenas 37%, tornando a operação experimental trabalhosa e demorada2. Por outro lado, usar a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) pode superar a limitação de distribuição de Poisson para preparar as células únicas3de alta eficiência. No entanto, o FACS pode não estar acessível a alguns laboratórios devido à dispendiosa instrumentação e custo de manutenção. Os dispositivos microfabricados foram desenvolvidos recentemente para a única pilha que interceptação4, única pilha que emparelha5, e únicas aplicações da cultura da pilha. Esses dispositivos são vantajosos com base em sua capacidade de manipular com precisão as células únicas6, realizar experimentos de alta taxa de transferência ou reduzir o consumo de amostras e reagentes. No entanto, realizar experimentos de cocultura de célula única com vários tipos de células com os atuais dispositivos microfluílicos ainda é desafiador devido à limitação da distribuição de Poisson1,7,8ou incapacidade de os dispositivos para capturar mais de dois tipos de células individuais4,5,6,9,10.
Por exemplo, Yoon et al. relataram um dispositivo microfluídico para o estudo de interação célula-célula11. Este dispositivo usa o método probabilístico para emparelhar as células em uma câmara. No entanto, ele só pode alcançar o emparelhamento de dois tipos de células diferentes devido a restrições geométricas na estrutura do dispositivo. Outro relato de Lee et al. demonstrou um método determinístico para capturar e emparelhar células individuais12. Este dispositivo é aumenta a eficiência de emparelhamento pelo método determinístico mas é limitado pelo tempo prolongado da operação exigido para emparelhar pilhas. Especificamente, a segunda captura de célula só pode ser realizada depois que a primeira célula capturada é anexada à superfície após 24 h. Zhao et al. relataram um dispositivo microfluídico baseado em gotas para capturar dois tipos de uma única célula13. Podemos encontrar que o dispositivo microfluídico baseado em gotas ainda está limitado à distribuição de Poisson e só pode ser usado em células não anexadas, e não é possível alterar a solução de cultura durante o processo de cultivo.
Anteriormente, desenvolvemos um microfluídico "chip de shuttling hidrodinâmico" que utiliza forças hidrodinâmicas determinísticas para capturar vários tipos de célula única na câmara de cultura e pode subsequentemente realizar experimento de cocultura celular para analisar comportamento de migração de células individuais em interações Cell-Cell14. O chip de shuttling hidrodinâmico compreende um conjunto de unidades vestiu que cada um contém um canal de passagem por serpentina, um local de captura e uma câmara de cultura. Usando a diferença na resistência do fluxo entre a canaleta serpentina do by-pass e a câmara da cultura, e um procedimento especialmente projetado da operação, os tipos diferentes de únicas pilhas podem repetidamente ser capturados na câmara da cultura. Notavelmente, o amplo espaço da câmara de cultura não só pode impedir que a célula seja lavada durante a captura de células, mas também fornecer espaço suficiente para as células se espalham, proliferam e migram, permitindo a observação de interações de células únicas ao vivo. Neste artigo, nós nos concentramos na produção deste dispositivo e etapas detalhadas do protocolo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Os ensaios de cocultura celular têm sido amplamente utilizados para estudar as interações célula-célula entre diferentes tipos de células para entender melhor a biologia das doenças, incluindo o câncer. No entanto, é desafiador esclarecer o complexo mecanismo de interações intercelulares em populações de células altamente heterogêneas usando sistemas de cocultura convencionais, pois a heterogeneidade da subpopulação celular é obscurecida pelos valores médios; os sistemas convencionais da cocultura podem somente ser usados para descrever o sinal da população, mas são incapazes de controlar o comportamento individual das pilhas. Além disso, os métodos experimentais convencionais de célula única têm baixa eficiência na manipulação celular por causa da distribuição de Poisson. Os dispositivos microfabricados são uma tecnologia emergente para estudos de célula única porque eles podem manipular com precisão células individuais em alta taxa de transferência e podem reduzir o consumo de amostras e reagentes. Aqui, nós descrevemos o conceito e a aplicação de uma microplaqueta microfluídicos para coculturas da único-pilha múltipla. A microplaqueta pode eficientemente capturar tipos múltiplos de únicas pilhas em uma câmara da cultura (~ 46%) e tem um espaço de cultura suficiente útil para estudar o comportamento das células (por exemplo, migração, proliferação, etc.) interação célula-célula no nível de célula única. As pilhas endothelial linfáticas e a carcinoma de pilha Squamous oral foram usadas para executar um experimento da cocultura da único-pilha na plataforma microfluídicos para estudos múltiplos vivos da interação da único-pilha.

O dispositivo tem uma estrutura de três camadas, como mostrado pela fotografia de seção transversal de um dispositivo PDMS cortado (Figura 1a). A primeira camada contém um local de captura (6,0 μm de largura e 4,6 μm de altura) que conecta a câmara de cultura e o canal de passagem. A diferença na resistência de fluxo entre a câmara de cultura e o canal de passagem faz com que as células fluam para a posição de captura e preencham...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Este relatório descreve um método chip-baseado microfluídicos para estabelecer uma única experiência da cultura da pilha em que o emparelhamento de alta eficiência e a análise microscópica de pilhas únicas múltiplas podem ser conseguidos.

Estabelecendo co-culturas baseadas em uma única célula de forma determinística com um chip Microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

É fundamental combinar efetivamente a eficiência de captura com a observação dinâmica da imagem celular ao vivo para entender o efeito da interação célula-célula nos comportamentos celulares. Este tubo pode capturar de forma altamente eficiente múltiplas células únicas em uma câmara maior, e fornecer uma base de culturas suficiente, para o rastreamento dinâmico de múltiplos comportamentos de interação unicelular. Comece preparando o dispositivo PDMS.Coloque um molde de wafer no prato de pesagem com 100 microliters de triclorosilano em um dessecador e aplique um vácuo por 15 minutos. Pare o vácuo e salinize o molde de wafer no desiccator a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Misture a base PDMS e o agente de cura PDMS em uma proporção de dez para um, em seguida, despeje um total de 20 gramas da mistura sobre o molde de wafer em um prato de 15 centímetros.Coloque o prato de 15 centímetros em um desiccador e aplique um vácuo por um minuto e meio. Em seguida, remova o prato do desiccador e elimine bolhas de ar residuais no PDMS com gás nitrogênio. Cure o PDMS colocando o prato em um forno a 65 graus celsius por duas a quatro horas.Quando terminar, remova a réplica PDMS do molde do wafer e bata uma entrada de 1,5 milímetros e uma tomada de 0,5 milímetros no PDMS. Limpe a réplica PDMS e a superfície de slides com fita removível. Trate a superfície com plasma de oxigênio.Em seguida, alinhe manualmente a réplica PDMS com o slide e leve-as a contato entre si. Deixe o PDMS deslizar no forno Celsius de 65 graus por um dia. No dia seguinte, mergulhe o dispositivo PDMS em um contêiner cheio de PBS.Coloque-o no desiccador e aplique o vácuo por 15 minutos. Mova o dispositivo para um capô de cultura celular e esterilize-o com luz UV por 30 minutos. Substitua o tampão do dispositivo PDMS por médio e incuba-o a quatro graus Celsius por um dia.Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, remova o meio de cultura e lave-as três vezes com cinco mililitros de PBS. Adicione um mililitro de meio DMEM/F-12 contendo um corante fluorescente micromolar às células WNT5B sh4 e pLKO-GFP, e incuba-as por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, lave suavemente as células três vezes com cinco mililitros de PBS estéreis, remova o PBS e adicione dois mililitros de 0,25% Trypsin-EDTA.Incubar as células por quatro minutos à temperatura ambiente e, em seguida, toque suavemente no prato de cultura para promover o descolamento celular. Adicione quatro mililitros de média DMEM/F-12 para dispersar as células WNT5B sh4 e pLKO-GFP, transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrifuá-las a 300 xg por três minutos. Remova o supernatante e suspenda suavemente a pelota da célula em um mililitro do meio DMEM/F-12.Prepare um mililitro de suspensão celular a uma concentração de três vezes dez a cinco células por mililitro e mantenha-o no gelo para evitar a agregação celular. Conecte o tubo de politetrafluoroetileno entre a saída do dispositivo e a bomba de seringa. Remova o meio e adicione um microliter da suspensão celular preparada na entrada do dispositivo PDMS.Em seguida, carregue a suspensão da célula no dispositivo usando uma bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 0,3 microliters por minuto. Adicione um microliter de meio DMEM/F-12 na entrada do dispositivo e carregue o meio no dispositivo usando uma bomba de seringa. Carregue 0,3 microliters de meio DMEM/F12 no dispositivo com a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 10 microliters por minuto.Depois que as células forem carregadas, remova o tubo e sele a entrada e a saída com fita poliolefina para criar um sistema de cultura fechado. Mova o dispositivo PDMS para um prato de cultura de 10 centímetros e adicione 10 mililitros de PBS estéreis ao redor do dispositivo para evitar a evaporação do meio. Transfira o prato de cultura para uma incubadora para a cultura tripla unicelular.O dispositivo PDMS possui uma estrutura de três camadas com um local de captura que se conecta à câmara de cultura e ao canal de desvio. A diferença na resistência ao fluxo entre a câmara de cultura e o canal de desvio permite que a célula flua para a posição de captura, o que faz com que a célula seguinte passe pelo canal de desvio até o próximo local de captura. O passo de refluxo é usado para liberar a célula do local de captura e enviá-la para a câmara de cultura.A eficiência de captura celular deste protocolo foi avaliada em três tipos diferentes de células. Células endoteliais linfáticas humanas, ou LECs, carcinoma escamoso oral humano T2.6 células expressando RNA de grampo curto específico WNT5B, e células de controle vetorial pLKO-GFP. As eficiências de captura unicelular das três células demonstradas foram de aproximadamente 71% para os LECs, 74% para células sh4 WNT5B e 78% para as células pLKO-GFP.A eficiência de captura tripla unicelular foi de 48% Este método pode ser usado para múltiplas co-culturas unicelulares de células linfáticas e células cancerígenas escamosas, e a proliferação e morfologia da célula podem ser observadas sob um microscópio. É importante garantir que as suspensões celulares preparadas tenham agregados celulares mínimos, pois os agregados celulares não só reduzem a eficiência de pareamento único, mas também podem entupir os micro canais. A interação célula-célula entre células individuais desempenha um papel importante no controle dos comportamentos celulares.Nosso método pode fornecer uma ferramenta eficiente para ajudar os pesquisadores a estudar a interação célula-célula em um único nível celular, o que pode levar à descoberta de novos mecanismos que não podem ser facilmente obtidos a partir de estudos de base populacional.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

A Armadilha hidrodinâmica microfluídicos baseados em partículas individuais

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Bioengenharia

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Fabricação microfluida de fibras poliméricas e biohibridas com tamanho e forma predesigned

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Um chip microfluídico para ICPMS Amostra Introdução

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Estudos de pulmão células de câncer usando um Multichannel Dual-elétrico-campo Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...