Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier les membres du Laboratoire de neuro-oncologie Harvey Cushing pour leur soutien et leurs critiques constructives. Ce travail a été soutenu par les subventions NINDS K12NS80223 et K08NS101091 à P. P.

1. Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le glioblastome
<ol><li>Analyse de l'expression de miRNA différentiel large dans le glioblastoma contre le cerveau
	<ol>
<li>Tout d'abord, déterminer les miARN les plus significativement déréglementés dans la tumeur. Cela peut être réalisé en utilisant au moins trois méthodes différentes:<ol>
<li>Mine the Cancer Genome Atlas, trouvé à https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, pour le s?...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

Ce protocole est basé sur l'idée que plutôt que de fonctionner isolément, les miARN sont biologiquement pertinents en travaillant en groupes, et ces groupes sont transcriptionnellement déterminés par des contextes cellulaires spécifiques26. Pour justifier cette approche d'un point de vue translationnel, un protocole de suivi qui permet de recréper ce modèle multi-miRNA dans les cellules/tissus est introduit. Ceci est possible en profitant de la biogenèse relativement simple des miRNAs, p...

miRNAs offrent une occasion inégalée pour le développement d'une approche de thérapie génique large à de nombreuses maladies1,2,3, y compris le cancer4,5. Ceci est basé sur plusieurs caractéristiques uniques de ces molécules biologiques, y compris leur petite taille6, biogenèse simple7, et la tendance naturelle à fonctionner en association8. Beaucoup de maladies sont caractérisées par des modèles spécifiques d'expression miRNA, qui convergent souvent vers la régulation des fonctions biologiques complexes9. Le but de cette méthode est d'abord de définir une stratégie pour identifier les groupes de miARN qui sont synergiquement pertinents pour des fonctions cellulaires spécifiques. Par conséquent, il fournit une stratégie pour le rétablissement de ces combinaisons miRNA dans les études et les applications en aval.
Cette méthode permet l'analyse fonctionnelle de plusieurs miARN à la fois, en s'appuyant sur leur ciblage simultané d'un grand nombre de MARN, récapitulant ainsi les paysages complexes des maladies. Cette approche a été récemment employée pour définir un groupe de trois miRNAs que 1) sont simultanément downregulated dans le cancer du cerveau et 2) montrent un modèle fort de co-expression pendant la différenciation neurale aussi bien qu'en réponse au stress génotoxique par rayonnement ou un Agent alkylating d'ADN. La réexpression combinatoire de ce module de trois miARN par la méthode de regroupement décrite ci-dessous entraîne une interférence profonde avec la biologie des cellules cancéreuses et peut être facilement utilisée comme stratégie de thérapie génique pour les études précliniques10. Ce protocole peut être particulièrement intéressant pour ceux qui participent à la recherche miRNA et à ses applications translationnelles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

La pertinence biologique des microARN (miARN) dans la santé et la maladie repose de manière significative sur des combinaisons spécifiques de nombreux miARN simultanément déréglementés plutôt que l'action d'un seul miRNA. La caractérisation de ces modules miRNAs spécifiques est une étape fondamentale dans la maximisation de leur utilisation en thérapie. Ceci est extrêmement pertinent parce que leurs attributs combinatoires peuvent être pratiquement exploités. Décrit ici est une méthode pour définir une signature spécifique de miRNA pertinente au contrôle des répresseurs oncogènes de chromatine dans le glioblastoma. L'approche définit d'abord un groupe général de miARN qui sont déréglementés dans les tumeurs par rapport au tissu normal. L'analyse est encore affinée par des conditions de culture différentielles, soulignant un sous-groupe de miARN qui sont co-exprimés simultanément au cours d'états cellulaires spécifiques. Enfin, les miARN qui satisfont ces filtres sont combinés en un transgène polycistronique artificiel, qui est basé sur un échafaudage de gènes de grappes de miARN naturellement existants, puis utilisés pour la surexpression de ces modules miRNA dans les cellules réceptrices.

Cette méthode a permis la caractérisation d'un module de trois miRNAs qui sont uniformément downregulated dans les tumeurs cérébrales, qui sont co-exprimées spécifiquement pendant la différenciation neuronale (figure 1) et impliquées dans la réponse de survie de tumeur après thérapie (Figure 2). Ceci est accompli en régulant une voie répressive oncogène complexe de chromatine. Ce modèle de coexpression suggérait ...

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Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

Décrit ici est un protocole pour caractériser des modules des miRNAs biologiquement synergiques et de leur assemblage en transgènes courts, qui permet la surexpression simultanée pour des applications de thérapie génique.

Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Ce protocole permet la modulation simultanée de nombreux ARN micro dans les cellules eucaryotes et est basé sur une méthode très simple et flexible qui minimise les étapes de clonage moléculaire. Cette technique a des implications pour l’étude des interactions fonctionnelles de micro ARN in vitro, mais plus important encore, elle fournit une plate-forme pour une utilisation plus efficace des ARN micro en thérapie. Nous l’avons principalement développé et utilisé dans le contexte du cancer du cerveau, mais il s’applique à toutes les maladies où de multiples altérations de l’expression des gènes sont impliquées.Nous avons testé nos gènes trans artificiels dans d’autres modèles tels que les lignées de cancer du sein et de la thyroïde montrant la reproductibilité de cette technique. Les connaissances de base en bioinformatique et en biologie micro ARN sont utiles pour ce protocole, mais pas indispensables. Une approche bioinformatique est importante pour définir les combinaisons pertinentes de micro ARN et le TRK-11, tandis que la familiarité avec le traitement de micro ARN de façon mesurable est importante pour comprendre comment ces différents micro ARN peuvent être assemblés en grappes artificielles d’ADN qui peuvent être traitées avec succès une fois stables aux cellules spécifiques.Pour enrober le plat, dissoudre d’abord la poly-D-lysine dans l’eau à une concentration de 100 microgrammes par millilitre. Verser la solution dans le plat à la quantité d’un millilitre de solution par surface de 25 centimètres carrés. Faites tourbillonner le plat pour vous assurer de la couverture de l’ensemble du plat.Après six heures aspirer la solution poly-D-lysine et rincer deux fois avec PBS. Plaques de cellules souches neurales humaines dans la quantité de 100 000 cellules par cinq millilitres du milieu, soit dans le milieu des cellules souches, milieu de différenciation astrocytique ou milieu de différenciation neuronale. Après le placage cellulaire, placez le plat dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant une semaine et procéder à l’analyse de l’expression micro ARN selon le manuscrit.Pour la culture gbm-34 glioblastoma cellules souches comme, commencer par une fois dix à la cinquième cellule et cinq millilitres de milieu neurobasal dans un flacon de fixation de 25 centimètres carrés bas. Placez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. 48 heures après le placage, ajouter des concentrations de doublement de l’adn alkylating agent temozolomide tous les sept jours.Commencez par l’ajout de cinq micromolaires TMZ complétés en cinq millilitres moyens pendant cinq jours. Après cinq jours, retirer le milieu et remplacer par un milieu frais sans témozolomide pour permettre aux cellules survivantes de récupérer. Après 48 heures, ajouter 10 temozolomide micromolaire et incuber pendant encore cinq jours.Répétez le traitement par témozolomide jusqu’à ce que la concentration d’au moins 100 micromolaires soit atteinte et que les cellules deviennent résistantes au médicament. Après l’induction de la résistance, les cellules se trouvent à l’aide de 1 millilitre de réageni de lyse. Extraire l’ARN total et analyser l’expression des micro ARN spécifiques selon le manuscrit.Pour obtenir le targetome prévu de chaque micro ARN précédemment défini, utilisez des outils de prévision de ciblage micro ARN. À partir de la première page de TargetScan, sélectionnez le micro ARN d’intérêt dans le menu décrocheurs pré-rempli. Cliquez sur le bouton soumettre.Téléchargez la liste des cibles qui en résulte en tant que feuille de calcul à l’aide du lien de table de téléchargement. Pour réduire les risques de prédictions faussement positives, n’incluez que les cibles dans la colonne des sites conservés et l’analyse en aval. D’autres programmes de prédiction de micro ARN obtiennent une plus grande rigueur et n’incluent que des cibles communes à tous les algorithmes.Ensuite, ouvrez la suite ToppGene 20. Pour évaluer l’enrichissement des voies communes à chaque micro ARN, coller la liste des cibles obtenues dans la fenêtre des ensembles de gènes d’entraînement. Cliquez sur HGNC Symbol comme type d’entrée.Cliquez sur soumettre et commencer. Le programme fournit un tableau de sortie montrant les catégories GO les plus importantes pour la liste des gènes entrés. Pour enfin établir la contribution de chaque micro ARN à la régulation d’une voie commune ou d’un processus cellulaire, ouvrez la fonction de diagramme de venn fournie dans le site Web bioinformatique et génomique évolutionnaire.Vérifiez chaque targetome obtenu par rapport à la liste complète des gènes impliqués dans le processus cellulaire spécifique. Si les ARN messagers cibles pour chaque micro ARN d’intérêt se trouvent dans les fenêtres respectives, téléchargez la liste. Nommez chaque liste avec un identificateur unique.Cliquez sur soumettre. Le programme fournit une sortie visuelle d’un diagramme de venn avec un nombre de gènes dans chaque secteur ainsi qu’une liste complète des ARN messagers pour chaque sous-ensemble et combinaisons d’intersections. Pour regrouper les micro ARN sélectionnés en un gène trans fonctionnel, obtenir un échafaudage transgénique basé sur le locus miR-17-92.Obtenez la séquence nucléotide à partir du navigateur du génome ensembleé. Sélectionnez la séquence centrale d’environ 800 paires de base englobant les six épingles à cheveux micro ARN codées du locus et au moins 200 séquences de flanc de nucléotide en amont et en aval de la séquence centrale. Coller la séquence dans n’importe quel programme d’édition de mots.Définissez la séquence de chacune des six épingles à cheveux indigènes en les récupérant dans la base miR. Marquez chacune de ces séquences dans le cadre d’une séquence de base précédemment identifiée. Toutes les séquences entre chaque épingle à cheveux représentent des séquences d’espaceurs.Ensuite, obtenez les séquences d’épingle à cheveux de micro ARN destinés à être surex exprimés dans le gène trans à partir de la base miR. Notez soigneusement les nucléotides spécifiques qui se trouvent sur les sites de clivage micro processeur. Supprimer les séquences d’épingle à cheveux indigènes de la séquence centrale à l’exception de trois à cinq nucléotides aux extrémités cinq et vous de chaque épingle à cheveux qui servira d’accepteur pour les nouvelles épingles à cheveux.Coller les séquences en épingle à cheveux des micro ARN désirés pour remplacer les épingles à cheveux précédemment supprimées. Ajoutez les séquences de restriction souhaitées aux deux régions flanquées du gène trans pour faciliter le sous-clonage dans les vecteurs de livraison de choix. Vérifiez que les séquences de restriction choisies ne sont pas présentes dans la séquence elle-même.Pour vérifier la structure bidimensionnelle du gène trans, copiez la séquence transgénique complète dans le logiciel de prédiction de la structure de l’ARN RNA Webfold. Sélectionnez les paramètres standard du programme et cliquez sur procéder. Analyser la sortie graphique, en particulier pour la présence d’épingles à cheveux bien définies en présence de structures de tige à double brin qui sont au moins 11 nucléotides proximaux au site de clivage micro processeur.Aussi, recherchez l’absence de points de ramification dans les séquences d’épingle à cheveux. À ce stade, le gène trans est prêt à être produit par synthèse génétique et cloné dans les vecteurs de livraison souhaités. Cette méthode a permis la caractérisation d’un module de trois micro ARN qui sont constamment vers le bas réglés dans les tumeurs cérébrales, qui sont co-exprimés spécifiquement pendant la différenciation neuronale.Des modèles de co-expression des modules de micro ARN pendant le stress génotoxique ont été confirmés et ont suggéré une activité synergique forte parmi ces trois ARN micro. Le gène trans conçu pourrait simultanément récapituler l’expression des trois micro ARN dans les cellules de glioblastoma, in vitro et in vivo, avec l’interférence significative dans la biologie de tumeur et l’applicabilité translationnelle prometteuse. En outre, le faisceau transgénique était également fonctionnel dans un modèle de cancer du sein.Les exigences cruciales de ce protocole sont le maintien de la taille originale du clivage du processeur dans le gène trans. Et assurez-vous que la structure en boucle de tige des épingles à cheveux chimériques micro ARN est préservée. Avec cette méthode, nous pouvons concentrer plusieurs gènes micro ARN biologiquement actifs en séquences d’ADN très courtes qui peuvent littéralement être insérées dans n’importe quel vecteur de livraison pour une utilisation génique.Cette méthode est idéale pour étudier l’interaction fonctionnelle entre les différents micro ARN et pour interférer avec les voies cellulaires multifactorielles complexes qui nécessiteront autrement de multiples combinaisons de médicaments.

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Perturbations de circulation miARN dans le syndrome du côlon irritable détectée en utilisant un multiplexée à haut débit Gene Expression Plate-forme

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Recherche

Génétique

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l&#39;épissage alternatif dans les cellules humaines

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

L&#39;élevage et d&#39;ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Production et Purification de Baculovirus pour l’Application de la thérapie génique

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...