Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (105-2628-E-400-001-MY2), y el Programa de Doctorado en Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, national Chung Hsing University e National Health Research Institutes.

1. Fabricación de un molde de oblea por litografía suave
NOTA: Los datos del patrón de máscara están disponibles en nuestra publicación anterior14.
<ol><li>Deshidratar una oblea de silicio de 4 pulgadas en un horno de 120 oC durante 15 min.</li>
	<li>Capa de giro 4 g de SU-8 2 fotorresistente negativo sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas a 1.000 rpm durante 30 s para crear una capa de 5 m de espesor (capa #1).</li>
	<li>La capa de horneado suave #1 en una pl...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Las interacciones intercelulares de varias células en el microambiente tumoral juegan un papel importante en la progresión del tumor17. Para comprender el mecanismo de las interacciones célula-célula, los sistemas de cocultivo se utilizan como un método analítico común. Sin embargo, múltiples tipos de células y la heterogeneidad de las propias células han llevado a complejidad experimental y dificultades analíticas.
El chip de cierre hidrodinámico permite la...

Se necesita una captura eficiente de diferentes tipos de celdas individuales y proporcionar suficiente espacio de cultivo para experimentos de cocultivo de una sola célula de varios tipos de celdas individuales1. Limitar la dilución es el método más utilizado para preparar las células individuales para tales experimentos, debido al bajo costo del equipo requerido. Sin embargo, debido a la limitación de distribución de Poisson, la probabilidad máxima de adquisición de una sola célula es de solo 37%, lo que hace que la operación experimental sea laboriosa y requiera mucho tiempo2. Por el contrario, el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede superar la limitación de distribución de Poisson para preparar de manera alta células individuales3. Sin embargo, es posible que algunos laboratorios no puedan acceder a FACS debido a los costosos costos de instrumentación y mantenimiento. Los dispositivos microfabricados se han desarrollado recientemente para el reventado de una sola célula4,el emparejamiento de una sola célula5y las aplicaciones de cultivo de una sola célula. Estos dispositivos son ventajosos en función de su capacidad para manipular con precisión celdas individuales6,realizar experimentos de alto rendimiento o reducir el consumo de muestras y reactivos. Sin embargo, realizar experimentos de cocultivo de una sola célula con varios tipos de células con los dispositivos microfluídicos actuales sigue siendo un desafío debido a la limitación de la distribución de Poisson1,7,8,o la incapacidad de los dispositivos para capturar más de dos tipos de células individuales4,5,6,9,10.
Por ejemplo, Yoon y otros informaron de un dispositivo microfluídico para el estudio de interacción célula-célula11. Este dispositivo utiliza el método probabilístico para emparejar celdas en una cámara. Sin embargo, sólo puede lograr el emparejamiento de dos tipos de celda diferentes debido a restricciones geométricas en la estructura del dispositivo. Otro informe de Lee y otros demostró un método determinista para capturar y emparejar celdas individuales12. Este dispositivo aumenta la eficiencia de emparejamiento por el método determinista, pero está limitado por el tiempo de operación prolongado necesario para emparejar celdas. Específicamente, la segunda captura de célula sin capacidad sólo se puede realizar después de que la primera celda capturada se une a la superficie después de 24 h. Zhao et al. informaron de un dispositivo microfluídico basado en gotas para capturar dos tipos de una sola celda13. Podemos encontrar que el dispositivo microfluídico basado en gotas todavía se limita a la distribución de Poisson y sólo se puede utilizar en células no conectadas, y no es posible cambiar la solución de cultivo durante el proceso de cultivo.
Anteriormente, hemos desarrollado un microfluido "chip de cierre hidrodinámico" que utiliza fuerzas hidrodinámicas deterministas para capturar múltiples tipos de una sola célula en la cámara de cultivo y posteriormente puede realizar experimentos de cocultivo celular para analizar comportamiento de migración de celda sindividual en las interacciones de célulascelulares 14. El chip de cierre hidrodinámico comprende un conjunto de unidades de matriz que cada una contiene un canal de derivación de serpentina, un sitio de captura y una cámara de cultivo. Mediante el uso de la diferencia en la resistencia al flujo entre el canal de derivación de serpentina y la cámara de cultivo, y un procedimiento de operación especialmente diseñado, diferentes tipos de células individuales se pueden capturar repetidamente en la cámara de cultivo. En particular, el amplio espacio de la cámara de cultivo no sólo puede evitar que la célula se enjuague durante la captura de células, sino que también proporcione suficiente espacio para que las células se propaguen, proliferen y migren, lo que permite observar interacciones en vivo de una sola célula. En este artículo, nos centramos en la producción de este dispositivo y los pasos detallados del protocolo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Los ensayos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para estudiar las interacciones de células celulares entre diferentes tipos de células para comprender mejor la biología de las enfermedades, incluido el cáncer. Sin embargo, es difícil aclarar el complejo mecanismo de interacciones intercelulares en poblaciones celulares altamente heterogéneas utilizando sistemas de cocultivo convencionales porque la heterogeneidad de la subpoblación celular está oscurecida por los valores medios; los sistemas de cocultivo convencionales sólo se pueden utilizar para describir la señal de población, pero son incapaces de rastrear el comportamiento de las células individuales. Además, los métodos experimentales convencionales de una sola célula tienen baja eficiencia en la manipulación celular debido a la distribución de Poisson. Los dispositivos microfabricados son una tecnología emergente para estudios de una sola célula porque pueden manipular con precisión células individuales a un alto rendimiento y pueden reducir el consumo de muestras y reactivos. Aquí, describimos el concepto y la aplicación de un chip microfluídico para múltiples cocultivos de una sola célula. El chip puede capturar de manera eficiente varios tipos de células individuales en una cámara de cultivo (46%) y tiene un espacio de cultivo suficiente útil para estudiar el comportamiento de las células (por ejemplo, migración, proliferación, etc.) bajo la interacción célula-célula a nivel de una sola célula. Las células endoteliales linfáticas y el carcinoma de células escamosas orales se utilizaron para realizar un experimento de cocultivo de una sola célula en la plataforma microfluídica para estudios de interacción de células únicas en vivo.

El dispositivo tiene una estructura de tres capas como se muestra en la fotografía transversal de un dispositivo PDMS cortado(Figura 1A). La primera capa contiene un sitio de captura (6,0 m de ancho y 4,6 m de altura) que conecta la cámara de cultivo y el canal de derivación. La diferencia en la resistencia al flujo entre la cámara de cultivo y el canal de derivación hace que las celdas fluyan hacia la posición de captura y llenen la en...

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Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Es fundamental combinar eficazmente la eficiencia de la captura con la observación dinámica de imágenes de celdas vivas para comprender el efecto de la interacción celda-célula en los comportamientos de las células. Este tubo puede capturar de manera altamente eficiente varias células individuales en una cámara más grande, y proporcionar una base de cultivos suficiente, para el seguimiento dinámico de múltiples comportamientos de interacción de una sola célula. Comience preparando el dispositivo PDMS.Coloque un molde de oblea en el plato de pesaje con 100 microlitros de triclorosilano en un desecador y aplique un vacío durante 15 minutos. Detenga el vacío y salinize el molde de obleas en el desecador a 37 grados Celsius durante al menos una hora. Mezcle la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de diez a uno, luego vierta un total de 20 gramos de la mezcla en el molde de obleas en un plato de 15 centímetros.Coloque el plato de 15 centímetros en un desecador y aplique un aspirador durante un minuto y medio. A continuación, retire el plato del desecador y elimine las burbujas de aire residuales en el PDMS con gas nitrógeno. Curar el PDMS colocando el plato en un horno a 65 grados centígrados durante dos a cuatro horas.Cuando haya terminado, quite la réplica de PDMS del molde de oblea y golpee una entrada de 1,5 milímetros y una salida de 0,5 milímetros en el PDMS. Limpie la réplica de PDMS y la superficie de la diapositiva con cinta extraíble. Tratar la superficie con plasma de oxígeno.A continuación, alinee manualmente la réplica de PDMS con la diapositiva y póngalas en contacto entre sí. Deje la diapositiva PDMS en el horno Celsius de 65 grados durante un día. Al día siguiente, sumerja el dispositivo PDMS en un contenedor lleno de PBS.Colóquelo en el desecador y aplíquelo durante 15 minutos. Mueva el dispositivo a una capucha de cultivo celular y esterilícelo con luz UV durante 30 minutos. Reemplace el búfer del dispositivo PDMS por medio e in incubarlo a cuatro grados centígrados durante un día.Cuando las células logren entre 70 y 80% de confluencia, retire el medio de cultivo y lávelos suavemente tres veces con cinco mililitros de PBS. Añadir un mililitro de medio DMEM/F-12 que contenga un tinte fluorescente micromolar a las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP, e incubarlas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave suavemente las células tres veces con cinco mililitros de PBS estéril, retire el PBS y agregue dos mililitros de 0.25%Trypsin-EDTA.Incubar las células durante cuatro minutos a temperatura ambiente, luego toque suavemente el plato de cultivo para promover el desprendimiento celular. Añadir cuatro mililitros de medio DMEM/F-12 para dispersar las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP, transferir las células a un tubo de 15 mililitros y centrifugarlas a 300 xg durante tres minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet celular en un mililitro de DMEM/F-12 medio.Preparar un mililitro de suspensión celular a una concentración de tres veces diez a quintas células por mililitro y mantenerlo en hielo para evitar la agregación celular. Conecte el tubo de politetrafluoroetileno entre la salida del dispositivo y la bomba de la jeringa. Retire el medio y agregue un microlitro de la suspensión de celda preparada en la entrada del dispositivo PDMS.A continuación, cargue la suspensión celular en el dispositivo utilizando una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 microlitros por minuto. Agregue un microlitro de medio DMEM/F-12 en la entrada del dispositivo y, a continuación, cargue el medio en el dispositivo con una bomba de jeringa. Cargue 0,3 microlitros de medio DMEM/F12 en el dispositivo con la bomba de jeringa a un caudal de 10 microlitros por minuto.Después de cargar las células, retire el tubo y selle la entrada y salida con cinta de poliolefina para crear un sistema de cultivo cerrado. Mueva el dispositivo PDMS a un plato de cultivo de 10 centímetros y agregue 10 mililitros de PBS estéril alrededor del dispositivo para evitar la evaporación del medio. Transfiera el plato de cultivo a una incubadora para el cultivo de triple célula.El dispositivo PDMS tiene una estructura de tres capas con un sitio de captura que se conecta a la cámara de referencia cultural y al canal de derivación. La diferencia en la resistencia al flujo entre la cámara de cultivo y el canal de derivación permite que la celda fluya hacia la posición de captura, lo que hace que la siguiente celda pase a través del canal de derivación al siguiente sitio de captura. El paso de reflujo se utiliza para liberar la celda del sitio de captura y enviarla a la cámara de cultivo.La eficiencia de captura de celdas de este protocolo se evaluó en tres tipos de células diferentes. Células endoteliales linfáticas humanas, o LECs, células T2.6 de carcinoma de células escamosas orales humanas que expresan ARN de horquilla corto específico de WNT5B y células de control vectorial pLKO-GFP. Las eficiencias de captura de una sola célula de las tres células demostradas fueron aproximadamente del 71% para los LEC, del 74% para las células WNT5B sh4 y del 78% para las células pLKO-GFP.La eficiencia de captura de tres células individuales fue del 48%Este método se puede utilizar para múltiples co-cultivos de una sola célula de células endoteliales linfáticas y células cancerosas escamosas, y la proliferación y morfología de la célula se puede observar bajo un microscopio. Es importante asegurarse de que las suspensiones de celda preparadas tengan agregados de celda mínimos, ya que los agregados de celda no solo reducen la eficiencia de emparejamiento único, sino que también pueden obstruir los microprocesos. La interacción celda-célula entre celdas individuales desempeña un papel importante en el control de los comportamientos de las células.Nuestro método puede proporcionar una herramienta eficiente para ayudar a los investigadores a estudiar la interacción célula-célula a un solo nivel celular, lo que puede conducir al descubrimiento de nuevos mecanismos que no se pueden obtener fácilmente de estudios basados en la población.

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Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Guiada por imagen, fabricación basada en láser de Redes de microfluidos derivados-vascular

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...