Name: characterization of sickling during controlled automated deoxygenation with oxygen gradient ektacytometry
Uploaded: 2019-11-05T14:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado em parte por uma subvenção Eurostars estar18105 e por uma subvenção irrestrita fornecida pela RR Mechatronics. Os autores agradecem a Sisto Hendriks e Jan de Zoeten por seu apoio técnico.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê ético do Centro Médico Universitário Utrecht (UMCU) e de acordo com a Declaração de Helsínquia. Os pacientes inscritos no Texas Children's Hematology Center (TCHC) foram aprovados pelo IRB local e de acordo com a Declaração de Helsínquia.
1. Considerações gerais
<ol><li>Comece realizando uma medida de teste para aquecer o bob e o copo. Certifique-se de que a temperatura do bob e copo é de 37 °C. Isso é importante para uma boa reprodutibilidade.</li>
	<li>Certifique-se de que a solução viscosa de polivinilpirrolido (PVP) caia dentro dos limites estritos para a osmolaridade (282-286 mOsm/kg), pH (7,35-7,45) e viscosidade (27,5-32,5 MPa) à temperatura ambiente (22 °C). NOTA: O PVP deve ser usado à temperatura ambiente. Se armazenado em uma temperatura mais baixa, certifique-se que aqueceu até a temperatura ambiente antes de tomar todas as medidas.</li>
</ol>2. Start-up do ektacytometer
<ol><li>Ligue o computador e o ektacytometer pelas costas. Iniciar o programa de software(Tabela de Materiais)no computador.</li>
	<li>Certifique-se de que o nitrogênio está disponível para desoxigenar a amostra abrindo o cilindro de nitrogênio.</li>
	<li>Abaixe o bob no copo e certifique-se que o copo pode girar livremente. Limpe o copo no interior e fora com um pano macio e água destilada, porque os detritos podem dificultar as medições de EI.</li>
	<li>Quando o programa de software estiver em execução, verifique se há a seguinte mensagem na tela:"Certifique-se de que a válvula de gás está aberta" e clique em OK.</li>
	<li>Certifique-se de que o ektacytometer inicia o processo de auto-verificação do pO2 que aparecerá na tela. Selecione iniciar (digite). Se ele falhar, reexecutar a auto-verificação clicando hardware verificar | pO2 | Auto-check. NOTA: Se a auto-verificação falhar novamente,considere substituir o O 2-spot. O O2-spoté substituído por empurrar suavemente o local para fora do interior do copo com uma ponta do dedo. Um novo local é colocado por suavemente empurrando o local do lado de fora para o copo.</li>
	<li>Escolha a varredura pO2 dos diferentes testes listados à esquerda. Escolha as configurações à direita da tela e certifique-se de que elas sejam definidas de acordo com os parâmetros listados na Tabela 1. Mantenha as mesmas configurações para cada medição.</li>
	<li>A fim de salvar essas configurações, pressione OK | Ok. NOTA: As configurações preferenciais estão listadas na Tabela 1, mas podem ser ajustadas de acordo com as preferências do usuário e os propósitos de investigação. Por exemplo, para estudar o comportamento de noi, a velocidade e a duração da desoxigenação podem ser alteradas.</li>
</ol>3. Coleta e preparação de amostras
NOTA: Para a validação da técnica, o sangue tetraacético de etilediamina (EDTA) tratado de 38 pacientes com DSt e 5 controles saudáveis incluídos no Centro Médico Universitário de Utrecht ou no Centro de Hematologia Infantil do Texas, em diferentes estudos clínicos ( Identificador de Registro de Ensaios Clínicos da Holanda [NTR], NTR 6779 e NTR 6462), bem como amostras anorésias de sangue sobras de pacientes que visitaram o ambulatório ou foram hospitalizados.
<ol><li>Coletar amostras de sangue por venitura (um mínimo de 300 μL/sample) em um tubo contendo EDTA. Certifique-se de que o sangue foi armazenado por pelo menos 30 min a 4 °C, mas não mais do que 24 h. NOTA: Fosfato de citrato dextrose adenina (CPDA) ou heparina também pode ser usado, mas a influência desses reagentes na preservação da amostra no que diz respeito à ektacytometria gradiente de oxigênio não é bem conhecida.</li>
	<li>Misture a amostra suavemente por inversão para homogeneizar. Não agite a amostra. Deixe a amostra aquecer à temperatura ambiente em um banco do rolo antes da medida. NOTA: Um tubo de amostra (9-10 mL) que é armazenado por mais de 1 h a 4 °C deve aquecer por 15 min. Quando armazenado por menos de 1 h a 4 °C, ele deve aquecer por 10 min. Um tubo de amostra (2-6 mL) que é armazenado por mais de 1 h a 4 °C deve aquecer por 10 min. Quando armazenado por menos de 1 h a 4 °C, ele deve aquecer por 5 min.</li>
	<li>Medir a contagem completa de sangue em um analisador de hematologia. Para fazer isso, pegue 20-200 μL de sangue inteiro em um tubo contendo EDTA. Coloque a agulha de aspiração no tubo e pressione o botão atrás da agulha do analisador de hematologia para iniciar a medição. NOTA: Na contagem de sangue completa, o número RBC é medido, o que é um fator importante para padronizar as medições de ektacytometria de gradiente de oxigênio. A contagem de RBC é calculada a partir de dispersão para a frente e para o lado pela citometria do fluxo. Contagem normal de RBC em controles saudáveis é 3.7-5.0 x 1012/L para fêmeas e 4.2-5.5 x 1012/Lpara machos. A contagem de RBC em pacientes com SCD é geralmente diminuída. Alguns analisadores de hematologia também medirão por cento de nsa glóbulos vermelhos (% DRBC), que podem ser de valor adicional na interpretação de curvas individuais de ektacytometria de gradiente de oxigênio.</li>
	<li>Padronizar a amostra de sangue inteiro para uma contagem de RBC de 200 x 106 RBCs em 5 mL PVP (200 x 106 RBCs/frasco) ajustando o volume de amostra que será adicionado. Se a contagem total de RBC for inferior a 200 x 106,o padrão de difração e a IE serão afetados.<ol>
<li>Use a equação abaixo para realizar a contagem. 4.0/xx (x 1012/L) x 50 = yy μL sangue inteiro/ viaduto PVP onde xx é a contagem calculada rbc obtida a partir do passo 3.3 e yy é a quantidade de sangue inteiro que é necessário para a medição real. Dependendo do grau de anemia e outros fatores que influenciam a contagem de RBC, a quantidade de sangue inteiro necessária é de 40 a 90 μL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Medida da ektacytometria do gradiente do oxigênio
<ol><li>Pipette o volume calculado da amostra (yy μL do sangue) em PVP para obter um volume total de 5 mL. Prewet a ponta delicadamente resuspendendo o sangue 3x. Use uma ponta de pipeta com uma ampla abertura para evitar estresse adicional sobre os RBCs. Misture suavemente a amostra manualmente por inversão até que seja homogênea. NOTA: Abra o frasco pvp por um tempo tão curto quanto possível para evitar o contato aéreo.</li>
	<li>Lentamente desenhar 2,0 mL do sangue / Mistura PVP em uma seringa de 3 mL sem a agulha. Empurre o desentupidor para remover quaisquer bolhas de ar visíveis e solução de amostra excessiva até que 1,5-1,8 mL seja deixado na seringa (dependendo do volume do copo).</li>
	<li>Injete o volume total da amostra lenta e uniformemente no bob através do conector. Certifique-se de que o nível da amostra está acima do sensor de oxigênio (local rosa) e acima do pequeno buraco de sucção. Não deixe nenhuma solução de amostra na seringa.</li>
	<li>Clique novo e preencha o identificador da amostra, observações, data de doação e viscosidade do PVP. Clique OK | Aspirate. Após 60 s, o copo vai girar e aspirar a amostra para 15 s. Clique OK quando a rotação pára. Feche a tampa da máquina. Clique em Continuar | Comece agora,como ektacytometria gradiente de oxigênio é feito com um ganho fixo. A medida levará cerca de 28 min.</li>
	<li>Após a medição, imprima o relatório que mostra a curva e os parâmetros que são calculados automaticamente pelo software. Certifique-se de que os dados brutos são armazenados automaticamente na pasta designada em Configurações. EI máximo (EImax),EI mínimo (EImin),pO2@95%EI (PoS) e área (área abaixo da curva) são automaticamente calculados e adicionados ao relatório impresso e aos dados brutos.</li>
	<li>Obter manualmente ΔEI calculando a diferença entre EImax e EImin. Calcule a recuperação percentual tomando a diferença na EI média antes da desoxigenação (pO2 100-120 mmHg) e valores de EI média durante a reoxigenação em 100-120 mmHg.</li>
</ol>5. Limpeza do ektacytometer
<ol><li>Retire a seringa da amostra e substitua-a por uma seringa cheia de água destilada ou água desionizada.</li>
	<li>Pressione Limpo,lentamente rubor o conector durante a lavagem. Certifique-se de lavar em ambas as direções.</li>
	<li>Retire a seringa e levante o bob. Seque o bob, copo, e conector completamente com um pano macio.</li>
	<li>Use uma seringa grande (10-50 mL) para lavar o conector, a fim de remover qualquer água restante nos tubos e bob. Bloqueie a enseada/tomada inferior do bob para recuperar a pressão nos tubos, removendo assim a água restante.</li>
	<li>Abaixe o bob no copo. A máquina está agora pronta para a próxima medição.</li>
</ol>6. Desligamento da máquina
<ol><li>Certifique-se de que a máquina seja devidamente enxaguada após a última medição, conforme descrito acima. Certifique-se de que os tubos adequados se relacionam com a solução de limpeza.</li>
	<li>Feche o software, pressione Close e pressione start to start end-of-day cleaning program.</li>
	<li>Depois de completar todo o programa de limpeza, retire a seringa e levante o bob. Lave o conector com uma seringa grande.</li>
	<li>Esvazie a garrafa de lixo e seque o bob e o copo com um pano macio. Lave o conector, a fim de remover a água restante nos tubos e bob. Bloqueie a enseada/tomada inferior do bob para recuperar a pressão nos tubos, removendo assim qualquer água restante.</li>
	<li>Feche a tampa da máquina. Feche o cilindro de nitrogênio. Desligue o computador e a máquina.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability+of+oxygenated+irreversibly+sickled+cells.">Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).</li><li>Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+Deformability+of+Irreversibly+Sickled+Erythrocytes.">Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes.</a> Blood. 58 (1), 71-78 (1981).</li><li>Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+laboratory+alternative+to+irreversibly+sickled+(ISC)+counts.">A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts.</a> Blood. 60 (3), 659-663 (1982).</li><li>DaCosta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+tool+for+red+blood+cell+membrane+disorders+Assessment+of+a+new+generation+ektacytometer.">Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).</li><li>Rabai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability+analysis+of+sickle+blood+using+ektacytometry.">Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry.</a> Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).</li><li>Ballas, S. K., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+red+cell+microrheology+and+sickle+blood+rheology.">Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology.</a> Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).</li><li>Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+blood+rheology+in+sickle+cell+disease.">The role of blood rheology in sickle cell disease.</a> Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).</li><li>Hierso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oxidative+stress+on+red+blood+cell+rheology+in+sickle+cell+patients.">Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients.</a> British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).</li><li>Mozar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+modulates+red+blood+cell+deformabilityin+sickle+cell+anemia.">Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).</li><li>Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+Gradient+Ektacytometry:+Comprehensive+Characterization+of+Red+Cell+Volume+and+Surface+Maintenance.">Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance.</a> Blood. 61 (5), 899-911 (1983).</li><li>Parrow, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+red+cell+deformability+and+hydration+reflect+HbF+and+HbA2in+blood+from+patients+with+sickle+cell+anemia.">Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).</li><li>Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+anemia:+A+glass+half+full.">Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full.</a> Blood. 123 (4), 481-485 (2014).</li><li>Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheologic+predictors+of+the+severity+of+the+painful+sickle+cell+crisis.">Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis.</a> Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).</li><li>Lande, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Incidence+of+Painful+Crisis+in+Homozygous+Sickle+Cell+Disease:+Correlation+with+Red+Cell+Deformability.">The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability.</a> Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).</li><li>Lemonne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+increased+red+blood+cell+deformability+raise+the+risk+for+osteonecrosis+in+sickle+cell+anemia.">Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia.</a> Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).</li><li>Ballas, S. K., Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+changes+during+the+evolution+of+the+sickle+cell+painful+crisis.">Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis.</a> Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).</li><li>Telen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesion+and+the+endothelium:+E-selectin,+L-selectin,+and+pan-selectin+inhibitors.">Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).</li><li>Papageorgiou, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+polymerization+and+adhesion+under+hypoxia+in+sickle+cell+disease.">Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).</li><li>Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+impedance+microflow+cytometry+with+oxygen+control+for+detection+of+sickle+cells.">Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).</li><li>Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+sickle+cell+biorheology+and+implications+for+painful+vasoocclusive+crisis.">Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+assay+shows+that+increasing+red+cell+volume+could+be+a+treatment+for+sickle+cell+disease.">Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).</li><li>Rab, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reproducible+characterization+of+sickling+during+automated+deoxygenation+in+sickle+cell+disease+patients.">Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients.</a> American Journal of Hematology. 94, 575-584 (2019).</li><li>Renoux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+methodological+standardization+of+ektacytometric+measures+of+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anemia.">Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).</li><li>Parrow, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Deformability+and+Red+Cell+Heterogeneity+in+Blood+by+Ektacytometry.">Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Bessis, M., Feo, C., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+red+cell+deformability+during+progressive+deoxygenation+and+oxygenation+in+sickling+disorders+(the+use+of+an+automated+Ektacytometer).">Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer).</a> Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).</li><li>Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ektacytometric+measurement+of+sickle+cell+deformability+as+a+continuous+function+of+oxygen+tension.">Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).</li><li>Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+increased+deformability+of+deoxygenated+sickle+cells+upon+oxygenation.">Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation.</a> Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).</li><li>Antoniani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+fetal+hemoglobin+synthesis+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+the+human+&#946;-globin+locus.">Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human &#946;-globin locus.</a> Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).</li><li>Abdulmalik, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+analysis+of+human+hemoglobin+elucidates+the+structural+basis+of+the+potent+and+dual+antisickling+activity+of+pyridyl+derivatives+of+vanillin.">Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).</li><li>Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Developments+in+Anti-Sickling+Agents:+Can+Drugs+Directly+Prevent+the+Polymerization+of+Sickle+Haemoglobin+In+Vivo.">New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo.</a> British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).</li><li>Oksenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBT440+increases+haemoglobin+oxygen+affinity,+reduces+sickling+and+prolongs+RBC+half-life+in+a+murine+model+of+sickle+cell+disease.">GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease.</a> British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).</li><li>Xu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+and+Biological+Evaluation+of+Ester+and+Ether+Derivatives+of+Antisickling+Agent+5-HMF+for+the+Treatment+of+Sickle+Cell+Disease.">Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease.</a> Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).</li></ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Aqui descrevemos a ektacytometria de gradiente de oxigênio, um método que pode ser usado para estudar o comportamento falciforme dos glóbulos vermelhos de pacientes com SCD uma variedade de concentrações de oxigênio (Figura 4 e Figura 5). Para obter resultados reproduzíveis, é importante identificar os fatores que influenciam os resultados. Por exemplo, a temperatura tem um grande impacto na deformabilidade da RBC, principalmente devido aos seus efeitos sobre a espessura da solução viscosa (PVP). Recomendamos a realização de uma medição de teste no início do dia para aquecer completamente a máquina a 37 °C. Isso melhorará a reprodutibilidade dos resultados. A osmolaridade da solução viscosa deve estar dentro de uma faixa estreita (282-286 mOsm/kg para PVP), pois a osmolaridade influencia o status de hidratação, o que, por sua vez, afeta a deformabilidade da RBC. O pH e a viscosidade do PVP também devem ser rigorosamente regulamentados. Diferenças no pH e temperatura podem influenciar curvas dramaticamente22. Além disso, a água restante no copo, bob, e tubos, pode causar a linse de RBCs, resultando em dados incorretos, porque rbcs menos intactos presentes no copo será medido.
As configurações para realizar a ektacytometria de gradiente de oxigênio podem ser ajustadas para responder a questões de investigação específicas. As configurações preferidas estão listadas na Tabela 1. Um tempo de desoxigenação de 1.300 s foi escolhido com base em observações mostrando que a extensão da desoxigenação não resultou em um menorEI min para a maioria dos pacientes. Em contraste, o encurtamento do tempo de desoxigenação dificultaria o poder discriminativo da ektacytometria de gradiente de oxigênio. O tempo de reoxigenação foi fixado para 280 s devido aos polímeros HbS rapidamente resolutivos durante a reoxigenação, e restauração concomitante da IE para valores medidos antes da desoxigenação. O estresse da cisalhamento foi definido como 30 Pa, o que é análogo à ektacytometria de gradiente osmótico. A redução deste parâmetro pode dificultar o poder discriminativo. O controle de desoxigenação pode ser usado se um conjunto de velocidade de desoxigenação for aplicado a cada amostra do paciente. Em nossas configurações preferidas, essa opção foi desligada porque a taxa de desoxigenação é específica do paciente devido à curva única de dissociação de hemoglobina. Assim, ligar o controle de desoxigenação eliminaria essa característica do ensaio. No entanto, esta característica da ektacytometria de gradiente de oxigênio ainda está investigação.
Vários fatores bem conhecidos influenciam parâmetros de ektacytometria de gradiente de oxigênio, ou seja, pH, temperatura e osmolaridade. Ektacytometry, especialmente PoS, é influenciado por 2,3-difosofadeglicetria (2,3-DPG)22. Além disso, há uma clara correlação entre o %HbF e o EImin,e em menor medida PoS (Figura 5A-D). EImax está associado com as células falciformes na normoxia, o que pode explicar a observação de que logo após um VOC, rbc deformabilidade na normoxia (EImax),é maior. Este último é causado pela destruição das células mais doentes e, portanto, RBCs menos deformáveis durante o VOC16. Como mostrado na Figura 5F, RBCs mais ricos em % (definidos como RBCs com uma concentração de hemoglobina >1.11 mg/mL) correlacionam-se fortemente com ummáximode EI mais baixo. Isso indica que as células densas são um fator importante na deformabilidade da RBC na normoxia, semelhante aos resultados relatados anteriormente1.
A padronização das amostras é muito importante para a obtenção de resultados reproduzíveis e para a distinção entre diferentes genótipos e tratamentos. A correção para a contagem de RBC é importante, pois o número de RBCs influencia a intensidade do padrão de difração. Se os números mais baixos de RBC estão atuais na abertura entre o bob e o copo, a curva deslocará para cima e à esquerda. Além disso, a curva flutuará, dificultando o cálculo preciso dos parâmetros, especialmente o PoS.
Uma limitação desta técnica é que o valor do EI representa uma média de todas as células, incluindo subpopulações diferentes. A heterogeneidade das populações de LIN em pacientes com DST e sua influência na medição da ektacytometria têm sido intensamente estudadas. Isso resultou em padronização em que o tamanho do padrão de difração é ajustado a um valor fixo em vez de corrigido para a contagem RBC23,24. Se essa forma de padronização também deve ser aplicada ou não às medições de ektacytometria de gradiente de oxigênio está atualmente em estudo.
Várias técnicas para medir a deformabilidade da RBC em condições hipóxicos foram desenvolvidas com base em uma etapa de desoxigenação que ocorreu fora do ektacytometer25,26,27. Nessas condições, diferenças no comportamento celular não foram observadas entre pacientes com traços de HbS e controles saudáveis pH fisiológico25. Ektacytometry do gradiente do oxigênio, entretanto, mostra claramente um PoS baixo mas evidente nos indivíduos com traços de HbS (figura 4A). Até o momento, na prática clínica de rotina, os únicos métodos alternativos para medir a tendência dos RBCs de um paciente individual para a foice in vitro incluem um ensaio de eroto à base de morfologia: OS RBCs são incubados em condições que promovem a polimerização do HbS, baixa tensão de oxigênio ou baixo pH. Um fixador é adicionado após a incubação e a porcentagem de células doentes é contada manual ou digitalmente usando microscopia de luz. Muitos ensaios farmacológicos pré-clínicos e de fase inicial usam o ensaio de doie para gerar uma variável de desfecho secundário para ser capaz de prever a eficácia clínica em SCD28,29,30,31 32de pessoas. No entanto, é demorado, a variabilidade é alta e a sensibilidade é baixa, a técnica não é automatizada e, portanto, trabalhosa. Além disso, as alterações morfológicas devido à noidura podem não se correlacionar bem com parâmetros fisiológicos, como a deformabilidade da RBC, pois é um ensaio estática de 2 dimensões2.
A ektacytometria do gradiente do oxigênio fornece um ensaio funcional do sickling que é rápido e reproducible. Este é um teste in vitro que não considera a superfície endotelial. No entanto, ele fornece aspectos funcionais do comportamento falciforme e características RBC, tornando-se uma técnica promissora para estudos de células falciformes. Futuras aplicações da técnica incluem monitoramento da eficácia do tratamento em pacientes com SCD, atuando como biomarcador para novas estratégias de tratamento, estudo do comportamento de noie, e monitoramento do quimerismo após o transplante de células-tronco em SCD.

Em SCD, uma mutação de ponto único resulta na produção de HbS, que pode polimerizar após a desoxigenação. A polimerização do HbS causa a noi da enoização dos RBCs e reduz a deformabilidade da RBC. A combinação de adesão à adesão à Adesão à Adesão ao endotelio da RBC leva a várias complicações do SCD, incluindo crises vaso-oclusivas (VOC), acidente vascular cerebral, danos nos órgãos e anemia hemolítica crônica. Mesmo em condições normoxic, a deformabilidade de RBC é comprometida nos pacientes com SCD. A deformabilidade é ainda mais diminuída em baixas concentrações de oxigênio. Os principais intervenientes que determinam a deformabilidade na normoxia são células densas, células irreversivelmente doentes (ISC) e células desidratadas, todas com uma diminuição da relação superfície-volume1,2,3.
A ektactometria é um método estabelecido para medir a deformabilidade da RBC, amplamente utilizada para o diagnóstico de anemias hemolíticas hereditárias, particularmente membranopatias4. Ele também pode ser usado para estudar hemorheologia5,6,7,8,9. A ektacytometria de gradiente osmótico, na qual a deformabilidade da RBC é medida durante uma mudança contínua na osmolalidade, tem sido usada para estudar SCD por mais de uma década10,11. A porcentagem de hemoglobina fetal (HbF) é um dos inibidores mais fortes da polimerização do HbS porque nem o HbF nem seu tetramer híbrido misto (2βSγ) podem entrar na fase12do polímero deoxyHbS. Estudos recentes sugerem que o aumento dos níveis de HbF em pacientes com SCD leva a uma melhor relação superfície-volume, melhorando assim o estado de hidratação e, portanto, a deformabilidade em pacientes não transfundidos11.
A deformabilidade da RBC tem sido estudada no passado como um biomarcador para complicações de SCD, mas com resultados conflitantes. Em estudos realizados transversalmente e em estado estável, indivíduos com níveis mais elevados de deformabilidade da RBC apresentaram maior incidência de osteoneconese e mais crises de dor13,14,15. Em contraste com esses achados, quando comparados aos valores estávels do Estado durante um VOC agudo, a deformabilidade da RBC foi diminuída em estudos longitudinais dentro dos mesmos indivíduos16. Essa discrepância pode ser o resultado do estudo da deformabilidade da RBC em diferentes condições (ou seja, durante o estado estável versus O VOC). A porcentagem de células doentes é alta no início de um VOC e as células são rapidamente destruídas à medida que a crise progride, o que pode explicar a diferença entre os dados de incidência transversal estável do estado e dados longitudinais obtidos durante o VOC. No entanto, outros fatores, como a adesão das subpopulações da RBC à superfície endotelial, também podem ser importantes na ocorrência de TA. Em SCD, é mais clinicamente relevante medir a deformabilidade durante a desoxigenação, pois vaso-oclusão geralmente ocorre nos venules postcapilares hipóxicos e não na rede microcapilar menos hipóxica17. Além disso, a presença de ISCs pode alterar a capacidade de um ektacytometer para medir a deformabilidade na normoxia. A distorção do padrão de difração é causada por ISCs, que resulta do não alinhamento durante o fluxo1,2,3.
Abordagens alternativas para estudar a fisiopatologia do VOC incluem medições da adesão da RBC a uma superfície artificial18,microtometria de microfluxo elétrico de impedância de célulaúnica19,modelos baseados em microfluídicos combinando quantitativa medições da célula falciforme e dessaudade com reologia celular única20,e polimerização induzida por laser21. Embora promissoras, essas técnicas são caras, trabalhosas e exigem treinamento extensivo do operador. Além disso, os ensaios que são baseados em morfologia não têm a capacidade de estudar o comportamento celular, como a deformabilidade, em função de um gradiente de oxigênio.
Neste estudo, descrevemos um ensaio funcional rápido e reproduzível realizado com um ektacytometer. Trata-se de uma medida de ektacytometria de próxima geração que mede os diferentes aspectos qualitativos da deformabilidade da RBC expressos como EI durante a desoxigenação (1.300 s) e reoxigenação rápida (280 s). Esses intervalos de tempo permitem a formação de polímeros HbS e, assim, a ocorrência de alterações morfológicas e, em seguida, a recuperação. A desoxigenação ocorre apartir da introdução de gás nitrogênio, o que diminui lentamente a tensão de oxigênio na amostra de sangue na lacuna entre o bob e o copo do ektacytometer. A deformabilidade da RBC é continuamente medida, enquanto a tensão de oxigênio é medida a cada 20 s por meio de um pequeno ponto O2presente na parede do copo. Durante o teste, aproximadamente 80 medidas de pO2 são acopladas ao EI medido naquele momento. A pressão de oxigênio cai abaixo de 20 mmHg durante a desoxigenação, e a reoxigenação é facilitada pela difusão passiva do ar ambiente. A configuração experimental do módulo ektacytometer e de ektacytometry de oxigênio é descrita na Figura 1 e na Figura 2. O princípio da ektacytometria é baseado na dispersão induzida pela RBC da luz de um feixe de laser. Isso resulta em um padrão de difração elíptica quando o estresse da cisalhamento é aplicado ao mesmo tempo(Figura 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="667">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ADVIA 120 Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:159px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">067-A004-14</td>
			<td style="width:167px;">Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:159px;">Abbott</td>
			<td style="width:119px;">8H00-01</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Lorrca</td>
			<td style="width:159px;">RR Mechatronics</td>
			<td style="width:119px;">LORC109230 or LORC109110</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Lorrca Software version V5.08</td>
			<td style="width:159px;">RR Mechatronics</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrogen gas 4.8 or 5.0</td>
			<td style="width:159px;">Local</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">O2-spot</td>
			<td style="width:159px;">RR Mechatronics</td>
			<td>PO2S020153</td>
			<td>O2 measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Oxygenscan module (pO2scan)</td>
			<td style="width:159px;">RR Mechatronics</td>
			<td>PO2S109000</td>
			<td>Add-on</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Oxy-ISO</td>
			<td style="width:159px;">RR Mechatronics</td>
			<td>QRR 030905</td>
			<td>Viscous solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">X-Clean</td>
			<td style="width:159px;">RR Mechatronics</td>
			<td>QRR 010946</td>
			<td>Cleaning solution Lorrca</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of sickling during controlled automated deoxygenation with oxygen gradient ektacytometry

Na doença falciforme (SCD), uma mutação de ponto único na codificação de genes para beta-globina causa a produção de hemoglobina anormal S (HbS). Quando desoxigenado, hbs pode polimerizar, formando hastes rígidas de hemoglobina, resultando na noigização de glóbulos vermelhos (RBCs). Estes RBCs sickled reduziram significativamente a deformabilidade, causando vaso-oclusão, que conduz às complicações clínicas SCD-relacionadas numerosas, incluindo a dor, o curso, e dano do órgão. A deformabilidade da RBC também é reduzida pela desidratação da RBC, resultando em células vermelhas densas do sangue que são mais propensas a ser ceimais. Até à data, não há um único ensaio laboratorial amplamente disponível, rápido e reprodutível capaz de prever a gravidade da doença ou monitorar diretamente os efeitos do tratamento para terapias novas e não fetais de hemoglobina. Neste estudo, descrevemos um protocolo para medir a deformabilidade da RBC em função do pO2 que permite a quantidade de comportamento de doente em pacientes com DSD. A ektacytometria de gradiente de oxigênio mede a deformabilidade da RBC, expressa como o índice de alongamento (IE), em função do pO2. Rbcs são expostos a um estresse fixo cisalhamento de 30 Pa durante uma rodada de desoxigenação e reoxigenação. Seis parâmetros de leitura são produzidos. Destes, o ponto de engenamento (PoS), definido como o pO2 em que o EI máximo (EImax)mostra uma diminuição de 5%, e ei mínimo durante a desoxigenação (EImin)são os mais informativos, refletindo o pO2 de um paciente individual em que início de enomental e a deformabilidade mínima dos glóbulos vermelhos de um paciente, respectivamente. O PoS está associado à afinidade de hemoglobina de um paciente individual por oxigênio, enquanto o EImin mostra uma forte correlação com os níveis de hemoglobina fetal. Concluímos que a ektacytometria de gradiente de oxigênio é uma técnica promissora para monitorar o tratamento de pacientes com SCD, como um biomarcador para agentes anti-emifiqueimento em ensaios clínicos e pré-clínicos, e uma ferramenta importante para estudar o comportamento de enominagem de RBCs de indivíduos com SCD e traços falciformes.

A ektacytometria do gradiente de oxigênio pode ser usada para caracterizar o comportamento de enmeamento em pacientes com SCD. Neste estudo, foram incluídas amostras de sangue de um total de 38 pacientes com DST e cinco controles saudáveis. Em controles saudáveis, o padrão de difração é circular em repouso e elíptico em maior estresse de cisalhamento4. A partir do padrão de difração elíptica, o índice de alongamento (IE) é calculado com base na altura e largura do padrão de difração. Na ektacytometria de gradiente de oxigênio, a desoxigenação lenta e contínua da amostra por gás nitrogênio é seguida por reoxigenação rápida pelo ar ambiente. Nessas condições, a noigização da RBC pode ser observada desoxigenação. Isso causará uma distorção do padrão de difração porque as células vermelhas doentes não se alinharão adequadamente o estresse de cisalhamento aplicado. Assim, eles parecem ser menos deformáveis em oposição aos RBCs saudáveis (Figura 2).
A Figura 3A mostra como os RBCs falciformes mudam de forma após a desoxigenação, que imitou as condições durante a ektacytometria de gradiente de oxigênio, enquanto o controle de RBCs falciforme sem desoxigenação não mostra nenhuma mudança de forma. Este processo resulta em distorção do padrão de difração durante a ektacytometria de gradiente de oxigênio e, portanto, em uma diminuição da IE. A Figura 3B mostra os diferentes padrões de difração dos quais são gerados diferentes parâmetros.
Uma curva representativa obtida pelo ektacytometer é mostrada na Figura 3C. Seis parâmetros refletem características diferentes do comportamento falciforme dos RBCs: EImax é o EI máximo no início da medição antes da desoxigenação. Este parâmetro representa a posição de base e reflete a deformabilidade geral da população total de RBC no ar ambiente. EImin é o EI mínimo, que representa deformabilidade mínima após a desoxigenação. Este parâmetro reflete mudanças na forma e orientação de RBCs (foice) após a desoxigenação. ΔEI é a diferença entre EImax e EImin, o que indica quantas células podem foice durante uma rodada de desoxigenação. 5% Ponto de Nai (PoS5%)é o pO2 (mmHg) em que uma diminuição de 5% domáximo de EI durante a desoxigenação é medida. Isso representa a tensão de oxigênio onde o processo de noigamento começa. A área reflete a área a curva, que é determinada por um cálculo integral das medições de EI e pO2 entre 100 mmHg e pO2min (mmHg). Este é o resultado dos parâmetros previamente descritos EImax,EImin,e PoS. Recuperação representa a diferença de EI durante a parte final da reoxigenação em comparação com EI na linha de base. Ambos os valores de EI são medidos em um pO2 de 100-120 mmHg. Este parâmetro reflete a capacidade dos RBCs que foram ceimes durante a desoxigenação para reverter a noiginização durante a reoxigenação22. Os parâmetros das medidas duplicadas geralmente tinham um coeficiente de variação (CV) <5% (mediana de 1,83%). Caso tenha sido obtido um CV > 5%, foi realizada uma terceira medida. Os parâmetros EImax e Recovery são os mais reproduzíveis com currículos medianos e lt;1%.
Curvas representativas de RBCs de controles saudáveis, pacientes com traços HbS (heterozygous HbS) e um paciente de SCD homozygous são mostrados na Figura 4A. A curva representativa do paciente hbsc mostra uma menor recuperação, o que pode indicar um processo de enervação diferente (Figura 4B). As curvas representativas dos pacientes com HbSS tratados com hidroxiureia (HU) e transfusão são mostradas na Figura 4C e na Figura 4D. Claramente, há uma grande diferença entre as curvas representativas das características HS (células HbAS) e RBCs de pacientes com HbSS tratados com transfusão (consistindo de uma mistura de foice homozigous (HbSS) e células homozygous normal (HbAA), Figura 4A D). As diferenças claras nas curvas do paciente scd não tratado e dos pacientes tratados com HU e transfusão destacam a utilidade deste ensaio (Figura 4C,D). Os níveis de HbF e HbS correlacionaram-se significativamente com eImin e, em menor grau, com pos (Figura 5A-D). Isso indica que os parâmetros laboratoriais importantes na avaliação do paciente também se refletem na ektacytometria de gradiente de oxigênio. O número de células doentes na normoxia e a porcentagem de RBCs densos (DRBCs) influenciam os valores eimax, pois estão significativamente correlacionados (Figura 5E-F),o que indica que a EImax reflete outro fator importante processo de noi. Esses resultados mostram como diferentes características, como tem %HbS, %HbF, células doentes na normoxia e %DRBCs influenciam diferentes parâmetros.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig1.jpg"> Figura 1. Configuração esquemática do ektacytometer. O ektacytometer usa um sistema Couette para aplicar o estresse da cisalhamento nas células. Um cilindro exterior de rotação (copo) e um cilindro interno estático (bob) são usados para induzir o estresse da cisalhamento pela criação de fluxo laminar a 37 °C. Entre o bob e copo há uma pequena lacuna em que a suspensão de sangue é injetada. Um feixe de laser brilha do bob através da suspensão de sangue e está espalhado pela presença de RBCs. O padrão de difração é projetado e analisado por uma câmera. O índice de alongamento (IE) é calculado com a altura (a) e a largura (b) do padrão de difração4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig2.jpg"> Figura 2. Configuração esquemática do ektacytometer com módulo de ektacytometria de gradiente de oxigênio. Diagrama esquemático do módulo que mostra desoxigenação da suspensão sanguínea lentamente com a infusão de gás nitrogênio (N2). A tensão de oxigênio é medida pela quantidade de extinção do sinal de luminoforre enviado da fibra LED para o ponto O2. Após a desoxigenação, os RBCs falciformes começarão a ser ceimais, sua deformabilidade diminuirá e não se alinharão mais com os RBCs elípticos. Os RBCs doentes distorcerão o padrão de difração, mudando sua forma de uma elipse para uma forma de rodoídia ou diamante. Essa mudança na forma do padrão de difração resulta em uma diminuição da IE. As medições do pO2 e do EI não são executadas na mesma altura no copo. Isso garante uma melhor discriminação entre as curvas de desoxigenação e reoxigenação e, portanto, uma melhor interpretação da curva. Este número foi modificado a partir de Rab et al.22<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig3.jpg"> Figura 3. Curva representativa de inclinação de oxigênio e padrões de difração. (A)Após a desoxigenação em condições semelhantes à ektacytometria de gradiente de oxigênio, os RBCs falciformes foram corrigidos. No controle foice RBCs, as mesmas condições foram utilizadas, mas sem gás nitrogênio. Rbcs foice desoxigenado mostram uma mudança de forma em contraste com o controle RBCs. (B) Após a desoxigenação e estresse cisalhamento (30 Pa), o padrão de difração muda de uma elipse para um rodoíbio. (C)Curva representativa de ektacytometria de gradiente de oxigênio. O índice máximo de alongamento (EImax)representa a posição de base e mostra uma deformabilidade geral da população total de RBC. O EI mínimo (EImin)representa uma deformabilidade mínima, causada pela mudança de forma e orientação dos RBCs após a desoxigenação. ΔEI (dEI, a diferença na EI entre EImax e EImin)mostra quantas células podem ser ceimedurante uma rodada de desoxigenação. Ponto de enemissão (PoS, pO2 em 5% ei diminuição) mostra a tensão de oxigênio quando os primeiros RBCs começam a ser ceificar. A área a curva (do pO2min = 100 mmHg) é calculada na área do parâmetro. Isso resume EImax,EImine PoS. A capacidade das células doentes para não enjoar durante a reoxigenação é representada no parâmetro de recuperação (porcentagem doEI máximo alcançado durante a reoxigenação). Para auxiliar na interpretação, todos os pontos de dados foram conectados em cada experimento individual por uma linha para apresentar graficamente os resultados. Este número foi modificado a partir de Rab et al.22<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig4.jpg"> Figura 4. Parâmetros de ektacytometria de gradiente de oxigênio correlacionam-se com genótipo e regimes de tratamento de pacientes com DSC com SCD. (A) Gráfico representativo de RBCs de portadores de HbS (traço de HbS) e controles saudáveis com relação aos pacientes não tratados de HbSS. (B) Gráfico representativo de RBCs de pacientes com doença de Hemoglobina SC (HbSC) em relação aos pacientes não tratados de HbSS. (C)Gráfico representativo de RBCs de hidroxiureia tratados pacientes homozigêus SCD (HBSS HU) em relação aos pacientes não tratados HbSS. (D)Gráfico representativo de RBCs de pacientes com HbSS tratados com transfusão de sangue (transfusão de HbSS) em relação a pacientes com SHS não tratados. Este número foi modificado a partir de Rab et al.22<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig5.jpg"> Figura 5. Os parâmetros de ektacytometria de gradiente de oxigênio estão associados a %HbF, %HbS, células doentias em normoxia e RBCs densos. (A)Correlação linear do índice mínimo de alongamento (EImin)e %HbF de 15 pacientes com HbS ou HbS/β-talassemia sem transfusão. (B) Correlação linear de EImin e %HbS. (C)Correlação linear de PoS e %HbF. (D)Correlação linear de PoS e %HbS. (E)Correlação linear de EI máximo (EImax)e por cento das células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doente normoxia medida com microscopia digital. (F)Correlação linear de RBCsdensas de EI e percentual (%DRBCs) de 21 pacientes com HbSS. Este número foi modificado a partir de Rab et al.22<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Configurações</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Arquivos</td>
			<td>Diretório de armazenamento</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Opções gerais</td>
			<td>Viscosidade média padrão</td>
			<td>Viscosidade de PVP</td>
		</tr>
<tr>
<td>exame de pO2</td>
			<td>Tempo mínimo de aspiração (s)</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>estresse de cisalhamento da varredura pO2 (Pa)</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Determine pO2 cada (S)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Tamanho médio móvel</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>etapa da varredura pO2; Editar</td>
			<td>0-OFF; 60 -ON; 1360 -OFF; 1640 -OFF</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Cal. Área entre (mmHg)</td>
			<td>10 e 100</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>controle de pO2</td>
			<td>Off (sem controle)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. A configuração preferida do ektacytometer.

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Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

Aqui, apresentamos a ektacytometria de gradiente de oxigênio, um método rápido e reproduzível para medir a deformabilidade das células vermelhas do sangue em amostras de pacientes com doença falciforme desoxigenação controlada e reoxigenação. Esta técnica fornece uma maneira de estudar a noigestação de células vermelhas do sangue e monitorar a eficácia do tratamento da doença falciforme.

Caracterização de Sickling durante desoxigenação automatizada controlada com o gradiente ektacytometry do oxigênio

In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

Ektacytometria de gradiente de oxigênio é um ensaio funcional que avalia a tendência doentia individual. Até o momento, nenhum outro ensaio funcional está disponível ou usado. Ektacytometria de gradiente de oxigênio é capaz de determinar a tensão de oxigênio em que as células sanguíneas do paciente com doença falciforme começam a ser foice.Esta tensão de oxigênio é específica do paciente e pode servir como um biomarcador para a gravidade da doença. Na doença falciforme, essa técnica pode ser usada para monitorar a eficácia do tratamento e pode ser usada para o desenvolvimento de novos tratamentos. A demonstração visual dessa técnica é importante porque é muito sensível.Existem inúmeros fatores que influenciarão a medição que você não sabe quando começa a trabalhar com essa técnica. Alguém que tenta isso pela primeira vez pode experimentar que a técnica é muito sensível para preparação de amostras e manuseio de amostras. Meu conselho é trabalhar o mais padronizado possível e desenvolver uma rotina.Para iniciar este procedimento, ligue o computador e o ektacitômetro e abra o software no computador. Abra o cilindro de nitrogênio para ter certeza de que o nitrogênio está disponível para desoxigenar a amostra. Abaixe o bob na xícara e certifique-se de que o copo pode girar livremente.Quando o software estiver em execução, verifique se a mensagem está aberta e clique em OK. Certifique-se de que o ektacitômetro inicie o processo de auto-verificação e selecione iniciar. Se a auto-verificação falhar, execute-a novamente clicando em verificação de hardware, pO2, auto-verificação. Escolha a varredura pO2 dos diferentes testes listados à esquerda.Escolha as configurações à direita da tela e certifique-se de que elas sejam definidas de acordo com os parâmetros listados na tabela um do protocolo de texto, certificando-se de manter as mesmas configurações para cada medição. Salve essas configurações clicando em OK e clique em OK novamente. Primeiro, coletar amostras de sangue por venepuntura em um tubo contendo EDTA e armazenar o sangue a quatro graus Celsius por um mínimo de 30 minutos, mas não mais do que 24 horas.Depois disso, misture as amostras suavemente por inversão para homogeneizar. Deixe as amostras aquecerem até a temperatura ambiente em um banco de rolos antes da medição. Use um analisador de hematologia para medir a contagem completa de sangue colocando a aspiração precisando no tubo e pressionando o botão atrás da agulha do analisador de hematologia para iniciar a medição e o analisador usará entre 20 e 200 microlitres de sangue inteiro.Em seguida, padronize toda a amostra de sangue para uma contagem de RBC de 200 milhões de glóbulos vermelhos em cinco mililitros de PVP calculando o volume da amostra que será adicionada. Para começar, corte uma ponta de pipeta e pré-molhe-a resususentando o sangue três vezes. Em seguida, pipeta o volume amostral calculado em um frasco PVP.Misture suavemente a amostra manualmente por inversão até que seja homogênea. Desenhe lentamente dois mililitros do sangue e mistura PVP em uma seringa de três mililitros sem a agulha. Empurre o êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar visíveis e solução de amostra em excesso até que entre 1,5 e 1,8 mililitros sejam deixados na seringa.Injete o volume total da amostra lentamente e uniformemente no bob através do conector. Certifique-se de que o nível da amostra está acima do sensor de oxigênio e do pequeno orifício de sucção. No software, clique em novo e preencha o identificador de amostras, observações, data de doação e a viscosidade do PVP.Clique em OK e aspire. Após 60 segundos de aspiração, o copo gira e aspira novamente por 15 segundos. Quando a rotação parar, clique em OK. Feche a tampa da máquina.Clique continue e comece agora como ektacytometria de gradiente de oxigênio é feito com um ganho fixo. Após a medição, imprima o relatório que mostra a curva e os parâmetros que são calculados automaticamente pelo software. Certifique-se de que os dados brutos são armazenados automaticamente na pasta designada nas configurações.Primeiro, remova a seringa amostra e substitua-a por uma seringa cheia de água destilada ou água desionizada. Pressione limpar e lavar lentamente o conector durante a lavagem, certificando-se de lavar em ambas as direções. Em seguida, remova a seringa e levante o bob.Use um pano macio para secar completamente o bob e o conector. Em seguida, use uma seringa grande para lavar o conector, a fim de remover qualquer água restante no tubo e bob. Mantenha a seringa na entrada e bloqueie a saída do bob para recuperar a pressão nos tubos, removendo assim a água restante.Em seguida, seque o copo enquanto evita tocar no ponto de oxigênio. Abaixe o bob e o copo preparando a máquina para a próxima medição. Depois de garantir que a máquina esteja bem enxaguada, verifique se os tubos adequados estão relacionados com a solução de limpeza.Feche o software, pressione o fechamento e pressione o programa de limpeza do fim do dia. Em seguida, esvazie a garrafa de lixo e use um pano macio para secar o bob e o copo. Feche a tampa da máquina.Feche o cilindro de nitrogênio e desligue o computador e a máquina. Ektacytometria de gradiente de oxigênio pode ser usada para estudar o comportamento doentio dos glóbulos vermelhos sob uma série de concentrações de oxigênio. Na ektacitoritometria de gradiente de oxigênio, a desoxigenação contínua da amostra por gás nitrogênio é seguida por rápida reoxigenação por ar ambiente.Nessas condições, o adoecimento dos glóbulos vermelhos pode ser observado sob desoxigenação. Isso causará uma distorção do padrão de difração porque as células vermelhas doentes não se alinharão adequadamente sob o estresse aplicado da tesoura. Os glóbulos vermelhos da foice mostram uma mudança de forma durante a desoxigenação que imita condições durante a ektacittometria gradiente de oxigênio, mas não mostram nenhuma mudança na forma quando oxigenadas.Este processo resulta em distorção do padrão de difração durante a ektacittometria de gradiente de oxigênio e, portanto, em uma diminuição no índice de alongamento. Uma curva representativa obtida pelo ektacitômetro mostra os seis parâmetros que refletem diferentes características do comportamento doentio: o índice máximo de alongamento, o índice mínimo de alongamento, o delta EI, o ponto de adoecimento, a área sob a curva e a recuperação. Curvas representativas de glóbulos vermelhos de controles saudáveis, pacientes com traços de HbS e um paciente com doença falciforme homozigosa são mostrados aqui.As diferenças claras nas curvas representativas dos pacientes com células falciformes homozigos tratadas com ureia hidroxíl e transfusão destacam a utilidade deste ensaio. Existem inúmeros fatores que influenciam a ektacitometria gradiente de oxigênio, como temperatura, pH e osmolaridade do PVP, mas também remanescentes de água e o grau de mistura da solução amostra de sangue podem afetar as medidas. Portanto, o manuseio padronizado da amostra é essencial.O resultado da ektacitoritometria de gradiente de oxigênio pode ser diretamente implementado na prática clínica, contribuindo assim para a medicina personalizada. Essa técnica permite estudar o comportamento doentio para investigar o potencial de novos tratamentos para a doença falciforme e pode servir como um biomarcador clinicamente relevante para a gravidade da doença.

Research

JoVE Journal

Medicine

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

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Produção e Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em Câncer

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Medicina

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Controlada por laceração do colo do útero em camundongos

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Controlado Modelo Impact Cortical para lesão cerebral traumática

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test

Caracterização de Metabolic Estado em não-humanos Primatas com o Teste de Tolerância à glicose intravenosa

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical ...

Drug-Induced Sleep Endoscopy (DISE) with Target Controlled Infusion (TCI) and Bispectral Analysis in Obstructive Sleep Apnea

Drug-Induced Sleep Endoscopy DISE with Target Controlled Infusion TCI and Bispectral Analysis in Obstructive Sleep Apnea

Sono Endoscopy (DISE) com a Target Infusion Controlada (TCI) e Análise Bispectral em apneia obstrutiva do sono induzido por drogas

The aim of this study was to establish a standardized protocol for drug-induced sleep endoscopy (DISE) to differentiate obstruction patterns in ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Tópica das vias aéreas Anestesia para intubação acordada-endoscópica Usando o Spray-as-you-go Técnica com fluxo de oxigênio elevado

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Contrações do citoplasma de casos humanos-iPSC-derivado medida com um corante fluorescente de Ca-sensíveis em placas de 384 poços de temperatura controlada

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Measurement of the Hepatic Venous Pressure Gradient and Transjugular Liver Biopsy

Medição do Gradiente de Pressão Venosa Hepática e Biópsia hepática transjugular

Here we provide a detailed protocol describing the clinical procedure of hepatic venous pressure gradient (HVPG) measurement in patients with advanced ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Uma lesão de balão segmental controlada por pressão da artéria de rato com aplicação terapêutica periadventicional

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

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Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...