Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (105-2628-E-400-001-MY2 nätters), och doktorsexamen program inom vävnadsteknik och regenerativ medicin, National Chung Hsing University och nationella hälso forskningsinstitut.

1. tillverkning av en wafer mögel av mjuk litografi
Mask mönsterdata finns i vår tidigare publikation14.
<ol><li>Dehydrera en 4-tums kisel wafer i en 120 ° c ugn i 15 min.</li>
	<li>Spin Coat 4 g SU-8 2 negativ fotoresist på en 4-tums kisel wafer på 1 000 RPM för 30 s för att skapa en 5 μm tjockt lager (Layer #1).</li>
	<li>Mjuk Grädda lager #1 på en 65 ° c kokplatta för 1 min och sedan överföra lager #1 till en 95 ° c kokplatta i 3 min.</li>
	<li>Kyl ...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Den intercellulära interaktioner mellan olika celler i tumören mikromiljö spela en viktig roll i utvecklingen av tumören17. För att förstå mekanismen för cellcellsinteraktioner används samkultursystem som en gemensam analysmetod. Men, flera celltyper och heterogenitet av cellerna själva har lett till experimentell komplexitet och analytiska svårigheter.
Det hydrodynamiska shuttling-chippet möjliggör flera encellslastning i kultur kammaren med en determinist...

Effektiv avskiljning av olika typer av enskilda celler och ge tillräckligt kultur utrymme behövs för Single cell Co-kultur experiment av flera typer av enskilda celler1. Begränsande utspädning är den vanligaste metoden för att förbereda de enskilda cellerna för sådana experiment, på grund av den låga kostnaden för utrustning som krävs. Men på grund av Poissonfördelningsbegränsande, är den maximala sannolikheten för enstaka cell förvärv endast 37%, vilket gör försöks operationen mödosam och tidskrävande2. Med fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) kan man däremot övervinna Poissondistributionsbegränsande funktionen för att på ett effektivt sätt förbereda enstaka celler3. Men FACS kanske inte är tillgängliga för vissa laboratorier på grund av dyra instrumentering och underhållskostnader. Mikrofabricerade enheter har nyligen utvecklats för Single cell svällning4, Single cell parkoppling5, och Single cellkultur applikationer. Dessa enheter är fördelaktiga baserat på deras förmåga att korrekt manipulera enskilda celler6, utföra hög genomströmning experiment, eller minska prov och reagensförbrukning. Men att utföra encellig Co-Culture experiment med flera celltyper med nuvarande mikroflödessystem enheter är fortfarande utmanande på grund av begränsningen av Poisson fördelning1,7,8, eller oförmåga enheterna att fånga mer än två typer av enskilda celler4,5,6,9,10.
Till exempel rapporterade Yoon et al. en mikroflödessystem enhet för cell-cell interaktion studie11. Den här enheten använder den probabilistiska metoden för att para ihop celler i en kammare. Det kan dock bara uppnå hopkopplingen av två olika celltyper på grund av geometriska begränsningar i enhets strukturen. En annan rapport från Lee et al. demonstrerade en deterministisk metod för att fånga och para ihop enstaka celler12. Den här enheten ökar parnings effektiviteten med den deterministiska metoden men begränsas av den förlängda drifttid som krävs för att para ihop celler. Specifikt kan den andra cell fångsten endast utföras efter att den första fångade cellen är kopplad till ytan efter 24 h. Zhao et al. rapporterade en droplet-baserad mikroflödessystem-enhet för att fånga två typer av en enda cell13. Vi kan grunda att den droplet-baserade mikroflödessystem-enheten fortfarande är begränsad till poissonfördelningen och kan endast användas på icke-anslutna celler, och det är inte möjligt att ändra kultur lösningen under odlingsprocessen.
Tidigare har vi utvecklat en mikroflödessystem "hydrodynamiska shuttling chip" som utnyttjar deterministiska hydrodynamiska krafter för att fånga flera typer av Single-cell i kultur kammaren och kan därefter utföra cell Co-Culture experiment för att analysera individuell cell migration beteende under cell-cell interaktioner14. Det hydrodynamiska shuttling-chippet består av en klädd uppsättning enheter som var och en innehåller en Serpentine by-pass-kanal, en insamlingsplats och en kultur kammare. Genom att använda skillnaden i flödesmotstånd mellan Serpentine by-pass-kanalen och kultur kammaren, och en särskilt utformad drift procedur, kan olika typer av enstaka celler upprepade gånger fångas in i kultur kammaren. I synnerhet kan det rikliga utrymmet i kultur kammaren inte bara hindra cellen från att spolas under cell fångst ut utan också ge tillräckligt med utrymme för cellerna att sprida, förgöra och migrera, vilket möjliggör observation av levande Single-cell interaktioner. I den här artikeln fokuserar vi på produktionen av den här enheten och detaljerade protokoll steg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Cell Co-Culture analyser har använts i stor utsträckning för att studera cell-cell interaktioner mellan olika celltyper för att bättre förstå biologi av sjukdomar inklusive cancer. Det är dock utmanande att klargöra den komplexa mekanismen för intercellulära interaktioner i mycket heterogena cellpopulationer med hjälp av konventionella Co-Culture system eftersom heterogenitet av cell subpopulationen är skyms av medelvärdena; de konventionella Co-Culture-systemen kan endast användas för att beskriva befolknings signalen, men är oförmögna att spåra enskilda cellers beteende. Konventionella encellig experimentella metoder har dessutom låg verkningsgrad vid cell manipulation på grund av Poissonfördelningen. Mikrofabricerade enheter är en framväxande teknik för encelliga studier eftersom de kan noggrant manipulera enskilda celler vid hög genomströmning och kan minska prov och reagensförbrukning. Här beskriver vi konceptet och tillämpningen av en mikroflödessystem chip för flera encellig Co-kulturer. Chippet kan effektivt fånga flera typer av enstaka celler i en kultur kammare (~ 46%) och har en tillräcklig kultur utrymme användbar för att studera cellernas beteende (t. ex. migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaktion på encellig nivå. Lymfatiska endotelceller och Oral skivepitelcancer användes för att utföra en encellig Co-Culture experiment på mikroflödessystem plattform för levande flera encellig interaktionsstudier.

Enheten har en tre-lagers struktur som visas av tvärsnitt fotografi av en cut PDMS enhet (figur 1a). Det första skiktet innehåller en infångstplats (6,0 μm i bredd och 4,6 μm i höjd) som förbinder kultur kammaren och by-pass-kanalen. Skillnaden i flödes beständighet mellan kultur kammaren och by-pass-kanalen gör att cellerna rinner in i fångst positionen och fyller ingången till den lilla stigen. Efter att en cell har fångats vi...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Denna rapport beskriver en mikroflödessystem chip-baserad metod för att ställa in ett enda cellkultur experiment där högeffektiv hopkoppling och mikroskopisk analys av flera enskilda celler kan uppnås.

Skapa encellig Co-kulturer på ett deterministiskt sätt med ett Microfluidic chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Det är viktigt att effektivt kombinera fånga effektivitet med dynamisk levande cell bild observation för att förstå effekten av cell-cell interaktion på cellen beteenden. Detta rör kan mycket effektivt fånga flera enstaka celler i en större kammare, och ge en tillräcklig kulturer bas, för dynamisk spårning av flera encellig interaktion beteenden. Börja med att förbereda PDMS-enheten.Placera en wafer mögel i vägningsfatet med 100 mikroliter av triklorsfären i en exsiccator och applicera ett vakuum i 15 minuter. Stoppa vakuum och fräs wafer mögel i exsiccator på 37 grader Celsius i minst en timme. Blanda PDMS bas och PDMS härdningsmedel vid ett förhållande av tio till ett, häll sedan totalt 20 gram av blandningen på rån mögel i en 15-centimeters maträtt.Placera 15-centimeters skålen i en exsiccator och applicera ett vakuum i en och en halv minut. Ta sedan bort skålen från exsiccatorn och eliminera kvarvarande luftbubblor i PDMS med kvävegas. Bota PDMS genom att placera skålen i en ugn på 65 grader celsius i två till fyra timmar.När du är klar, ta bort PDMS replika från wafer mögel, och stansa en 1,5-millimeters inlopp och 0,5-millimeters utlopp på PDMS. Rengör PDMS-repliken och glidytan med löstagbart band. Behandla ytan med syrgasplasma.Sedan justerar du PDMS-repliken manuellt mot bilden och tar dem i kontakt med varandra. Låt PDMS-glidningen vara i 65 graders Celsius-ugnen under en dag. Nästa dag, sänk ner PDMS-enheten i en behållare fylld med PBS.Placera den i exsiccator, och applicera vakuum i 15 minuter. Flytta enheten till en cellkultur huva och sterilisera den med UV-ljus i 30 minuter. Byt ut PDMS-enhetsbufferten mot medium och inkubera den i fyra grader Celsius under en dag.När cellerna uppnår 70 till 80%konfluency, ta bort odlingsmediet och tvätta dem försiktigt tre gånger med fem milliliter PBS. Tillsätt en milliliter DMEM/F-12 medium som innehåller ett mikromolarfluorescerande färgämne till WNT5B sh4 och pLKO-GFP-cellerna, och inkubera dem i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter inkubationen tvättar du försiktigt cellerna tre gånger med fem milliliter steril PBS, tar bort PBS och lägger till två milliliter på 0,25%Trypsin-EDTA.Inkubera cellerna i fyra minuter i rumstemperatur, sedan försiktigt peka på kultur skålen för att främja cellavlossning. Tillsätt fyra milliliter DMEM/F-12 medium för att skingra WNT5B sh4 och pLKO-GFP-celler, överföra cellerna till ett 15-milliliterrör och centrifug dem på 300 xg i tre minuter. Ta bort supernatanten och försiktigt återuppstäng cellpelletsen i en milliliter av DMEM/F-12 medium.Förbered en milliliter cell suspension vid en koncentration av tre gånger tio till femte celler per milliliter och hålla den på is för att förhindra cellaggregation. Anslut polytetrafluoretylenröret mellan enhetens utlopp och sprutpumpen. Ta bort mediet och lägg till en mikroliter av den förberedda cellupphängningen i inloppet till PDMS-enheten.Därefter laddar du cellupphängningen i enheten med hjälp av en sprutpump med en flödeshastighet på 0,3 mikroliter per minut. Lägg till en mikroliter dmem/F-12 medium i enhetens inlopp och ladda sedan mediet i enheten med hjälp av en sprutapump. Ladda 0,3 mikroliter av DMEM/F12-medium i enheten med sprutpumpen med en flödeshastighet på 10 mikroliter per minut.Efter cellerna är laddade, ta bort röret, och försegla inloppet och utlopp med polyolefin tejp för att skapa en sluten kultur system. Flytta PDMS-enheten till en 10-centimeters odlingsrätt och tillsätt 10 milliliter steril PBS runt enheten för att undvika avdunstning av medium. Överför odlingsrätten till en inkubator för trippel encellig kultur.PDMS-enheten har en trelagersstruktur med en fånga plats som ansluter till kulturkammaren och bypass-kanalen. Skillnaden i flödesmotstånd mellan odlingskammaren och bypass-kanalen gör att cellen kan flöda in i infångningspositionen, vilket gör att följande cell går genom bypass-kanalen till nästa infångningsplats. Återflödessteget används för att frigöra cellen från fångstplatsen och skicka in den i kulturkammaren.Cellfångsteffektivitet av det här protokollet utvärderades på tre olika celltyper. Humana lymfatiska endotelceller, eller LECs, mänskliga muntliga skivepitelcancer T2.6 celler uttrycker WNT5B-specifika kort hårnål RNA, och pLKO-GFP vektor kontroll celler. De encelliga infångsteffektiviteterna för de tre påvisade cellerna var cirka 71 %för LEC:erna, 74 % för WNT5B sh4-celler och 78 % för pLKO- GFP-cellerna.Den tredubbla single-cell fånga effektivitet var 48%Denna metod kan användas för flera encelliga samkulturer av lymfatiska endotelceller och skivepitelcancerceller, och cellens spridning och morfologi kan observeras under ett mikroskop. Det är viktigt att se till att de förberedda cellupphängningar har minimal cell aggregat, eftersom cell aggregat inte bara minska enkel ihopkoppling effektivitet, men kan också täppa till mikrokanaler. Cell-cell interaktion mellan enskilda celler spelar en viktig roll i att kontrollera cellens beteenden.Vår metod kan ge ett effektivt verktyg för att hjälpa forskare att studera cell-cell interaktion på en enda cellnivå, vilket kan leda till upptäckten av nya mekanismer som inte lätt kan erhållas från populationsbaserade studier.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

En mikroflödessystem-baserad Hydrodynamisk fälla för enstaka partiklar

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip Endothelial inflammatorisk Fenotypning

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Ett mikroflödes Chip för Mångsidig kemisk analys av enskilda celler

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk tillverkning av polymera och biohybridfibrer med fördesignad storlek och form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En mikroflödes Chip för ICPMS Sample Introduktion

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungcancerceller med användning av en Multichannel dubbla elektriskt fält mikroflödes Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur av levnads- Microbiome med Microengineered Human Intestinal Villi i en Gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Bildstyrd, laserbaserade Tillverkning av Vascular-härledda Mikroflödes Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Torr Film fotoresist-baserade elektrokemiska mikroflödessystem Biosensor plattform: Enhet Fabrication, On-chip Assay förberedelse och systemdrift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...