Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا أعضاء مختبر هارفي كوشينج للأورام العصبية علي الدعم والنقد البناء. وقد دعم هذا العمل من قبل NINDS منح K12NS80223 و K08NS101091 إلى p. P.

1. توصيف miRNAs المرتبطة وظيفيا في الورم المفلطح
<ol><li>تحليل التعبير ميرنا التفاضلي الواسع في الورم الدمى مقابل المخ
	<ol>
<li>أولا ، تحديد الأكثر بشكل ملحوظ التي حررت miRNAs في الورم. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام ثلاث طرق مختلفه علي الأقل:<ol>
<li>منجم السرطان الجينوم الأطلس ، وجدت في https://www.cancer.gov/a...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

ويستند هذا البروتوكول علي فكره انه بدلا من العمل في عزله ، miRNAs هي ذات الصلة بيولوجيا من خلال العمل في مجموعات ، ويتم تحديد هذه المجموعات الهيستونات من قبل السياقات الخلوية المحددة26. ولتبرير هذا النهج من منظور انتقالي ، استحدث بروتوكول للمتابعة يسمح بالترويح عن هذا النمط المت?...

mirnas توفر فرصه لا مثيل لها لتطوير نهج العلاج الجيني واسعه لكثير من الامراض1،2،3، بما في ذلك السرطان4،5. ويستند هذا علي العديد من السمات الفريدة لهذه الجزيئات البيولوجية ، بما في ذلك حجمها الصغير6، التكوين الحيوي البسيط7، والميل الطبيعي للعمل في الرابطة8. وتتميز العديد من الامراض بأنماط التعبير ميرنا محدده ، والتي غالبا ما تتلاقي علي تنظيم الوظائف البيولوجية المعقدة9. والغرض من هذا الأسلوب هو أولا لتحديد استراتيجية لتحديد مجموعات miRNAs التي هي بالتازر ذات الصلة لوظائف خلوية معينه. التالي ، فانه يوفر استراتيجية لأعاده إنشاء مثل هذه التركيبات في الدراسات والتطبيقات النهائية.
هذا الأسلوب يسمح للتحليل الوظيفي للعديد من miRNAs في وقت واحد ، والاستفادة من استهدافهم في وقت واحد من عدد كبير من mRNAs ، التالي تلخيص المناظر الطبيعية المعقدة من الامراض. وقد استخدم هذا النهج مؤخرا لتحديد مجموعه من ثلاثه mirnas ان 1) هي في وقت واحد دوونريجولاتيد في سرطان المخ و 2) تظهر نمط التعبير المشترك قويه خلال التمايز العصبي وكذلك ردا علي الإجهاد الجيني من قبل الإشعاع أو الحمض النووي عامل الالكل. التوافقية أعاده التعبير عن هذه الوحدة من ثلاثه miRNAs بواسطة طريقه التجميع الموصوفة أدناه النتائج في التدخل العميق مع بيولوجيا الخلايا السرطانية ويمكن استخدامها بسهوله كاستراتيجية العلاج الجيني للدراسات قبل السريرية10. وقد يكون هذا البروتوكول ذا اهميه خاصه بالنسبة لأولئك المشاركين في بحوث ميرنا وتطبيقاتها الانتقالية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

الاهميه البيولوجية ميكرورناس (miRNAs) في مجال الصحة والمرض تعتمد بشكل كبير علي مجموعات محدده من العديد من المحررين في وقت واحد miRNAs بدلا من عمل ميرنا واحده. وصف هذه الوحدات miRNAs محدده خطوه أساسيه في تعظيم استخدامها في العلاج. وهذا أمر مهم للغاية لأنه يمكن استغلال سماتهم التوافقية عمليا. وصفت هنا هو طريقه لتحديد توقيع ميرنا محدده ذات الصلة للسيطرة علي المتحكمين الكروماتين في الورم الارومي. يعرف النهج أولا مجموعه عامه من miRNAs التي يتم تحريرها في الأورام بالمقارنة مع الانسجه العادية. ويتم صقل التحليل بشكل أكبر من خلال الظروف الثقافية التفاضلية ، مما يؤكد وجود مجموعه فرعيه من miRNAs التي يتم التعبير عنها بشكل متزامن اثناء الولايات الخلوية المحددة. وأخيرا ، فان miRNAs التي ترضي هذه المرشحات يتم دمجها في الجينات الاصطناعية متعددة الخلايا ، والتي تقوم علي سقالة من الجينات الموجودة بشكل طبيعي المجموعات ميرنا ، ثم تستخدم للتعبير المفرط من هذه الوحدات ميرنا في الخلية المتلقية.

سمحت هذه الطريقة توصيف وحده من ثلاثه miRNAs التي يتم تقليلها باستمرار في أورام المخ ، والتي يتم التعبير عنها بشكل خاص اثناء التمايز العصبية (الشكل 1) وتشارك في استجابه الورم البقاء علي قيد الحياة بعد العلاج (الشكل 2). ويتحقق ذلك من خلال تنظيم ال...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

وصف هنا هو بروتوكول لتوصيف وحدات miRNAs التازر بيولوجيا وتجميعها في الجينات القصيرة ، والذي يسمح التعبير الفوقي في وقت واحد لتطبيقات العلاج الجيني.

توصيف miRNAs المرتبطة وظيفيا في الورم الصفراوي وهندستها إلى مجموعات اصطناعية للعلاج الجيني

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

يسمح هذا البروتوكول بالتحوير المتزامن للعديد من الرنا الرنا في الخلايا الكئية ويستند إلى طريقة بسيطة ومرنة للغاية تقلل خطوات الاستنساخ الجزيئي. هذه التقنية لها آثار على دراسة التفاعلات الوظيفية الحمض النووي الريبي الصغرى في المختبر، ولكن الأهم من ذلك أنه يوفر منصة للاستخدام أكثر فعالية من الحمض النووي الريبي الصغير في العلاج. لقد طورنا بشكل رئيسي واستخدمناه في سياق سرطان الدماغ ، لكنه ينطبق على أي أمراض حيث تنطوي على تغييرات متعددة في التعبير الجيني.لقد اختبرنا جيناتنا المتحولة الاصطناعية في نماذج أخرى مثل خطوط سرطان الثدي والغدة الدرقية التي تظهر قابلية تكرار هذه التقنية. المعرفة الأساسية للمعلوماتية الحيوية وبيولوجيا الحمض النووي الريبي الصغير مفيدة لهذا البروتوكول ، ولكن ليس من الضروري. نهج المعلوماتية الحيوية مهم لتحديد تركيبات الحمض النووي الريبي الصغرى ذات الصلة و TRK-11، في حين أن الإلمام بمعالجة الحمض النووي الريبي الصغرى مهم بشكل كبير لفهم كيفية تجميع هذه الحمض النووي الصغير المختلفة في مجموعات الحمض النووي الاصطناعية التي يمكن معالجتها بنجاح مرة واحدة مستقرة إلى خلايا محددة.لطبق المعطف ، قم أولاً بحل بولي -D-ليسين في الماء بتركيز 100 ميكروغرام لكل ملليلتر. صب الحل في الطبق في كمية من ميليلتر واحد من الحل لكل 25 سم مربع سطح. دوامة الطبق للتأكد من تغطية الطبق كله.بعد ست ساعات التعرق حل بولي-D-ليسين وشطف مرتين مع برنامج تلفزيوني. الخلايا الجذعية العصبية العصبية في طبق من 100،000 خلية لكل خمسة ملليلتر من المتوسطة، إما في الخلايا الجذعية المتوسطة، التمايز الفلكي المتوسط أو وسط التمايز العصبي. بعد طلاء الخلايا، ضع الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد، ثم قم بإجراء تحليل تعبير الحمض النووي الريبي الجزئي وفقًا للمخطوطة.لثقافة GBM-34 الخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الدبقي، ابدأ بـ 10 مرات إلى الخلايا الخامسة وخمس ملليلتر من المتوسطة العصبية في قارورة مرفق منخفضة تبلغ 25 سنتيمترًا مربعًا. ضع القارورة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. بعد 48 ساعة من الطلاء، إضافة تركيزات مضاعفة من الحمض النووي alkylating عامل تيموزولوميد كل سبعة أيام.تبدأ مع إضافة خمسة TMZ micromolar تكملها في خمسة ملليلتر المتوسطة لمدة خمسة أيام. بعد خمسة أيام، وإزالة المتوسطة واستبدالها بوسيلة جديدة دون temozolomide للسماح للخلايا على قيد الحياة لاسترداد. بعد 48 ساعة، إضافة 10 ميكرومولار تيموزولوميد واحتضان لمدة خمسة أيام أخرى.كرر علاج تيموزولوميد المضاعفة حتى يتم الوصول إلى تركيز 100 ميكرومولار على الأقل وتصبح الخلايا مقاومة للدواء. بعد تحريض المقاومة ، تكمن الخلايا باستخدام 1 ملليلتر من كاشف Lysis. استخراج مجموع RNA وتحليل التعبير عن RNAs الصغيرة المحددة وفقا للمخطوطة.للحصول على الهدف المتوقع لكل RNA الصغرى التي تم تعريفها سابقا، واستخدام أدوات التنبؤ استهداف الحمض النووي الريبي الصغير. من الصفحة الأولى من TargetScan، حدد الحمض النووي الريبي الصغير من الفائدة من القائمة المنسدلة التي تم ملؤها مسبقًا. انقر فوق الزر إرسال.قم بتنزيل قائمة الأهداف الناتجة كجداول بيانات باستخدام رابط جدول التنزيل. لتقليل فرص التنبؤات الإيجابية الخاطئة، لا تشمل سوى الأهداف ضمن عمود المواقع المحفوظة وتحليل المصب. برامج تنبؤ RNA الصغرى إضافية الحصول على مزيد من الصرامة وتشمل فقط الأهداف التي هي مشتركة بين جميع الخوارزميات.ثم، افتح جناح ToppGene 20. لتقييم لإثراء المسارات المشتركة بين كل RNA الصغير، لصق قائمة الأهداف التي تم الحصول عليها في إطار مجموعات الجينات التدريب. انقر على رمز HGNC كنوع الدخول.انقر فوق إرسال وابدأ. يوفر البرنامج جدول إخراج يوضح أهم فئات GO لقائمة الجينات المدخلة. لتحديد مساهمة كل RNA الصغرى في تنظيم مسار مشترك أو عملية الخلوية، وفتح وظيفة مخطط فين المقدمة في المعلوماتية الحيوية والتطورية علم الجينوم الموقع.تحقق من كل هدف تم الحصول عليها مقابل القائمة الكاملة للجينات المشاركة في العملية الخلوية المحددة. إذا كان الهدف رسول RNAs لكل RNAs الصغيرة من الفائدة في النوافذ المعنية ، وتحميل نسخ لصق القائمة. اسم كل قائمة مع معرف فريد.انقر فوق إرسال. يوفر البرنامج مخرجات مرئية من مخطط فين مع عدد من الجينات في كل قطاع بالإضافة إلى قائمة كاملة من RNAs رسول لكل مجموعة فرعية وتقاطع مجموعات. لتجميع الـ RNAs الصغير المختار في جينة وظيفية عبر، الحصول على سقالة محورة وراثيا على أساس موضع الكتلة miR-17-92.الحصول على تسلسل النوكليوتيدات من متصفح الجينوم الفرقة. حدد ما يقرب من 800 قاعدة الزوج تسلسل الأساسية التي تشمل جميع دبابيس الشعر RNA RNA الصغيرة المشفرة الستة من موضع وما لا يقل عن 200 نوكليوتيد يحيط تسلسل كلا من المنبع والمصب من تسلسل الأساسية. قم بلصق التسلسل في أي برنامج لتحرير الكلمات.تحديد تسلسل كل واحد من دبابيس الشعر الأصلية الستة من خلال استرجاعها في قاعدة miR. وضع علامة على كل واحد من هذه التسلسلات ضمن نطاق تسلسل أساسي تم تحديده مسبقًا. أي تسلسل بين كل دبوس الشعر تمثل تسلسلات الفواصل.بعد ذلك ، الحصول على تسلسل دبوس الشعر من الحمض النووي الرنا الصغيرة التي تهدف إلى أن تكون أكثر من التعبير عنها في الجينات عبر من قاعدة miR. لاحظ بعناية النوكليوتيدات المحددة التي هي في مواقع شق المعالج الصغير. حذف تسلسل دبوس الشعر الأصلي من تسلسل الأساسية باستثناء ثلاثة إلى خمسة النيوكليوتيدات في كل من الخمسة وينتهيك من كل دبوس الشعر الذي سيكون بمثابة مقبول لدبابيس الشعر الجديدة.لصق تسلسل دبوس الشعر من RNAs الصغيرة المطلوبة لتحل محل دبابيس الشعر المحذوفة سابقا. إضافة تسلسلات تقييد المطلوب في كلا المناطق المرافقة للجين عبر لتسهيل دون الاستنساخ في ناقلات التسليم من اختيار. تحقق من أن تسلسلات التقييد المختارة غير موجودة داخل التسلسل نفسه.للتحقق من بنية ثنائي الأبعاد من الجين المتحول، نسخ تسلسل كامل المعدلة وراثيا في برنامج التنبؤ بنية RNA برنامج RNA Webfold. حدد إعدادات البرنامج القياسية وانقر فوق المتابعة. تحليل الناتج الرسومية، وخاصة لوجود دبابيس الشعر محددة جيدا في وجود هياكل الجذعية التي تقطعت بها السبل مزدوجة التي لا تقل عن 11 نواة قريبة إلى موقع شق المعالج الصغير.أيضا، ابحث عن عدم وجود نقاط التفريع داخل تسلسل دبوس الشعر. عند هذه النقطة، الجين المتحول هو على استعداد لإنتاجها عن طريق تخليق الجينات ومستنسخة في ناقلات التسليم المطلوبة. سمحت هذه الطريقة توصيف وحدة من ثلاثة RNAs الصغيرة التي يتم باستمرار إلى أسفل ينظم في أورام الدماغ, التي هي شارك في التعبير عنها على وجه التحديد خلال التمايز العصبي.وقد تأكدت أنماط التعبير المشترك لوحدات الحمض النووي الريبي الجزئي أثناء الإجهاد السمية الجينية، واقترحت وجود نشاط تآزري قوي بين هذه الرنا الثلاثة الصغيرة. يمكن للجين المتحول المصمم أن يلخي في وقت واحد التعبير عن الرنا الصغير الثلاثة في خلايا الورم الأرومي الدبقي ، سواء في المختبر أو في الجسم الحي ، مع تدخل كبير في بيولوجيا الورم وقابلية قابلية الترجمة الواعدة للتطبيق. بالإضافة إلى ذلك، كان التجمع المعدل وراثيا وظيفية أيضا في نموذج سرطان الثدي.المتطلبات الحاسمة لهذا البروتوكول هي الحفاظ على الحجم الأصلي للشق المعالج في الجينات المتحولة. وتأكد من أن هيكل حلقة الجذعية من دبابيس الشعر RNA micro chimeric يتم الحفاظ عليها. مع هذه الطريقة، يمكننا تركيز جينات الحمض النووي الريبي الصغيرة متعددة نشطة بيولوجيا في تسلسلات الحمض النووي قصيرة جدا والتي يمكن حرفيا أن تكون تركيبها في vitroly أي ناقلات التسليم لاستخدام العلاج الجيني.هذه الطريقة مثالية لدراسة التفاعل الوظيفي بين مختلف الحمض الرنا الصغير والتدخل في مسارات خلوية متعددة العوامل المعقدة التي تتطلب خلاف ذلك تركيبات متعددة من الأدوية.

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

الاعتداء على أساس البيوتين المنسدلة للتحقق من صحة مرناً ميرناس "الأهداف الخلوية"

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

إعداد وتعديل الجينات الرئيسيات نونومان الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...