Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei den Mitgliedern des Harvey Cushing Neuro Oncology Laboratory für die Unterstützung und konstruktive Kritik. Diese Arbeit wurde durch die NINDS-Zuschüsse K12NS80223 und K08NS101091 an P. P. unterstützt.

1. Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs bei Glioblastom
<ol><li>Analyse der breiten differentialen miRNA-Expression bei Glioblastom vs. Gehirn
	<ol>
<li>Bestimmen Sie zunächst die am deutlichsten deregulierten miRNAs im Tumor. Dies kann mit mindestens drei verschiedenen Methoden erreicht werden:<ol>
<li>Mine the Cancer Genome Atlas, gefunden in https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, zur Sequenzierung von Daten11.</li...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

Dieses Protokoll basiert auf der Vorstellung, dass miRNAs, anstatt isoliert zu funktionieren, biologisch relevant sind, indem sie in Gruppen arbeiten, und diese Gruppen werden transkriptionsweise durch spezifische zelluläre Kontexte bestimmt26. Um diesen Ansatz aus einer translationalen Perspektive zu rechtfertigen, wird ein Follow-up-Protokoll eingeführt, das die Nachbildung dieses Multi-miRNA-Musters in Zellen/Geweben ermöglicht. Dies ist möglich durch die relativ einfache Biogenese von miRN...

miRNAs bieten eine unübertroffene Möglichkeit für die Entwicklung eines breiten Gentherapie-Ansatzes für viele Krankheiten1,2,3, einschließlich Krebs4,5. Dies basiert auf mehreren einzigartigen Merkmalen dieser biologischen Moleküle, einschließlich ihrer kleinen Größe6, einfache Biogenese7, und natürliche Tendenz, in Assoziation zu funktionieren8. Viele Krankheiten sind durch spezifische miRNA-Expressionsmuster gekennzeichnet, die oft auf die Regulierung komplexer biologischer Funktionen konvergieren9. Der Zweck dieser Methode ist zunächst eine Strategie zu definieren, um Gruppen von miRNAs zu identifizieren, die synergistisch relevant für bestimmte zelluläre Funktionen sind. Folglich bietet sie eine Strategie für die Wiederherstellung solcher miRNA-Kombinationen in nachgelagerten Studien und Anwendungen.
Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse mehrerer miRNAs auf einmal, indem sie ihre gleichzeitige Ausrichtung auf eine große Anzahl von mRNAs nutzt und so die komplexen Landschaften von Krankheiten rekapituliert. Dieser Ansatz wurde vor kurzem verwendet, um eine Gruppe von drei miRNAs zu definieren, die 1) gleichzeitig bei Hirntumor enregulierung sind und 2) ein starkes Ko-Expressionsmuster während der neuronalen Differenzierung sowie als Reaktion auf genotoxischen Stress durch Strahlung oder DNA-Alkylierungsmittel. Die kombinatorische Reexpression dieses Moduls von drei miRNAs durch die unten beschriebene Clustering-Methode führt zu tiefgreifenden Eingriffen in die Biologie von Krebszellen und kann leicht als Gentherapiestrategie für präklinische Studien verwendet werden10. Dieses Protokoll kann für diejenigen von besonderem Interesse sein, die an der miRNA-Forschung und ihren translationalen Anwendungen beteiligt sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

Die biologische Relevanz von microRNAs (miRNAs) in Gesundheit und Krankheit hängt signifikant von spezifischen Kombinationen vieler gleichzeitig deregulierter miRNAs ab und nicht von der Wirkung einer einzelnen miRNA. Die Charakterisierung dieser spezifischen miRNAs-Module ist ein grundlegender Schritt zur Maximierung ihrer Anwendung in der Therapie. Dies ist äußerst relevant, da ihre kombinatorischen Eigenschaften praktisch ausgenutzt werden können. Hier wird eine Methode beschrieben, um eine spezifische miRNA-Signatur zu definieren, die für die Kontrolle von onkogenen Chromatin-Repressoren bei Glioblastom relevant ist. Der Ansatz definiert zunächst eine allgemeine Gruppe von miRNAs, die bei Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe dereguliert werden. Die Analyse wird durch differenzielle Kulturbedingungen weiter verfeinert, was eine Untergruppe von miRNAs unterstreicht, die gleichzeitig während bestimmter Zellzustände mitexprimiert werden. Schließlich werden die miRNAs, die diese Filter zufriedenstellen, zu einem künstlichen polycistronischen Transgenes kombiniert, das auf einem Gerüst natürlich vorhandener miRNA-Clustergene basiert und dann zur Überexpression dieser miRNA-Module in empfangende Zellen verwendet wird.

Diese Methode ermöglichte die Charakterisierung eines Moduls von drei miRNAs, die bei Hirntumoren konsequent downreguliert werden, die speziell während der neuronalen Differenzierung koexprimiert werden (Abbildung 1) und an der Tumorüberlebensreaktion nach Therapie (Abbildung 2). Dies wird durch die Regulierung eines komplexen onkogenen Chromatin-Repressionswegs erreicht. Dieses Co-Expressions-Muster deutete auf eine starke sy...

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Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

Hier wird ein Protokoll zur Charakterisierung von Modulen biologisch synergistischer miRNAs und deren Montage in kurze Transgene beschrieben, das eine gleichzeitige Überexpression für Gentherapieanwendungen ermöglicht.

Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Modulation vieler Mikro-RNAs in eukaryotischen Zellen und basiert auf einer sehr einfachen und flexiblen Methode, die molekulare Klonschritte minimiert. Diese Technik hat Auswirkungen auf die Untersuchung von Mikro-RNA-Funktionsinteraktionen in vitro, aber noch wichtiger ist, dass sie eine Plattform für einen effektiveren Einsatz von Mikro-RNAs in der Therapie bietet. Wir haben es hauptsächlich im Zusammenhang mit Hirntumor entwickelt und verwendet, aber es gilt für alle Krankheiten, bei denen mehrere Veränderungen der Genexpression beteiligt sind.Wir haben unsere künstlichen Transgene in anderen Modellen wie Brust- und Schilddrüsenkrebslinien getestet, die die Reproduzierbarkeit dieser Technik zeigen. Grundkenntnisse der Bioinformatik und Mikro-RNA-Biologie sind für dieses Protokoll hilfreich, aber nicht unentbehrlich. Ein bioinformatischer Ansatz ist wichtig, um relevante Mikro-RNA-Kombinationen und die TRK-11 zu definieren, während die Vertrautheit mit der Mikro-RNA-Verarbeitung messbar wichtig ist, um zu verstehen, wie diese verschiedenen Mikro-RNAs zu künstlichen DNA-Clustern zusammengesetzt werden können, die erfolgreich verarbeitet werden können, sobald sie stabil zu den spezifischen Zellen sind.Um die Schale zu beschichten, lösen Sie zunächst Poly-D-Lysin in Wasser in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter auf. Gießen Sie die Lösung in der Menge von einem Milliliter Lösung pro 25 Quadratzentimeter Oberfläche. Wirbeln Sie das Gericht, um sicherzustellen, dass die Abdeckung des gesamten Gerichts.Nach sechs Stunden die Poly-D-Lysin-Lösung ansaugen und zweimal mit PBS abspülen. Platte menschliche neuronale Stammzellen in der Menge von 100. 000 Zellen pro fünf Milliliter des Mediums, entweder in Stammzellmedium, astrozytische Differenzierung Medium oder neuronale Differenzierung simon. Legen Sie die Schale nach der Zellbeschichtung eine Woche lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid und führen Sie eine Mikro-RNA-Expressionsanalyse gemäß dem Manuskript durch.Um GBM-34 Glioblastom-Stammzellen zu kulturieren, beginnen Sie mit einem mal zehn bis fünf Meter fünften Zellen und fünf Millilitern neurobasalen Mediums in einem 25 Quadratzentimeter niedrigen Befestigungskolben. Legen Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in einen Brutkasten. 48 Stunden nach der Beschichtung, fügen Sie doppelliche Konzentrationen von DNA-Alkylierungsmittel Temozolomid alle sieben Tage.Beginnen Sie mit der Zugabe von fünf Mikromolaren TMZ in fünf Milliliter Medium für fünf Tage ergänzt. Nach fünf Tagen, entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie mit frischem Medium ohne Temozolomid, damit sich die überlebenden Zellen erholen können. Nach 48 Stunden 10 mikromolares Temozolomid hinzufügen und weitere fünf Tage brüten.Wiederholen Sie die Verdoppelung der Temozolomid-Behandlung, bis eine Konzentration von mindestens 100 Mikromolaren erreicht ist und die Zellen gegen das Medikament resistent werden. Nach der Induktion des Widerstands liegen Zellen mit 1 Milliliter Lysis-Reagenz. Extrahieren Sie die gesamte RNA und analysieren Sie die Expression der spezifischen Mikro-RNAs gemäß dem Manuskript.Um das vorhergesagte Targetome jeder zuvor definierten Mikro-RNA zu erhalten, verwenden Sie Mikro-RNA-Targeting-Vorhersagewerkzeuge. Wählen Sie auf der Titelseite von TargetScan die micro-RNA aus dem vorab ausgefüllten Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Absenden".Laden Sie die resultierende Liste der Ziele als Tabellenkalkulation über den Link zum Herunterladen der Tabelle herunter. Um die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Vorhersagen zu verringern, schließen Sie nur Ziele innerhalb der Spalte "Konservierte Standorte" und die nachgelagerte Analyse ein. Zusätzliche Mikro-RNA-Vorhersageprogramme erhalten eine weitere Stringenz und enthalten nur Ziele, die allen Algorithmen gemeinsam sind.Öffnen Sie dann die ToppGene Suite 20. Um die Anreicherung von Signalwegen zu bewerten, die jeder Mikro-RNA gemeinsam sind, fügen Sie die Liste der Ziele ein, die im Fenster der Trainingsgensätze erhalten wurden. Klicken Sie auf HGNC-Symbol als Eintragstyp.Klicken Sie auf Senden und starten Sie. Das Programm stellt eine Ausgabetabelle mit den wichtigsten GO-Kategorien für die eingegebene Liste der Gene bereit. Um schließlich den Beitrag jeder Mikro-RNA zur Regulierung eines gemeinsamen Signalwegs oder zellulären Prozesses zu ermitteln, öffnen Sie die Venn-Diagramm-Funktion, die auf der Website bioinformatics and Evolutionary Genomics bereitgestellt wird.Überprüfen Sie jedes erhaltene Targetome mit der vollständigen Liste der Gene, die am spezifischen zellulären Prozess beteiligt sind. Wenn sich Ziel-Messenger-RNAs für jeden Micro-RNAs von Interesse in den jeweiligen Fenstern befinden, laden Sie die Liste zum Kopieren und Einfügen ein. Benennen Sie jede Liste mit einem eindeutigen Bezeichner.Klicken Sie auf Absenden. Das Programm bietet eine visuelle Ausgabe eines Venn-Diagramms mit Zahlen von Genen in jedem Sektor sowie eine vollständige Liste der Messenger-RNAs für jede Teilmenge und Schnittpunktkombinationen. Um die ausgewählten Mikro-RNAs in ein funktionelles Transgen zu gruppieren, erhalten Sie ein transgenes Gerüst auf Basis des miR-17-92-Cluster-Lokus.Erhalten Sie die Nukleotidsequenz aus dem ensembleierten Genombrowser. Wählen Sie die ca. 800 Basispaar-Kernsequenz aus, die alle sechs kodierten Mikro-RNA-Haarnadeln des Locus und mindestens 200 Nukleotid-Flankensequenzen vor und nach der Kernsequenz umfasst. Fügen Sie die Sequenz in ein beliebiges Wortbearbeitungsprogramm ein.Definieren Sie die Reihenfolge jedes der sechs nativen Haarnadeln, indem Sie sie in miR-Basis abrufen. Markieren Sie jede dieser Sequenzen innerhalb der Spanne der zuvor identifizierten Kernsequenz. Alle Sequenzen zwischen den einzelnen Haarnadeln stellen Abstandssequenzen dar.Als nächstes erhalten Sie die Haarnadelsequenzen von Mikro-RNAs, die im Transgen von der miR-Basis überexprimiert werden sollen. Beachten Sie sorgfältig die spezifischen Nukleotide, die sich an den Standorten der Mikroprozessorspaltung befinden. Löschen Sie die nativen Haarnadelsequenzen aus der Kernsequenz mit Ausnahme von drei bis fünf Nukleotiden an den fünf und sieden Enden jeder Haarnadel, die als Akzeptor für die neuen Haarnadeln dienen.Fügen Sie die Haarnadelsequenzen der gewünschten Micro-RNAs ein, um die zuvor gelöschten Haarnadeln zu ersetzen. Fügen Sie gewünschte Restriktionssequenzen an beiden flankierenden Bereichen des Transgens hinzu, um das Subklonen in Dietionsvektoren ihrer Wahl zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Einschränkungssequenzen nicht innerhalb der Sequenz selbst vorhanden sind.Um die zweidimensionale Struktur des Transgens zu verifizieren, kopieren Sie die vollständige transgene Sequenz in das RNA-Strukturvorhersageprogramm RNA Webfold. Wählen Sie die Standardprogrammeinstellungen aus, und klicken Sie auf Fortfahren. Analysieren Sie die grafische Ausgabe, insbesondere für das Vorhandensein von gut definierten Haarnadeln in Gegenwart von doppelsträngigen Stammstrukturen, die mindestens 11 Nukleotide proximal zur Mikroprozessorspaltungsstelle sind.Achten Sie auch auf das Fehlen von Verzweigungspunkten innerhalb der Haarnadelsequenzen. An dieser Stelle ist das Transgen bereit, durch Gensynthese produziert und in die gewünschten Liefervektoren geklont zu werden. Diese Methode ermöglichte die Charakterisierung eines Moduls von drei Mikro-RNAs, die konsequent nach unten in Hirntumoren reguliert sind, die speziell während der neuronalen Differenzierung koexprimiert werden.Co-Expressionsmuster von Mikro-RNA-Modulen während genotoxischer Belastung wurden bestätigt und deuteten auf eine starke synergistische Aktivität unter diesen drei Mikro-RNAs hin. Das entwickelte Transgen könnte gleichzeitig die Expression der drei Mikro-RNAs in Glioblastomzellen rekapitulieren, sowohl in vitro als auch in vivo, mit erheblichen Eingriffen in die Tumorbiologie und vielversprechender translationaler Anwendbarkeit. Darüber hinaus war der transgene Cluster auch in einem Brustkrebsmodell funktionsfähig.Die entscheidenden Anforderungen dieses Protokolls sind die Beibehaltung der ursprünglichen Größe der Prozessorspaltung im Transgen. Und stellen Sie sicher, dass die Stammschleifenstruktur von chimer Mikro-RNA-Haarnadeln erhalten bleibt. Mit dieser Methode können wir mehrere biologisch aktive Mikro-RNA-Gene in sehr kurze DNA-Sequenzen konzentrieren, die buchstäblich vitro in alle Liefervektoren für die Gentherapie eingesteckt werden können.Diese Methode ist ideal, um die funktionelle Wechselwirkung zwischen verschiedenen Mikro-RNAs zu untersuchen und komplexe multifaktorielle zelluläre Bahnen zu stören, die sonst mehrere Wirkstoffkombinationen erfordern.

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Forschung

Genetik

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...