Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Министерства науки и техники (105-2628-E-400-001-MY2), а также докторской программой в области тканевой инженерии и регенеративной медицины, Национальным университетом Чунг-Синг и Национальными научно-исследовательскими институтами здравоохранения.

1. Изготовление вафельной формы с помощью мягкой литографии
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные шаблона маски доступны в нашей предыдущей публикации14.
<ol><li>Обезвоживать 4-дюймовую кремниевую пластину в духовке 120 градусов по Цельсию в течение 15 минут.</li>
	<li>Спин пальто 4 г SU-8 2...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Межклеточные взаимодействия различных клеток в микроокружении опухоли играют важную роль в прогрессировании опухоли17. Для того, чтобы понять механизм взаимодействия клеток, системы сокультуры используются в качестве общего аналитического метода. Однако несколько типов...

Эффективный захват различных типов одиночных ячеек и обеспечение достаточного пространства культуры необходимы для экспериментов одноклеточной совместной культуры нескольких типов одиночных ячеек1. Ограничение разбавления является наиболее часто используемым методом подготовки одиночных ячеек для таких экспериментов, из-за низкой стоимости необходимого оборудования. Однако, из-за ограничения распределения Poisson, максимальная вероятность приобретения одной ячейки составляет всего 37%, что делает экспериментальную операцию трудоемкой и трудоемкой2. В отличие от этого, с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) может преодолеть ограничение распределения Пуассона для высокоэффективной подготовки одиночных ячеек3. Однако FACS может быть недоступен для некоторых лабораторий из-за дорогостоящих затрат на оборудование и техническое обслуживание. Микрофабрикаты устройства были недавно разработаны для одной ячейки захвата4, одноклеточных сопряжения5, и одноклеточных приложений культуры. Эти устройства являются выгодными на основе их способности точно манипулировать одиночными ячейками6,выполнять высокопроизводительные эксперименты, или уменьшить потребление образцов и реагентов. Тем не менее, выполнение одноклеточных экспериментов совместной культуры с несколькими типами клеток с текущими микрофлюидными устройствами по-прежнему является сложной задачей из-за ограничения распределения Пуассон1,7,8, или неспособность устройства для захвата более двух типов одиночных ячеек4,5,6,9,10.
Например, Yoon et al. сообщили о микрофлюидном устройстве для исследования взаимодействия клеток11. Это устройство использует вероятностный метод для сопряжения ячеек в одной камере. Тем не менее, он может достичь только сопряжения двух различных типов клеток из-за геометрических ограничений в структуре устройства. Другой доклад От Ли и др. продемонстрировали детерминированный метод захвата и сопряжения одиночных ячеек12. Это устройство повышает эффективность сопряжения с помощью детерминированного метода, но оно ограничено длительным временем работы, требуемым для сопряжения клеток. В частности, второй захват ячейки может быть выполнен только после того, как первая захваченная ячейка прикреплена к поверхности после 24 ч. Чжао и др. сообщили о микрофлепированном устройстве на основе капель для захвата двух типов одной ячейки13. Мы можем обнаружить, что микрофлюидное устройство на основе капель по-прежнему ограничено распределением Пуассона и может использоваться только на неподключенных клетках, и изменить культурное решение в процессе выращивания невозможно.
Ранее мы разработали микрофлюидный "гидродинамический челночный чип", который использует детерминированные гидродинамические силы для захвата нескольких типов одноклеточных в камеру культуры и может впоследствии выполнять эксперимент клеточной кокультуры для анализа поведение миграции отдельных клеток при взаимодействии клеток14. Гидродинамический челночный чип состоит из массивных наборов юнитов, каждый из которых содержит серпантинный объездной канал, место захвата и культурную камеру. Используя разницу в сопротивлении потока между серпантинным объездным каналом и культурной камерой, и специально разработанную процедуру работы, различные типы одиночных ячеек могут быть повторно захвачены в камеру культуры. Примечательно, что достаточное пространство камеры культуры может не только предотвратить промывку клетки во время захвата клеток, но и обеспечить достаточное пространство для клеток, чтобы распространяться, размножаться и мигрировать, что позволяет наблюдать живые одноклеточные взаимодействия. В этой статье мы сосредоточимся на производстве этого устройства и подробных протокольных шагах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Клеточная ко-культура анализы были широко использованы для изучения клеточных взаимодействий между различными типами клеток, чтобы лучше понять биологию заболеваний, включая рак. Однако прояснить сложный механизм межклеточного взаимодействия в высокоразногенных популяциях клеток с помощью обычных систем совместной культуры сложно, поскольку неоднородность клеточной субпопуляции затушевывается средними значениями; обычные системы совместной культуры могут использоваться только для описания сигнала популяции, но неспособны отслеживать поведение отдельных клеток. Кроме того, обычные одноклеточные экспериментальные методы имеют низкую эффективность в манипуляции ячейками из-за распределения Пуассона. Микрофабрикаты устройства являются новой технологией для одноклеточных исследований, потому что они могут точно манипулировать одиночными клетками с высокой пропускной мощностью и могут уменьшить потребление образцов и реагентов. Здесь мы описываем концепцию и применение микрофлюидного чипа для нескольких одноклеточных кокультур. Чип может эффективно захватывать несколько типов одиночных ячеек в культурной камере (46%) и имеет достаточное пространство культуры, полезное для изучения поведения клеток (например, миграция, пролиферация и т.д.) при взаимодействии клеток на одноклеточном уровне. Лимфатические эндотелиальные клетки и оральные плоскоклеточные карциномы были использованы для выполнения одноклеточного эксперимента совместной культуры на микрофлюидной платформе для живых нескольких одноклеточных исследований взаимодействия.

Устройство имеет трехслойную структуру, о чем свидетельствует поперечная фотография разреза устройства PDMS(рисунок 1A). Первый слой содержит узел захвата (6,0 мкм в ширину и 4,6 мкм в высоту), который соединяет культурную камеру и канал объезда. Раз...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

В этом докладе описывается микрофлюидный чип-метод для создания эксперимента на одной культуре клеток, в котором может быть достигнут высокоэффективный спаривание и микроскопический анализ нескольких одиночных клеток.

Создание одноклеточных сокультур в детерминированном манусе с микрофлюидным чипом

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Очень важно эффективно сочетать эффективность захвата с динамическим наблюдением изображения живой клетки, чтобы понять влияние взаимодействия клеток и клеток на поведение клеток. Эта трубка может очень эффективно захватывать несколько одиночных ячеек в большей камере и обеспечивать достаточную основу культур для динамического отслеживания поведения нескольких одноклеточных взаимодействий. Начните с подготовки устройства PDMS.Поместите вафельную форму в блюдо для взвешивания со 100 микролитров трихлоросилана в desiccator и применить вакуум в течение 15 минут. Остановите вакуум и засолить форму пластины в опреснении при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере один час. Смешайте pdMS базы и PDMS лечения агента в соотношении 10 к одному, а затем залить в общей сложности 20 граммов смеси на вафельную форму в 15-сантиметровой тарелке.Поместите 15-сантиметровое блюдо в десикатор и нанесите вакуум на полтора минуты. Затем снимите блюдо с децикатора и устранить остаточные пузырьки воздуха в PDMS с азотным газом. Лечить PDMS, поместив блюдо в духовку при температуре 65 градусов по Цельсию в течение двух-четырех часов.После завершения, удалить реплику PDMS из вафельной формы, и удар 1,5-миллиметровый вход и 0,5-миллиметровый выход на PDMS. Очистите реплику PDMS и поверхность слайда съемной лентой. Лечить поверхность кислородной плазмой.Затем вручную выровнять реплику PDMS с слайдом и привести их в контакт друг с другом. Оставьте слайд PDMS в духовке 65 градусов по Цельсию на один день. На следующий день погрузите устройство PDMS в контейнер, наполненный PBS.Поместите его в desiccator, и применять вакуум в течение 15 минут. Перемести устройство на капот клеточной культуры и стерилизовать его ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Замените буфер устройства PDMS на средний и инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение одного дня.Когда клетки достигают 70 до 80% слияния, удалить культуру среды и аккуратно мыть их три раза с пятью миллилитров PBS. Добавьте один миллилитр среды DMEM/F-12, содержащий один микромолейный флуоресцентный краситель, в клетки WNT5B sh4 и pLKO-GFP и инкубировать их в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации, аккуратно мыть клетки три раза с пятью миллилитров стерильных PBS, удалить PBS, и добавить два миллилитров 0,25%Трипсин-ЭДТА.Инкубировать клетки в течение четырех минут при комнатной температуре, а затем осторожно нажмите культуру блюдо для содействия отслоения клеток. Добавьте четыре миллилитров среды DMEM/F-12 для разгона клеток WNT5B sh4 и pLKO-GFP, перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугайте их на 300 xg в течение трех минут. Удалите супернатант и аккуратно повторно приостановите гранулы клетки в один миллилитр среды DMEM/F-12.Подготовьте один миллилитр клеточной суспензии в концентрации три раза десять-пятый клетки на миллилитр и держать его на льду, чтобы предотвратить агрегацию клеток. Соедините полиэтиленовую трубку между розеткой устройства и шприц-насосом. Удалите носитель и добавьте один микролитер подготовленной клеточной подвески в вход устройства PDMS.Затем загрузите подвеску ячейки в устройство с помощью шприц-насоса со скоростью потока 0,3 микролитера в минуту. Добавьте один микролитер среды DMEM/F-12 в вход устройства, затем загрузите носитель в устройство с помощью шприц-насоса. Загрузите 0,3 микролитров среды DMEM/F12 в устройство со шприц-насосом со скоростью потока 10 микролитров в минуту.После загрузки клеток снимите трубку и запечатайте вход и розетку полиолефиновой лентой, чтобы создать закрытую культурную систему. Переместите устройство PDMS в 10-сантиметровую культурную тарелку и добавьте 10 миллилитров стерильных PBS вокруг устройства, чтобы избежать испарения среды. Перенесите культурное блюдо в инкубатор для тройной одноклеточной культуры.Устройство PDMS имеет трехслойную структуру с местом захвата, которое подключается к культурной камере и каналу обхода. Разница в сопротивлении потока между камерой культуры и каналом обхода позволяет ячейке течь в положение захвата, что приводит к тому, что следующая ячейка проходит через bypass-канал к следующему месту захвата. Рефлюксный шаг используется для освобождения ячейки от места захвата и отправки ее в камеру культуры.Эффективность захвата ячеев этого протокола оценивалась по трем различным типам ячеев. Человеческие лимфатические эндотелиальные клетки, или LECs, человеческие устные плоскоклеточные карциномы T2.6 клетки, выражающиеся WNT5B-специфические короткие шпильки РНК, и pLKO-GFP клетки управления вектором. Эффективность захвата одноклеточных трех продемонстрированых ячеек составила примерно 71% для LEC, 74% для клеток WNT5B sh4 и 78% для клеток pLKO-GFP.Тройная эффективность одноклеточного захвата составила 48%Этот метод может быть использован для нескольких одноклеточных ко-культур лимфатических эндотелиальных клеток и плоскоклеточных раковых клеток, а пролиферацию клетки и морфологию можно наблюдать под микроскопом. Важно убедиться, что подготовленные подвески ячейки имеют минимальные агрегаты ячеей, потому что агрегаты ячееок не только снижают эффективность одного спаривания, но и могут засорять микроканалы. Взаимодействие клеток и клеток между отдельными клетками играет важную роль в контроле поведения клеток.Наш метод может стать эффективным инструментом, который поможет исследователям изучить взаимодействие клеток и клеток на уровне одной клетки, что может привести к открытию новых механизмов, которые не могут быть легко получены из демографических исследований.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Микрожидкостных основе гидродинамической Ловушка для одиночных частиц

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip эндотелиальных Воспалительные фенотипирование

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Микрофлюидное изготовление полимерных и биогибридных волокон с заранее разработанным размером и формой

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Микрожидкостных чип для МСПМС ввода пробы

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Электротаксис Исследования клетки легких рака с использованием многоканального Dual-электрического поля микрофлюидных Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Совместное культивирование жизни микробиомом с Microengineered человека ворсинок кишечника в Gut-на-чипе микрожидкостных устройств

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Изображение наведением, на основе лазера Изготовление сосудисто-производных микрожидком сетей

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Сухой пленки фоторезиста на основе электрохимический биодатчик Microfluidic платформа: Изготовление устройств, на чипе Assay подготовка и работы системы

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...