Name: establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (105-2628-E-400-001-MY2) ve Doku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Doktora Programı, Ulusal Chung Hsing Üniversitesi ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1. Yumuşak litografi ile gofret kalıbının imalatı
NOT: Maske deseni verileri önceki yayınımızda mevcuttur14.
<ol><li>120 °C'lik fırında 15 dakika boyunca 4 inçlik silikon gofret kurutun.</li>
	<li>Spin kat 4 g SU-8 2 negatif photoresist üzerine 4-inç silikon gofret üzerine 1.000 rpm için 30 s 5 μm kalınlığında tabaka (katman #1) oluşturmak için.</li>
	<li>Yumuşak fırın tabakası 1 dk için 65 ° C hotplate üzerinde #1 ve daha sonra 3 dakika...

<ol>
	<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Poisson+distribution+and+beyond:+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation.">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804 (2008).</li><li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices.">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays.">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).</li><li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics.">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li><li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Chung, M. T., N&#250;&#241;ez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging.">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal.">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li><li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication.">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics.">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li><li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip.">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells.">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503 (2016).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting.">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li></ol>

Tümör mikroortamında çeşitli hücrelerin hücreler arası etkileşimleri tümörün ilerlemesinde önemli bir rol oynamaktadır17. Hücre-hücre etkileşimlerinin mekanizmasını anlamak için ortak bir analitik yöntem olarak ortak kültür sistemleri kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla hücre tipleri ve hücrelerin heterojenliği deneysel karmaşıklık ve analitik zorluklara yol açmıştır.
Hidrodinamik kapatma çipi, seyreltme yöntemi ve mikrokuyu platfo...

Farklı tipte tek hücrelerin verimli bir şekilde yakalanması ve yeterli kültür alanı sağlanması, tek hücreli birden fazla hücre türünden oluşan tek hücre ortak kültür deneyleri için gereklidir1. Seyreltme sınırlandırılması, gerekli ekipman düşük maliyet nedeniyle, bu tür deneyler için tek hücreleri hazırlamak için en yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Ancak, Poisson dağıtım sınırlaması nedeniyle, maksimum tek hücre edinimi olasılığı sadece% 37, deneysel operasyon zahmetli ve zaman alıcı2yapma. Buna karşılık, floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak yüksek verimli tek hücreleri hazırlamak için Poisson dağıtım sınırlaması üstesinden gelebilir3. Ancak, facs pahalı enstrümantasyon ve bakım maliyeti nedeniyle bazı laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir. Mikrofabrikasyon cihazlar son zamanlarda tek hücreli yakalama için geliştirilmiştir4, tek hücre eşleştirme5, ve tek hücre kültürü uygulamaları. Bu aygıtlar, tekhücreleridoğru bir şekilde manipüle etme, yüksek işlem denemeleri yapma veya numune ve reaktif tüketimini azaltma yeteneklerine bağlı olarak avantajlıdır 6. Ancak, mevcut mikroakışkan cihazlar ile birden fazla hücre türleri ile tek hücreli co-kültür deneyleri gerçekleştirmek hala Poisson dağılımı1sınırlama nedeniyle zor ,7,8, veya yetersizlik tek hücre4,5,6,9,10ikiden fazla tür yakalamak için cihazlar .
Örneğin, Yoon ve ark. hücre-hücre etkileşimçalışması11için bir mikroakışkan cihaz bildirdi. Bu cihaz, hücreleri tek bir odadaki çiftleri eşleştirmek için olasılıksal yöntemi kullanır. Ancak, aygıt yapısındaki geometrik kısıtlamalar nedeniyle yalnızca iki farklı hücre türünün eşleşmesini sağlayabilir. Lee ve ark. başka bir rapor yakalamak ve tek hücreleri eşleştirmek için deterministik bir yöntem gösterdi12. Bu cihaz deterministik yöntemle eşleştirme verimliliğini artırır, ancak hücreleri eşleştirmek için gereken uzun çalışma süresi ile sınırlıdır. Özellikle, ikinci hücre yakalama sadece ilk yakalanan hücre yüzeye sonra 24 h. Zhao ve ark. tek bir hücre13iki tür yakalamak için bir damlacık tabanlı mikroakışkan cihaz rapor sonra yapılabilir. Damlacık bazlı mikroakışkan cihazın hala Poisson dağılımıile sınırlı olduğunu ve sadece bağlı olmayan hücrelerde kullanılabileceğini ve ekim işlemi sırasında kültür çözümünü değiştirmenin mümkün olmadığını bulduk.
Daha önce, kültür odasına tek hücreli birden fazla türde yakalamak için deterministik hidrodinamik kuvvetleri kullanan ve daha sonra analiz etmek için hücre ortak kültür deneyi gerçekleştirebilen bir mikroakışkan "hidrodinamik kapatma çipi" geliştirdik. hücre-hücre etkileşimleri altında tek tek hücre geçiş davranışı14. Hidrodinamik kapatma çipi, her biri serpantin by-pass kanalı, bir yakalama alanı ve bir kültür odası içeren dizili bir birim kümesinden oluşur. Serpantin by-pass kanalı ile kültür odası arasındaki akış direnci farkı ve özel olarak tasarlanmış bir işlem prosedürü kullanılarak, farklı tipte tek hücreler tekrar tekrar kültür odasına yakalanabilir. Özellikle, kültür odasının geniş alanı sadece hücre yakalama sırasında fışkıran hücre önlemek değil, aynı zamanda hücrelerin yayılması için yeterli alan sağlamak, çoğalmak ve göç, canlı tek hücreetkileşimleri gözlemlemek için izin. Bu makalede, bu cihazın üretimi ve ayrıntılı protokol adımları üzerinde duruluyor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>9795R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD LT 2011</td>
			<td>Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracke Blue CMAC Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td>ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Hyclone</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80630</td>
			<td>100 &#181;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15075</td>
			<td>with 1.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15071</td>
			<td>with 0.5mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>NORDSON MARCH</td>
			<td>AP-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td>TFT-23T</td>
			<td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td>SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 10 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing single-cell based co-cultures in a deterministic manner with a microfluidic chip

Hücre ortak kültür tahlilleri yaygın kanser de dahil olmak üzere hastalıkların biyolojisini daha iyi anlamak için farklı hücre tipleri arasındaki hücre-hücre etkileşimleri incelemek için kullanılmıştır. Ancak, geleneksel eş kültür sistemlerini kullanarak son derece heterojen hücre popülasyonlarında hücreler arası etkileşimlerin karmaşık mekanizmasını netleştirmek zordur, çünkü hücre alt popülasyonunun heterojenliği ortalama değerler tarafından gizlenmektedir; geleneksel ortak kültür sistemleri sadece nüfus sinyalini tanımlamak için kullanılabilir, ancak tek tek hücre davranışını izlemekten acizdir. Ayrıca, konvansiyonel tek hücreli deneysel yöntemler Poisson dağılımı nedeniyle hücre manipülasyonu düşük verimlilik var. Mikrofabrikasyon cihazlar tek hücreli çalışmalar için yeni gelişen bir teknolojidir, çünkü tek hücreleri yüksek iş seviyesinde doğru bir şekilde manipüle edebilirler ve numune ve reaktif tüketimini azaltabilirler. Burada, birden fazla tek hücreli ortak kültür için bir mikroakışkan çip in konseptini ve uygulamasını açıklıyoruz. Çip, bir kültür odasında birden fazla hücre türünü verimli bir şekilde yakalayabilir (%~46) ve tek hücre düzeyinde hücre-hücre etkileşimi altında hücrelerin davranışlarını (örneğin, göç, çoğalma, vb.) incelemek için yeterli bir kültür alanına sahiptir. Lenfatik endotel hücreleri ve oral skuamöz hücreli karsinom, çoklu tek hücreli etkileşim çalışmaları için mikroakışkan platformüzerinde tek hücreli ortak kültür deneyi yapmak için kullanıldı.

Cihaz, kesilmiş bir PDMS aygıtının kesit fotoğrafından gösterildiği gibi üç katmanlı bir yapıya sahiptir(Şekil 1A). İlk katman, kültür odasını ve by-pass kanalını birbirine bağlayan bir yakalama alanı (6,0 μm genişliğinde ve 4,6 m yüksekliğinde) içerir. Kültür odası ve by-pass kanalı arasındaki akış direnci farkı hücrelerin yakalama konumuna akmasına ve küçük yolun girişini doldurmasına neden olur. B...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip at JoVE.com

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Hücre-hücre etkileşiminin hücre davranışları üzerindeki etkisini anlamak için yakalama verimliliğini dinamik canlı hücre görüntü gözlemi ile etkili bir şekilde birleştirmek çok önemlidir. Bu tüp, daha büyük bir odada birden fazla tek hücreyi verimli bir şekilde yakalayabilir ve birden fazla tek hücreli etkileşim davranışının dinamik takibi için yeterli kültürleri temellendirebilir. PDMS aygıtını hazırlayarak başlayın.Bir kurutucu triklorosilane 100 mikrolitre ile tartım çanak bir gofret kalıbı yerleştirin ve 15 dakika boyunca bir vakum uygulayın. Vakum durdurun ve en az bir saat boyunca 37 santigrat derece de kurutucu gofret kalıbı salisil. PDMS tabanını ve PDMS kür ajanını 10'a 1 oranında karıştırın, ardından 15 santimetrelik bir tabaktaki gofret kalıbına toplam 20 gram karışımı dökün.Bir kurutucu içine 15 santimetre çanak yerleştirin ve bir buçuk dakika için bir vakum uygulayın. Sonra kurutucu dan çanak çıkarın ve azot gazı ile PDMS artık hava kabarcıkları ortadan kaldırmak. 2-4 saat boyunca 65 santigrat derece bir fırında çanak yerleştirerek PDMS Cure.Bittiğinde, gofret kalıbından PDMS kopyasını çıkarın ve PDMS'de 1,5 milimetrelik giriş ve 0,5 milimetrelik bir çıkış noktasını delin. PDMS yinelemesini ve slayt yüzeyini çıkarılabilir bantla temizleyin. Oksijen plazma ile yüzey tedavi edin.Ardından, PDMS yinelemesini slaytla el ile hizalayın ve birbirleriyle temas edin. PDMS slaytını 65 derece santigrat fırında bir gün bekletin. Ertesi gün, PDMS aygıtını PBS ile dolu bir kapta batırın.Kurutucuiçine yerleştirin ve 15 dakika vakum uygulayın. Cihazı bir hücre kültürüne taşıyın ve UV ışığıyla 30 dakika sterilize edin. PDMS cihaz arabelleği orta ile değiştirin ve bir gün için dört derece santigrat de inkübün.Hücreler %70 ila %80 biraraya geldiğinde, kültür ortamını çıkarın ve beş mililitre PBS ile yavaşça üç kez yıkayın. WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerine bir mikromolar floresan boya içeren bir mililitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra hücreleri beş mililitre steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın, PBS'yi çıkarın ve %0.25 Tripsin-EDTA'dan iki mililitre ekleyin.Oda sıcaklığında dört dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın, sonra yavaşça hücre müfrezesini teşvik etmek için kültür çanağı dokunun. WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerini dağıtmak için dört mililitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 300 xg'de üç dakika santrifüj edin. Süpernatant'ı çıkarın ve hücre peletini bir mililitre DMEM/F-12 orta sında yavaşça yeniden askıya alın.Mililitrede mililitrelik bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve hücre agregasını önlemek için buzda tutun. Polytetrafloroetilen tüpü cihazın çıkışı ile şırınga pompası arasında bağlayın. Ortamı çıkarın ve hazırlanan hücre süspansiyonunun bir mikrolitresini PDMS aygıtının girişine ekleyin.Daha sonra, dakikada 0,3 mikrolitre akış hızında bir şırınga pompası kullanarak cihaza hücre süspansiyon yükleyin. Cihazın girişine bir mikrolitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin, ardından bir şırınga pompası kullanarak ortamı cihaza yükleyin. Dakikada 10 mikrolitre akış hızında şırınga pompası ile cihaza 0,3 mikrolitre DMEM/F12 ortamı yükleyin.Hücreler yüklendikten sonra tüpü çıkarın ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için giriş ve çıkışı pololefin bantla kapatın. PDMS cihazını 10 santimetrelik bir kültür yemeğine taşıyın ve ortamın buharlaşmasını önlemek için cihazın etrafına 10 mililitre steril PBS ekleyin. Kültür çanamasını üçlü tek hücreli kültür için bir kuvöze aktarın.PDMS aygıtı, kültür odasına ve bypass kanalına bağlanan bir yakalama sitesi olan üç katmanlı bir yapıya sahiptir. Kültür odası ve bypass kanalı arasındaki akış direnci farkı hücrenin yakalama konumuna akmasını sağlar, bu da aşağıdaki hücrenin bypass kanalından bir sonraki yakalama bölgesine geçmesine neden olur. Reflü adımı hücreyi yakalama alanından serbest bırakmak ve kültür odasına göndermek için kullanılır.Bu protokolün hücre yakalama etkinliği üç farklı hücre tipinde değerlendirildi. İnsan lenfatik endotel hücreleri, veya LECs, insan oral skuamöz hücreli karsinom T2.6 hücreleri WNT5B-spesifik kısa saç tokası RNA ifade hücreleri, ve pLKO-GFP vektör kontrol hücreleri. Gösterilen üç hücrenin tek hücreli yakalama etkinliği LEC'ler için yaklaşık %71, WNT5B sh4 hücreleri için %74 ve pLKO-GFP hücreleri için %78 idi.Üçlü tek hücreli yakalama verimi %48 idi Bu yöntem lenfatik endotel hücreleri ve skuamöz kanser hücrelerinin birden fazla tek hücreli ko-kültürleri için kullanılabilir ve hücrenin çoğalması ve morfolojisi mikroskop altında gözlemlenebilir. Hazırlanan hücre süspansiyonlarının en az hücre agregasına sahip olduğundan emin olmak önemlidir, çünkü hücre agregaları sadece tek eşleştirme verimliliğini azaltmakla kaynıp mikro kanalları tıkayabilir. Tek tek hücreler arasındaki hücre-hücre etkileşimi hücre davranışlarının kontrolünde önemli bir rol oynar.Yöntemimiz, araştırmacıların hücre-hücre etkileşimini tek bir hücre düzeyinde incelemelerine yardımcı olmak için etkili bir araç sağlayabilir, bu da nüfusa dayalı çalışmalardan kolayca elde edilemeyen yeni mekanizmaların keşfedilmesine yol açabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Tek Parçacıklar için mikroakışkan tabanlı Hidrodinamik Tuzak

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Biyomühendislik

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Önceden Tasarlanmış Boyut ve Şekle Sahip Polimerik ve Biyohidred Elyafların Mikroakışkan İmalatı

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Kuru zar elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotorezist tabanlı Platform: Cihaz imalat, On-chip tahlil hazırlama ve sistemin çalışması

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...